細菌素Lcn972A產生菌的鑒定及其基因的克隆與序列分析

甘祥武,葉志偉,郭心悅,郭麗瓊,林俊芳,王艷婷,廖騰達

(華南農業大學食品生物技術研究所，華南農業大學食品學院生物工程系,廣東廣州 510640)

細菌素Lcn972A產生菌的鑒定及其基因的克隆與序列分析

甘祥武,葉志偉,郭心悅,郭麗瓊,林俊芳*,王艷婷,廖騰達

(華南農業大學食品生物技術研究所，華南農業大學食品學院生物工程系,廣東廣州 510640)

目的:從杏鮑菇子實體與海帶中分離的63株乳酸菌中鑒定出產細菌素Lcn972A的菌株,并對細菌素編碼基因進行克隆與基因序列分析。方法:采用生物信息學手段對已報道的細菌素Lcn972A編碼基因進行分析比較,設計引物,分別以各乳酸菌基因組DNA為模板,利用PCR克隆技術克隆出細菌素Lcn972A的基因,利用生物信息學工具對其核酸序列和預測的蛋白序列進行分析。結果:在63株乳酸菌的基因組樣品中有15組被克隆出目的條帶,其中杏鮑菇乳酸菌A15與海帶乳酸菌CX2樣品PCR產物條帶清晰穩定性好,經鑒定兩樣品的乳酸菌株為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。對克隆的細菌素Lcn972A基因測序結果表明該基因序列全長276 bp。生物信息學分析顯示該基因編碼91個氨基酸,分子量大小22843.3 u,等電點5.33,氨基酸序列為親水性,二級結構主要由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈組成。結論:從分離自杏鮑菇子實體乳酸乳球菌A15與海帶乳酸乳球菌株CX2的細菌素編碼基因及氨基酸序列與報道的有所不同,可能是新的細菌素,該細菌素的抗菌特點有待進一步的研究。

乳酸乳球菌,Lcn972A基因,分子鑒定,序列分析

細菌素(Bacteriocin)是由某些細菌在代謝過程中合成并分泌到環境中的具有殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物特性的殺菌蛋白或多肽物質[1]。Klaenhammer和Nes等根據氨基酸的一級結構、分子量的大小、熱穩定性和抑菌譜等方面的不同,把細菌素分為硫醚抗生素、不包含羊毛硫氨酸的小分子多肽類細菌素、蛋白質類細菌素以及復合型細菌素等4類[2-3]。細菌素 Lcn972是一種非羊毛硫氨酸的小分子多肽類細菌素,它能夠通過與細胞壁前體中的LipidⅡ特異性結合,影響隔膜形成,阻礙細胞分裂[4]。大部分乳酸菌細菌素對熱穩定、具有高等電點和親水特性,可以與食品一起進行加熱處理[5]。目前對細菌素產生菌的研究主要集中在乳酸菌上[6]。國外對乳酸菌細菌素的研究較多,已經從鮭魚[7]、伊朗乳制品[8]、泰國紅樹林[9]等物種乳酸菌的產物中分離到上百種細菌素。產細菌素的乳酸菌種類包括肉桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明片株菌屬、片球菌屬等[10-11]。傳統的篩菌方法耗時、步驟繁瑣,且很難迅速篩選到細菌素。隨著大量不同乳酸菌菌株基因組測序的完成,利用生物信息學的方法預測、分析和尋找新型細菌素成為可能[12-14]。由于細菌素的基因序列保守,在已知的細菌素DNA序列的基礎上設計保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針,通過采用生物信息學和分子生物學等手段能夠對細菌素進行深入研究。

本文通過設計保守的PCR引物,從63株來源于杏鮑菇與海帶的乳酸菌中鑒定細菌素,從杏鮑菇分離乳酸菌A15與海帶分離乳酸菌CX2中克隆出相同Lcn972細菌素家族基因,與NCBI報道Lcn972細菌素在分子水平上存在差異,將其命名為Lcn972A,乳酸菌A15、CX2鑒定為乳酸乳球菌,對該基因與其推導的蛋白序列進行分析,為開發利用Lcn972A細菌素及其產生菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

63株乳酸菌菌株 廣州天河區市場杏鮑菇(Pleurotuseryngii)的子實體與海帶(ThallusLaminariae)中分離并保存于華南農業大學食品生物技術研究所。

普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒 TIANGEN公司;PCR產物回收試劑盒、pMD18-T克隆載體、Ex Taq DNA聚合酶 TAKARA公司;Taq DNA聚合酶 北京博邁德生物試劑公司;其他普通試劑均為國產分析純;引物 上海捷瑞公司合成,DNA序列測序 上海美吉生物醫藥科技有限公司與北京六合華大基因科技股份有限公司。

乳酸菌MRS培養基[15]:蛋白胨10 g,牛肉膏8 g,酵母膏粉4 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸三氨2 g,乙酸鈉5 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.05 g,吐溫80 1 g,pH(6.2±0.2),配制1 L,固體培養基加入1.2%瓊脂粉。

大腸桿菌LB培養基[16]:胰蛋白胨10 g,酵母提取粉5 g,氯化鈉10 g,配制1 L,固體培養基加入1.5%瓊脂粉。

1.2 實驗方法

1.2.1 溴鉀酚紫指示劑法篩選乳酸菌 根據乳酸菌產酸特性,將樣品預處理后,先進行梯度稀釋,找到合適梯度后,在加有溴鉀酚綠指示劑的MRS培養基上涂布,挑起使培養基變黃色的單菌落連續劃線確定為純種菌后,經革蘭氏染色確定為純種革蘭氏陽性菌,將單菌落保存。

1.2.2 細菌素Lcn972A基因的引物設計 根據NCBI中檢索到的以及文獻報導的各Lcn972細菌素基因序列,通過生物信息學比對獲得細菌素的保守序列,根據保守序列設計PCR擴增引物(上游引物LCB972 F:5′-GGATCCATGAAAACCAAGTCTCTCG-3′,下游引物LCB972 R:5′-GAGCTCTTACCAAAAGT-3′)并合成。利用溶菌酶法提取到的63株乳酸菌基因組DNA為模板[17],以LCB972 F/LCB972 R為引物進行PCR擴增。PCR的反應體系為:10×PCR Buffer(Mg2+plus)5.0 μL,dNTP Mix(2.5 mmol/L each)4 μL,引物LCB972-F(10 mol/L)和LCB972-R(10 mol/L)各1 μL,Ex-Taq(5 U/L)0.25 μL,基因組DNA 1 μL,ddH2O 37.75 μL 反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,37.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存PCR產物。PCR產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行序列測定。

1.2.3 產細菌素乳酸菌株的分子鑒定 對能夠擴增出目標條帶的樣品的菌株進行16S rDNA分子鑒定,16S rDNA 擴增引物采用通用引物[18],正向引物為27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物1495r:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

1.2.4 Lcn972A基因序列分析 測序結果與峰圖正常,接著使用NCBI網站提供的BLAST工具完成DNA序列及其推導的氨基酸序列的比對,使用在線工具Swissprot(http://www. expasy. ch/sprot/)分析Lcn972A基因編碼氨基酸序列的理化性質、功能位點、信號肽、親疏水性二級結構和三級結構。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選與鑒定

用生理鹽水將樣品處理液稀釋成10-1～10-6梯度,在10-6梯度下菌落利于觀察,將不同類型單菌落在溴鉀酚紫MRS培養基培養2～3 d,選取明顯使周圍培養基由紫轉為黃色的單菌落,繼續在加入溴鉀酚紫的MRS培養基中劃線培養,如圖1所示,所得單菌落編號后進行革蘭氏染色,將鏡檢呈紫色的革蘭氏陽性菌編號保存,如圖2所示。

圖1 乳酸菌平板篩選Fig.1 Plate screening of lactic acid bacteria

圖2 乳酸菌革蘭氏染色鏡檢Fig.2 Gram staining microscopic examination of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌Lcn972A基因的克隆

以乳酸菌基因組DNA為模板,以Lcn972-F/Lcn972-R為引物,使用PCR法擴增Lcn972A基因,產物經凝膠電泳檢測,在63株樣品中,有15株樣品含有與預期大小相一致的約300 bp的條帶(圖3),使用PCR產物純化試劑盒將該目的片段回收并送樣測序,測序結果顯示15株樣品中A15、CX2含有相同細菌素編碼基因表達框,該細菌素基因全長為276 bp,具有完整的編碼框。BLAST比對顯示所得乳酸乳球菌基因與已經在NCBI報道的Lcn972基因(GenBank:AJ002203.2)的核苷酸序列的相似性為97.46%,推測氨基酸序列的相似性97.80%,將其命名為Lcn972A。

圖3 Lcn972A基因PCR克隆電泳圖Fig.3 The PCR clone of the Lcn972A gene注:泳道1為杏鮑菇乳酸菌A15,泳道2為海帶乳酸菌CX2,圖4同。

2.3 產細菌素乳酸菌的分子鑒定

經測序鑒定15株乳酸菌樣品中A15、CX2含有細菌素基因,對克隆出Lcn972A基因的乳酸菌進行16S rDNA分子鑒定(圖4),在DNA MakerⅢ約1400 bp處出現熒光條帶。PCR產物測序后,將所得測序結果進行BLAST比對,結果顯示待測乳酸菌與乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)同源性達99%,推測其為乳酸乳球菌。

2.4 乳酸乳球菌Lcn972A基因的生物信息學分析

Lcn972A基因編碼91個氨基酸殘基,使用ExPASy網站的上的ProtParam分析軟件[19]計算其相對分子質量大小為22843.3 u,理論等電點為5.33,蛋白質不穩定指數為50.52,屬于不穩定類蛋白,脂肪系數為32.25,總平均疏水指數為0.759。該氨基酸序列功能位點的預測由在線分析工具 Predict Protein與ScanProsite 完成[20],預測結果顯示其包含PKC磷酸化位點、N-?；稽c、N-糖基化位點(圖5)。利用 NCBI 網站 CDD 程序[21]對該氨基酸序列進行保守結構域分析,結果表明該蛋白屬于乳球菌素972家族,結構域序列號為cl09891,結構域匹配E值為1.88e-22。利用SignalP 4.1 Serve對該氨基酸序列進行信號肽預測,結果顯示其結構存在信號肽特征[22]。

圖5 Lcn972A基因序列及預測的氨基酸序列Fig.5 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of Lcn972A gene注:“?”:ATG 或 TAA(ATG or TAA);“ ”:N-糖基化位點(N-glycosylation site);“-”:蛋白激酶C磷酸化作用位點(Protein kinase C phosphorylation site);“…… ”:N-?；饔梦稽c(N-myristoylation site)。

使用ExPASy的ProtScale程序,在線分析氨基酸序列親疏水性[23]。疏水性預測的方法依賴于疏水性的衡量尺度,每個氨基酸根據其一系列的物理特性(例如,溶解性、跨越水-汽相時產生的自由能等),被賦予一個數值以代表其疏水性。分析結果表明該氨基酸序列為親水性,該氨基酸序列前端出現明顯的疏水信號,進一步證明了預測是正確的,該氨基酸序列存在轉運信號肽序列(圖6,圖中正值越大表示越疏水,負值越大表示越親水,介于+0.5和 0.5之間的為兩性氨基酸。)。

圖6 氨基酸序列親疏水性預測Fig.6 The hydrophilic predicted of amino acid sequence

在線工具Predict protein分析顯示該Lcn972A氨基酸序列中,共有α-螺旋3處,占總二級結構的 37.36%;無規卷曲6處,占總二級結構的51.65%;延伸鏈2處,占總二級結構的10.99%。該Lcn972A主要由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈組成(圖7)。

圖7 蛋白質二級結構分布圖Fig.7 The secondary structure of the Lcn972A protein 注:長豎條紋代表α-螺旋(α-helix),短豎條紋無規卷曲(Random coil),中豎條紋代表延伸鏈(Extended strand)。

用在線分析軟件Phyre2 library預測該蛋白的三級結構[24],在單一最高模板模式下置信度最高可達100%,但未能完全覆蓋整個結構,具有明顯的空間結構,主要由α-螺旋和無規卷曲構成(圖8)。

圖8 Lcn972A基因細菌素三級結構圖譜Fig.8 Three-Stage Prediction of the Lcn972A Protein

3 結論與討論

近年來研究顯示細菌素具有穩定的抗菌特性,且不會形成抗逆性,其中乳酸菌細菌素在食品的保存和對腸道致病菌的抑制作用方面效果明顯,在食品發酵、乳制品行業中有廣闊的發展前景。

傳統的產細菌素乳酸菌的篩選是通過細菌素的功能性測定:首先配制合適培養基培養目的菌,通過瓊脂擴散法、牛津杯法、溶鈣圈法,篩選出對指示菌(單增李斯特菌等革蘭氏陽性菌)具有明顯抑茵作用的菌株[25-27],在排除有機酸和過氧化氫的作用后,對仍具有明顯抑菌活性的菌株,用胰蛋白酶對其發酵液進行處理后,若其抑菌活性下降明顯,說明代謝產物中含有蛋白性質的抑菌物質,從而確定有可能為細菌素類物質。但這類鑒定方式有明顯的局限性,工作量大,操作復雜,重復性差,對于結果的把握會有誤差,準確性弱,難以達到大規模高通量的篩選要求。隨著大量不同乳酸菌菌株基因組測序的完成,基因組序列在挖掘新型高效的細菌素方面扮演著重要的角色,使得利用生物信息學的方法預測和尋找新型細菌素成為可能。根據已知的細菌素DNA 序列設計保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針,可以在大范圍內的乳酸菌群中挖掘出依賴功能性測定時不易發現的細菌素。其中基于PCR方法的快速篩選可以作為生態學研究中的有效手段,可以鑒定出產細菌素的益生菌,并將其應用在食品工業中[28-29]。

本實驗室也采用傳統的牛津杯法篩選細菌素,但抑菌圈差異不明顯且耗時較多,故將分子生物學手段運用到細菌素的篩選,根據已報道的乳酸菌細菌素DNA序列設計合適引物,對杏鮑菇與海帶源的乳酸菌進行分子克隆,63株乳酸菌中杏鮑菇乳酸菌A15與海帶乳酸菌CX2樣品含有Lcn972A細菌素基因,得到結果快速直觀,對克隆得到Lcn972A細菌素基因進行序列分析,結果顯示其與NCBI全基因組測序菌株細菌素基因相似性為97.46%,氨基酸序列相似性97.80%,分子量大小22843.3 u,等電點5.33,為親水性氨基酸;因此,本實驗利用基因克隆方法篩選細菌素的方法具有一定的現實意義,并且對下一步研究乳酸乳球菌中Lcn972細菌素家族的分子功能以及抑菌譜范圍的確定,細菌素合成過程調控機理的揭示具有重要意義,有利于該基因與其產生菌進一步的研究。

[1]Konisky J.Colicine and other bacteriocins with established modes of action[J].Annu Rev Microbia,1982,36:125-144.

[2]Klaehammer T R.Genetics of Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria[J]. FEMS Microbiology Reviews,1993,12:39-86.

[3]Nes I F,Diep D B,Havarstein L S. Biosynthesis of Bacteriocins in Lactic Acid Bacteria[J]. Antonie van Leeuwenhoek,1996,70:113-128.

[4]Clara Roces,Verónica Pérez,Jan Kok,et al.The Putative Lactococcal Extracytoplasmic Function Anti-SigmaFactor Llmg2447 Determines Resistance to the Cell Wall-Active

Bacteriocin Lcn972[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2012,56(11):5520-5527.

[5]Cleveland J,Thomas J M,Ingolf F N,et al.Bacteriocin:Safe,natural antimicrobials for food pres-Ervation[J].Inter Food Microbial,2001,71(1):1-20.

[6]楊瑾.乳酸菌細菌素分離純化及生物學特性[D].杭州:浙江工商大學,2007.

[7]Immacolata Anacarso,Patrizia Messi,Carla Condò,et al.A bacteriocin-like substance produced fromLactobacillus pentosus 39 is a natural antagonist for the control of Aeromonas hydrophila and Listeria monocytogenes in fresh salmon fillets[J].LWT-Food Science and Technology,2014,55(2):604-611.

[8]Mahdieh Iranmanesha,Hamid Ezzatpanaha,Naheed Mojgani.Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acidbacteria isolated from traditional Iranian dairy products[J].LWT-Food Science and Technology,2014,58(2):355-359.

[9]Noraphat Hwanhlem,Jean-Marc Chobert,Aran H-Kittikun.Bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from mangrove forests in southern Thailand as potential bio-control agents in food:Isolation,screening and optimization[J].Food Control,2014,41(2014):202-211.

[10]Deraz S F,Karlsson E N,Hedstr M,et al.Purification and characterisation of acidocin D20079,abacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079[J]. Journal of Biotechnology,2005,117(4):343-353.

[11]Jianyin Miao,Haoxian Guo,Yangwen Ou,et al.Purification and characterization of bacteriocin F1,a novel bacteriocin produced byLactobacillusparacaseisubsp.toleransFX-6 from Tibetan kefir,a traditional fermented milk from Tibet,China[J].Food Control,2014,42(2014)48-53.

[12]Michat Wieckowicz,Marcin Schmidt,Sip A,et al. Development of a PCR-based assay for rapid detection of class IIa bacteriocin genes[J]. Letters in Applied Microbiology,2011,52(3):281-289.

[13]Franca Rossi,Marta Marzotto,Silvia Cremonese,et al.Diversity of Streptococcus thermophilu sin bacteriocin production;inhibitory spectrum and occurrence of thermophilin genes[J].Food Microbiology,2013,35(2013):27-33.

[14]Sunita J Macwana,Peter M Muriana. A‘bacteriocin PCR array’for identification of bacteriocin related structural genes in lactic acid bacteria[J].Journal of Microbiological Methods,2012,88(2):197-204.

[15]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京:中國輕工業出版社,1999.

[16]仲崇艷.LB 培養基在魚類致病菌藥敏實驗中的應用研究[J].動物科學,2014,13:290-292.

[17]劉曉俠,林建平,岑沛霖.微生物基因組DNA提取方法的比較與改進[J].嘉興學院學報,2007,19(3):48-50.

[18]張潔,徐桂花,尤麗琴.16S rDNA 序列分析法鑒定乳酸菌[J].農產品加工,2009(4):47-49.

[19]Amanzadeh E,Mohabatkar H,Biria D,et al.Classification of DNA Minor and Major Grooves Binding Proteins According to the NLSs by Data Analysis Methods[J].Appl Biochem Biotechnol. 2014,174(1):437-451.

[20]Burkhard Rost,Guy Yachda and Jinfeng Liu.The predict protein server[J]. Nucleic Acids Research,2004,32:321-326.

[21]Marchler-Bauer A,Lu S N,Anderson J B,et al.CDD:a Conserved domain database for the functional annotation of proteins[J]. Nucleic Acids Res,2011,39(D):225-259.

[22]Bendtsen JD1,Nielsen H,von Heijne G,et al.Improved prediction of signal peptides:Signal P 3.0[J].J Mol Biol.2004,340(4):783-795.

[23]Xia XY,Wu QY,An LM,et al.A novel P20R mutation in the alpha-B crystallin gene causes autosomal dominant congenital posterior polar cataracts in a Chinese family[J].BMC Ophthalmol. 2014,14(1):108.

[24]Nema V,Pal SK.Exploration of freely available web-interfaces for comparative homology modelling of microbial proteins[J].Bioinformation.2013,9(15):796-801.

[25]張金蘭.戊糖乳桿菌素的純化鑒定及對托盤包裝冷卻肉的防腐保鮮效果研究[D].北京,中國農業大學,2009.

[26]Wolf C E,Gibbons W R.Improved method for quantification of the bacteriocin nisin[J]. Journal of Applied Bacteriology,1996,80(4):453-457.

[27]Nabil B O,Hikmate A,Keleke S,et al. Bacteriocin-producing Lactobacillus strains isolated from poto poto,a Congolese fermented maize product,and genetic fingerprinting of their plantaricin operons[J].International Journal of Food Microbiology,2008,127(1-2):18-25.

[28]諸永志,姚麗婭,徐為民,等.乳酸細菌素應用于肉制品防腐劑的研究進展[J].食品科技,2008(2):136-139.

[29]LiuW&N.Hansen.Some chemical and physical properties of Nisin,a smallprotcin antibiotic produced by Lactococcus lactis[J].Appl. Environ Microbiol,1990,56:2551-2558.

Identification of the bacteriocin Lcn972A-producing bacteria and the cloning and sequence analysis of its bacteriocin gene

GAN Xiang-wu,YE Zhi-wei,GUO Xin-yue,GUO Li-qiong,LIN Jun-fang*,WANG Yan-ting,LIAO Teng-da

(Department of Bioengineering,College of Food Science;Biotechnology institute,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China)

Objective:In this study,bacteriocin Lcn972A-producing bacteria were screened from 63 strains of lactic acid bacteria isolated fromPleurotuseryngiifruit body andThallusLaminariae. Subsequently,gene for this bacteriocin was cloned by PCR methods and analyzed by bioinformatics tools. Method:Primers were designed based on the results of bioinformatics analysis of reported genes for lcn972A. Subsequently,genes for Lcn927A were isolated from the genomic DNA of 63 strains of lactic acid bacteria respectively. Finally,the nucleotide sequence and predicted protein sequence were analyzed by a series of bioinformatics tools. Result:Genes for Lcn927A were isolated from 15 genomic samples among 63 strains of Lactic acid bacteria. Two of the positive stains were characterized asLactococcuslactisfrom Pleurotus eryngii fruitbody A15 and Thallus Laminariae CX2. The result of sequencing showed that the full length of the Lcn927A gene was 276 bp,which coded for 91 amino acid residues,with molecular weight of 22843.3 u,theoretical PI of 5.33,hydrophilic amino acid,the secondary structure of protein consist of α-helix,random coil and extended strand. Conclusion:The nucleotide sequence and predicted protein sequence of present Lcn927A gene ofLactococcuslactisA15 and CX2 isolated from Pleurotus eryngii fruitbody and Thallus Laminariae were different from those that hadbeen publicly reported,and the antimicrobial properties of this gene need to be identified in the future study.

Lactococcuslactis;Lcn972A gene;molecular identification;sequence analysis

2015-01-23

甘祥武(1989-),男,碩士,研究方向:食品微生物與生物技術,E-mail:gxwere@163.com。

*通訊作者:林俊芳(1962-),男,博士,研究方向:食品微生物與天然產物,E-mail:linjf@scau.edu.cn。

國家自然科學基金資助(31071837,31272217);廣東省攻關項目資助(2013B010404041)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.030