亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用

渠宏雁,李學鵬,*,儀淑敏,白鳳翎,張德福,李 春,李婷婷,勵建榮,*

(1.渤海大學 食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;2.渤海大學 數理學院,遼寧錦州 121013;3.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600)

亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用

渠宏雁1,李學鵬1,*,儀淑敏1,白鳳翎1,張德福1,李 春2,李婷婷3,勵建榮1,*

(1.渤海大學 食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;2.渤海大學 數理學院,遼寧錦州 121013;3.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600)

本文以金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌為研究對象,采用微孔板檢測法,分別以OD630值與生物被膜清除率反映兩種菌的生物被膜生成量及不同培養時間添加不同濃度亞硝酸鈉對兩種菌形成生物被膜的抑制效果,并通過細胞表面反應和細胞間聚集實驗初步研究其抑制機理。結果表明:亞硝酸鈉對兩種致病菌生物被膜的形成均有一定的抑制作用,600 mg/L、培養48 h對金黃色葡萄球菌生物被膜清除率達37.31%,抑制效果最佳;而對副溶血性弧菌而言,添加200 mg/L亞硝酸鈉培養12 h時清除率達36.67%,效果最佳。由細胞表面反應與細胞間聚集實驗結果表明,亞硝酸鈉能有效抑制兩種菌的表面粘附和菌體聚集,其主要通過影響細胞聚合與表面粘附,從而抑制金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的形成與生長。

生物被膜,金黃色葡萄球菌,副溶血性弧菌,亞硝酸鈉,抑制作用

細菌生物被膜(Bacterial biofilm,BF)是指附著于接觸物表面、被蛋白和多糖等細菌胞外大分子包裹的多細胞群體結構,是許多微生物在惡劣環境中采取的生存策略[1-5]。越來越多的研究表明,細菌生物被膜粘附在食品加工設備上難以清除,是導致食品加工環境中難以實現完全無菌化加工,引發食品安全隱患的主要原因[6-9]。

表1 麥氏比濁管的配比

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)和副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus,VP)是食品中常見的食源性致病微生物,威脅人類健康。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌,具有強大的生物被膜形成能力[10-12]。副溶血性弧菌屬革蘭氏陰性嗜鹽海洋細菌[13],具有形成生物被膜的能力[7]。

近年來,國內外已有諸多學者致力于抑制生物被膜形成的相關研究。Chauhan等[14]發現EDTA和慶大霉素混合物抑制了與導管有關的多種致病菌生物被膜的形成。馬有智等[15]探究了銅離子對嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響,發現銅離子能使嗜水氣單胞菌生物被膜的形成與毒力效果減弱。亞硝酸鈉在肉類制品加工中用作護色劑和防腐劑,在腌臘肉制品、醬鹵肉制品、西式火腿類、油炸肉類等多種肉制品中最大使用量為0.15 g/kg[16],在此范圍內使用不存在食品安全問題。目前,亞硝酸鈉對致病菌生物被膜形成的影響未見報道。本文采用微孔板法研究不同濃度亞硝酸鈉對不同培養時間的金黃色葡萄球菌與副溶血性弧菌生物被膜形成的影響。通過試管法與置片法研究亞硝酸鈉對兩種菌細胞間相互作用與細胞表面反應的影響,旨在探討亞硝酸鈉對生物被膜的抑制機制,為致病菌生物被膜的控制提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538),副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus,ATCC17802) 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth,TSB),3%氯化鈉堿性蛋白胨水(3% Sodium Chloride Alkaline Peptone Water,APW) 北京奧博星生物技術有限責任公司；結晶紫、冰醋酸、亞硝酸鈉、甲醇等所用試劑均為分析純。

BCM-1000A型生物潔凈工作臺 蘇州凈化過濾設備有限公司;SC-303型電子管電熱恒溫培養箱 浙江省嘉興縣新騰電器廠;SLJ-I型中型電動離心機 沈陽市紅星五金電器廠;DG5031型酶標儀 華東電子集團醫療裝備有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 增菌培養 將活化的金黃色葡萄球菌菌種接種于TSB液體培養基中,37 ℃孵育24 h;副溶血性弧菌菌種接種于APW液體培養基中,28 ℃培養24 h;低溫高速離心(10000 r/min,10 min,4 ℃)。棄去上清液,收集菌體,根據麥氏比濁用無菌生理鹽水配制菌液濃度為6×108/mL的溶液保存于4 ℃冰箱中,備用,麥氏比濁管[17]是McFarland發明的一種用于微生物比濁的標準濁度管,具體配比見表1。

1.2.2 生物被膜的制備及抑制作用實驗 方法參照Chang等[18]并略有修改。在滅菌后的96孔板加入(1)150 μL TSB液體培養基和50 μL金黃色葡萄球菌菌液,混勻,于37 ℃孵育24 h后更換新鮮無菌PBS培養基,或加入(2)150 μL APW液體培養基和50 μL副溶血性弧菌菌液,混勻,于28 ℃孵育24 h后更換新鮮無菌APW培養基;隨后分別在12、24、48、72、96和120 h時加入低濃度亞硝酸鈉溶液為實驗組。董慶利[19]報道了0～500 mg/L亞硝酸鹽能顯著影響生孢梭菌超微結構,導致其細胞壁破裂、變薄或消失,胞漿內容物溶解或流失等。因此,選擇50、100、200、400和600 mg/L的亞硝酸鈉溶液作為實驗組,對照組不添加亞硝酸鈉溶液,每組4個平行,2 h后取出96孔平板,酶標儀法測定OD630值。

1.2.3 生物被膜的形成與測定 將菌懸液與培養基按1∶3體積混勻后,每組4個平行,以無菌培養基為空白對照。每次取出測定時,先棄去培養液,用生理鹽水250 μL/孔清洗2 次,60 ℃干燥固定30 min,隨后用0.1%結晶紫溶液200 μL/孔染色5 min后棄去染液,用生理鹽水250 μL/孔清洗3 次,60 ℃干燥后,于200 μL/孔的33%冰醋酸溶解5 min,采用酶標儀法測定OD630值[20]。

1.2.4 清除率的計算 采用清除率可以直觀反映抑制劑對生物被膜的清除效果,其計算公式如下:

Q-細菌生物被膜清除率(%);A1:對照組菌液OD630值;A2:處理組菌液OD630值。

1.2.5 細胞表面相互作用實驗 將培養好的細菌菌液按1∶100比例分別接種于含有600mg/L亞硝酸鈉的液體培養液中,隨后加入培養皿,以不含亞硝酸鈉的菌液做對照,放入載玻片作為生物被膜載體。在最適溫度條件下孵育10h后取出,經生理鹽水漂洗除去浮游菌,置于無菌培養皿中,以適量甲醇固定15min,再加入2%結晶紫溶液染色5min,用少量自來水沖洗,30 ℃干燥30min后,33%冰醋酸脫色5min,烘干后置于光學顯微鏡下觀察,并作拍照記錄[14]。

1.2.6 聚集實驗 在試管中分別加入含有600mg/L亞硝酸鈉的液體培養液5mL,并以不含亞硝酸鈉的培養液為對照,每試管中分別接種3環菌液,最適溫度下孵育48h,觀察并記錄實驗結果[21]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度亞硝酸鈉對兩種菌的抑制作用

2.2.1 亞硝酸鈉對細菌生長的影響 由圖1可知,4～48h,隨著培養時間的延長,對照組和各實驗組OD630值均逐漸升高,說明兩種致病菌的生物被膜持續生長;72h后,OD630值變化趨于平緩,說明此時生物被膜生長緩慢;培養至120h時,對照組OD630值均略有下降,與對照組相較,金黃組添加低濃度亞硝酸鈉(50mg/L和100mg/L)其OD值96h就開始下降,而副溶組OD值則在120h開始下降。同時隨著亞硝酸鈉濃度增加,各實驗組OD630值低于同一時間對照組OD值。比較圖1a和圖1b,各時間段金黃色葡萄球菌OD值均高于副溶組,表明金黃色葡萄球菌具有更強大的生物被膜形成能力。此外,與金黃組相較,副溶組在培養4～24hOD值變化趨勢平緩,說明此時副溶血性弧菌生物被膜形成緩慢。因此,亞硝酸鈉能在一定程度上抑制金黃色葡萄球菌(圖1a)和副溶血性弧菌(圖1b)生物被膜的生長,且隨著濃度的升高抑制作用增強。

圖1 不同濃度的亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的生物被膜形成的影響Fig.1 Growth curve of S. aureus and V. Parahaemolyticus bacterial biofilm under different concentration of sodium nitrite

2.2 亞硝酸鈉對兩種菌不同培養時間的抑制作用

由圖2a至圖2f可知:與對照組相比,隨著亞硝酸鈉濃度的增加,SA實驗組和VP實驗組的OD630值均呈下降趨勢,即五個濃度對兩種致病菌的生物被膜均有清除效果?？梢?五個濃度的亞硝酸鈉對不同培養時間的兩種菌生物被膜均表現出明顯的抑制效果,且抑制作用具有濃度依賴性,隨著濃度增加清除效果愈益顯著,細菌不同培養時間中添加亞硝酸鈉的抑制效果為濃度依賴型,但與SA實驗組不同,VP實驗組在亞硝酸鈉濃度為200 mg/L時已對其生物被膜的生長起到良好的抑制效果,繼續增大添加量其OD值變化未超出誤差線范圍,說明繼續增大亞硝酸鈉添加量對抑制VP生物被膜的形成無意義。因此,亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜生長的最佳抑制濃度分別為600 mg/L和200 mg/L。為進一步探究亞硝酸鈉添加時間及添加濃度對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的影響,本文比較了不同生長時間添加不同濃度的亞硝酸鈉對兩種細菌生物被膜的清除率。由圖2g和2h所知,培養初期,亞硝酸鈉對SA組生物被膜的清除率呈上升趨勢,培養時間達48 h時清除率最高,48 h后的清除率呈下降趨勢。但隨著亞硝酸鈉濃度的提高,其對SA的清除率始終呈現明顯的上升趨勢?？梢?48 h添加600 mg/L亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用最顯著。對于VP組而言,培養12 h添加亞硝酸鈉對其生物被膜呈明顯的抑制效果,清除率最大,而在隨后的培養時間內添加亞硝酸鈉,其清除率均明顯小于12 h實驗組;當亞硝酸鈉添加量達200 mg/L時,VP組生物被膜清除率已明顯高于添加量為50 和100 mg/L時,繼續增大添加量,清除率曲線趨于平緩,由此可知,12 h添加200 mg/L亞硝酸鈉時,副溶血性弧菌生物被膜清除率為36.67%,抑制作用達最大。

已有報道表明,細菌在接觸表面的粘附是細菌形成生物被膜的第一步,這種粘附作用主要是細菌表面特定的粘附素蛋白識別接觸表面受體的結果,因此具有選擇性和特異性[22]。由于微生物粘附在接觸表面并形成生物被膜過程很快,因此幾乎不可能完全控制生物被膜的形成[23],通過在培養基中加入抑菌物質以阻止微生物在其表面上的粘附可作為一種控制生物被膜形成的途徑。目前,已有對材料表面進行改性來降低細菌在材料表面粘附,或通過涂覆抗生素、添加銀離子等抗菌素的方法在材料表面引入殺菌物質以抑制細菌的生長及生物被膜形成的研究[24],還有頭孢曲松對表皮葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用的研究[25],但亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜抑制作用的相關研究卻一直未見報道,本文為抑制細菌生物被膜的形成提供一個新的思路。Chang等[18]報道了EDTA對單增李斯特菌生物被膜的影響,指出EDTA通過影響細菌的初期粘附抑制了李斯特菌生物被膜的形成,這與本文亞硝酸鈉對副溶血性弧菌生物被膜抑制的成因一致。然而,亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用卻主要表現在中期,細菌生物被膜復雜的胞外基質及其本身的三維立體結構是許多生物制劑進入生物被膜內部的障礙,亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌未能在生物被膜形成初期就表現出良好的抑制效果可能與其生物被膜的結構和基質有關[26]。

圖2 亞硝酸鈉對兩種菌不同培養時間細菌生物被膜的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium nitrite on bacterial biofilm at different growth times注:a:12 h,b:24 h,c:48 h,d:72 h,e:96 h,f:120 h,g:不同濃度亞硝酸鈉對SA不同培養時間的生物被膜清除率影響,h:不同濃度亞硝酸鈉對VP不同培養時間的生物被膜清除率影響。

2.3 細胞表面反應實驗

圖3為兩種菌在顯微鏡下的細胞表面反應形態,對照組(圖3a和圖3c)為不含亞硝酸鈉的載玻片在鏡下的形態,可以看出細胞已開始明顯聚合,并還有進一步聚合的趨勢,而實驗組(圖3b和圖3d)的細胞聚合程度大大降低,松散的分布在載玻片上?？梢?亞硝酸鈉可抑制金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的細胞表面反應,進而影響其粘附性。這可能是因為亞硝酸鈉影響了金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的細胞疏水性[27]。

圖3 亞硝酸鈉對兩種菌細胞表面反應的影響(1000×)Fig.3 Cell-surface interaction assay注:a:SA對照組,b:含600 mg/L亞硝酸鈉的SA實驗組,c:VP對照組,d:含200 mg/L亞硝酸鈉的VP實驗組,圖4同。

2.4 聚集實驗結果

圖4中可清晰看出對照管(圖4a和圖4c)液體澄清較透明,試管底部有明顯沉淀,而含有600 mg/L亞硝酸鈉的實驗管(圖4b和圖4d)中有懸浮狀態的固體顆粒,試管底部也有沉淀,但較為分散。此現象證明亞硝酸鈉可抑制細胞間的聚合反應。其中VP實驗組懸浮的固體顆粒明顯多于SA實驗組,底部沉淀也更為分散?？梢?200 mg/L亞硝酸鈉對副溶血性弧菌聚合性的抑制作用優于600 mg/L亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌聚合性的抑制作用。

另外,細胞表面反應與細胞間反應的聚合實驗結果顯示,亞硝酸鈉能抑制細胞表面和細胞間的反應,且抑制作用較明顯,可以看出聚集的細胞由于亞硝酸鈉的加入被打散,分布在載玻片或試管中,影響了細菌的疏水性和聚合度。實驗中觀察到亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的抑制作用結果并不完全一致,這可能是兩種菌自身結構和特性的不同造成的。

圖4 亞硝酸鈉對兩種菌細胞聚合效果的影響Fig.4 The result of aggregation assay

3 結論

本實驗探究了亞硝酸鈉對兩種典型的致病性細菌——金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的影響,發現亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的生長具有抑制作用。

添加600 mg/L亞硝酸鈉、培養48 h對金黃色葡萄球菌生物被膜清除率達37.31%,抑制效果最佳;而對副溶血性弧菌而言,其在200 mg/L亞硝酸鈉下培養12 h清除率達36.67%,效果最佳。

亞硝酸鈉對生物被膜的抑制作用可能是由于亞硝酸鈉抑制細菌粘附、聚合、細胞表面相互作用的綜合作用造成的。

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Inhibiting effect of Sodium nitrite on biofilm formation ofStaphylococcusaureusandVibrioParahaemolyticus

QU Hong-yan1,LI Xue-peng1,*,YI Shu-min1,BAI Feng-ling1,ZHANG De-fu1,LI Chun2,LI Ting-ting3,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science & Engineering,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;2.College of Mathematics and Physics,Bohai University,Jinzhou 121013,China;3.College of Life Science,Dalian Nationality of University,Dalian 116600,China)

The effect of sodium nitriteinvitroon adhesion,formation and eradication ofStaphylococcusaureus(SA)andVibrioParahaemolyticus(VP)biofilm was studied by using microtiter plate assay in this paper. More information about the inhibition mechanism was gotten by cell-surface interaction assay and cells aggregation assay. The results indicated that the concentration-dependent inhibition effect ofS.aureusbiofilm was predominant with 600 mg/L sodium nitrite added after 48 h. The bacterial biofilm clearance at this time was 37.31%. However,adding 200 mg/L of sodium nitrite after 12 h of biofilm formation had the strongestV.Parahaemolyticusbiofilm suppression effects with the clearance 36.67%. It was suggested by cell-to-surface interactions and cell-to-cell aggregation interaction to inhibition effect of sodium nitrite on adhesion and bacterial aggregation ofS.aureusandV.Parahaemolyticus. In conclusion,sodium nitrite can restrain the formation and growth ofS.aureusandV.parahaemolyticusbiofilm,by influence cells aggregation and cell-surface adhesion.

biofilm;Staphylococcusaureus;VibrioParahaemolyticus; sodium nitrite;inhibitory activity

2015-01-28

渠宏雁(1985-)，女，碩士，研究方向：水產品儲藏加工，E-mail：yueyufei@126.com。

*通訊作者:李學鵬(1982- )，男，博士，副教授，主要研究方向：水產品貯藏加工，E-mail：xuepengli8234@163.com。 勵建榮(1964- )，男，教授，博士，主要研究方向：水產品貯藏加工與食品安全，E-mail：lijr6491@163.com。

國家自然科學基金(31471639)；“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD29B06)；遼寧省教育廳創新團隊項目(LT2014024)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0178-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.028