紫外線與微波復合誘變選育高產脂肪酶菌株的研究

趙興秀,何義國,趙長青,方春玉,張 靜,鄒 偉

(四川理工學院,四川自貢 643000)

紫外線與微波復合誘變選育高產脂肪酶菌株的研究

趙興秀,何義國,趙長青*,方春玉,張 靜,鄒 偉

(四川理工學院,四川自貢 643000)

研究選育高產脂肪酶菌株。采用紫外線誘變、微波誘變和紫外微波復合誘變出發菌株H3,測定比較酶活,確定最佳誘變效果。結果表明,出發菌株經紫外線和微波誘變后,所產脂肪酶的最高酶活分別為57.984 U/mL和57.1 U/mL,比出發菌株H3提高了38.3%和36.2%,經微波輻射40 s和紫外線照射80 s的復合誘變菌株M3產酶活力最高,達61.6 U/mL,比出發菌株H3提高了46.85%。

脂肪酶,紫外線,微波,復合誘變,脂肪酶菌株

脂肪酶(Lipase)是一類特殊的酯鍵水解酶,廣泛應用于食品、化妝品、皮革、洗滌劑、醫藥、印染、能源等領域[1]。在食品方面,利用脂肪酶可生成短鏈脂肪酸酯、乙醛、乙醇等風味物質,增加食品香味[2],在紡織方面,脂肪酶能水解織物表面脂質成脂肪酸,更易于脫除[3]。用脂肪酶和淀粉酶協同處理棉布纖維,可使棉布白度提高,手感更柔,染色更好[4]。在醫藥方面,脂肪酶可作為診斷工具預測疾病,血清中脂肪酶還可用于檢測急性胰腺炎和胰腺損傷[5]。在生物能源方面,將脂肪酶進行固定化,可催化泔水油合成生物柴油[6]。目前,有研究將脂肪酶固定在pH或氧化電極上,聯合葡萄糖氧化酶制成脂質生物傳感器,測定人體甘油三酯和血膽固醇含量[7],進一步擴大了脂肪酶的應用前景。

目前,脂肪酶的供應卻遠遠小于需求,研究如何快速高產脂肪酶,具有很高的經濟價值和科研價值,當前脂肪酶主要來源于動植物和微生物,苗長林等采用微波-亞硝基胍誘變方法對米黑根毛霉進行誘變處理,獲量1株酶活達20.50 U/mL的突變菌株[8]。Beisson F. 等從萌發的向日葵種子分離純化得到GDSL脂肪酶[9]。由于微生物具有種類多、繁殖快、易發生遺傳變異,與底物具有專一性等優點,因此利用微生物產脂肪酶是獲到脂肪酶的主要來源,本文通過從富含油脂的土樣中富集產脂肪酶菌株,通過紫外和微波等誘變方法,獲得了一株高產脂肪酶菌株,對選育和提高菌株高產脂肪酶活力提供了新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富集培養基(g/L):(NH4)2SO41.0,NH4NO31.0,NaCl 1.0,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,橄欖油10.0,用10% NaOH溶液調pH至9。

平板篩選培養基(g/L):(NH4)2SO41.0,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 0.5,NH4NO31.0,NaCl 1.0,FeSO40.01,瓊脂20.0,橄欖油-聚乙烯醇乳化液12 mL,8滴0.1 g/L中性紅溶液,用10% NaOH溶液調pH至9。

斜面培養基(g/L):蛋白胨5.0,葡萄糖5.0,酵母膏3.0,NaCl 1.5,KH2PO41.0,瓊脂15.0。

種子培養基(g/L):蛋白胨5.0,蔗糖5.0,NaCl 3.0,KH2PO42.0,酵母浸膏5.0。

發酵培養基(g/L):蛋白胨20.0,蔗糖5.0,橄欖油5.0,(NH4)2SO41.0,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 1.0。

SP-Max 2300A酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司;D8023CTL-K4微波爐 順德格蘭仕電器有限公司;ZYT--DDT紫外線誘變臺 濟南杰康凈化設備廠。

1.2 產脂肪酶菌株的篩選

1.2.1 取樣培養 從自貢地區油坊土壤、飯店、食堂油煙機排氣孔等富油土壤中取土樣25 g于225 mL無菌生理鹽水中,用玻璃珠打散,浸泡30 min。取5 mL土壤懸液加入到30 mL富集培養基中,于37 ℃搖床振蕩培養3 d。

1.2.2 分離與初篩 將富集培養的菌懸液加入無菌生理鹽水中,分別配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。將各濃度菌懸液均勻涂布于篩選培養基,于37 ℃恒溫培養3 d。觀察菌落出現的變色圈,挑取變色圈大而變色明顯的菌體于篩選平板上劃線分離培養,再轉接于斜面培養基低溫保存。

1.2.3 復篩 將各斜面培養基上菌種分別接種于種子培養基,于37 ℃、160 r/min搖床培養12 h后,以6%接種量接入產酶發酵培養基,于37 ℃、160 r/min培養3 d。將各發酵液于5000 r/min離心15 min,取上清液測酶活,選取酶活最高的菌株作為本實驗出發菌株。

1.3 脂肪酶活力測定

采用對硝基苯酚法測脂肪酶活力[10]。

1.4 誘變

1.4.1 紫外誘變 取10 mL菌懸液置于無菌培養皿中,在30 cm處用30 W紫外燈照射,同時磁力攪拌,照射時長分別為20、40、60、80、100、120 s。每組做多個重復。誘變后,取0.2 mL菌懸液涂布到初篩平板培養基中,于37 ℃避光培養3 d,以出發菌株作空白對照,待平板長出菌落后,計算致死率,最后將各時間段菌種接種到斜面培養基上培養,挑取菌落較深的菌落進行發酵培養,取上清液測酶活。

1.4.2 微波誘變 將菌懸液置于微波爐中用同一功率處理10、20、30、40、50、60、70 s,每組3個重復。誘變后,取0.2 mL菌懸液涂布到初篩平板培養基中,于37 ℃避光培養3 d,以出發菌株作空白對照,待平板長出菌落后,計算致死率。最后將各時間段菌種接種到斜面培養基上培養,挑取菌落較深的菌落進行發酵培養,取上清液測酶活。

1.4.3 復合誘變 選取致死率在70%～80%時間段的紫外誘變菌種于微波中進行再次誘變,通過初篩和復篩,對目標菌株發酵培養,取上清液測酶活。每組3個重復,選取最高產酶菌株作為目的菌株。

致死率(%)=1-(處理后菌落中的活菌數/對照原菌液中的活菌數)×100

參考單因素誘變所得的致死曲線,利用產酶活力最高的紫外線和微波菌懸液,進行復合誘變,誘變方法為:1.紫外線60 s+微波40 s;2.紫外線60 s+微波50 s;3.紫外線80 s+微波40 s;4.紫外線80 s+微波50 s。

2 結果與分析

2.1 出發菌株的確定

通過初篩,得到了11個變色圈大而變色明顯的菌體,再進行分離復篩,得到了3株產脂肪酶菌株,分別命名為H1(圖1)、H2(圖2)和H3(圖3),從圖1、圖2和圖3可以看出,3株菌的變色圈較大,均呈米黃色,然后發酵培養,測定其上清液酶活,測定結果見圖4。

圖1 菌株H1生長菌落Fig.1 The colony of Strain H1

圖2 菌株H2生長菌落Fig.2 The colony of Strain

圖3 菌株H3生長菌落Fig.3 The colony of Strain H3

圖4 復篩菌株酶活測定Fig.4 The enzyme activity of the stains by secondary screening

由圖4可知,在同等條件下,菌株H3酶活力最高,達到41.9 U/mL,因此選擇H3作為出發菌株,用于后續誘變實驗。

2.2 菌株的革蘭氏染色鑒定

將紫外誘變前和誘變后的菌液接種到平板培養基中,再進行斜面培養、革蘭氏染色和鏡檢,得到如圖5和圖6的實驗結果。

圖5 紫外誘變前菌株H3鏡檢圖(40×)Fig.5 The microscopic of H3 before UV mutagenesis(40×)

圖6 紫外誘變后菌株H3鏡檢圖(40×)Fig.6 The microscopic of H3 after UV mutagenesis(40×)

從圖5和圖6可以看出,誘變前后的微生物在革蘭氏染色下均呈現藍紫色,證明為革蘭氏陽性菌。

2.3 紫外誘變酶活測定

將誘變培養的細菌置于菌落計數儀上計數,以未紫外照射細菌為對照,算出不同照射時間段菌株的致死率,以致死率為縱坐標,誘變時間為橫坐標,繪制致死曲線,如圖7。將各誘變時間段的菌株進行發酵培養,然后測其酶活,結果如圖8。

圖7 菌株H3紫外誘變致死曲線Fig.7 The lethal curve of H3 by UV mutagenesis

圖8 菌株H3紫外誘變產酶活性Fig.8 The enzyme activity of H3 after UV mutagenesis

從圖7可以看出,隨著紫外照射時間的增長,細菌的致死率在逐漸增大,紫外線對細菌的突變方向也有影響,有資料表明,致死率在85%～95%范圍內單位存活的菌體正突變較多[11],從圖8也可以得出,在誘變時間為80 s時,其菌株產酶活力最高,達到57.9 U/mL,比出發菌株的菌活提高了38.2%。所以在進行紫外線與微波復合誘變時,紫外線照射選擇60～80 s。

2.4 微波誘變酶活測定

將誘變培養的細菌置于菌落計數儀上計數,以未微波輻射細菌為對照,算出不同輻射時間段菌株的致死率,以致死率為縱坐標,誘變時間為橫坐標,繪制致死曲線,如圖9。將各誘變時間段的菌株進行發酵培養,然后測其酶活,結果如圖10。

圖9 菌株H3微波誘變致死曲線Fig.9 The lethal curve of H3 by microwave mutation

圖10 菌株H3微波誘變產酶活性Fig.10 The enzyme activity of H3 after microwave mutation

由圖9可以看出,隨著微波輻射時間的延長,細菌的致死率在逐漸增大,表明微波誘變后會呈現明顯的致死規律,微波對細菌的生長有較強的影響。由圖10可知,當微波誘變時間為40 s時,其菌株產酶活力最強,達到57.1 U/mL。

2.5 復合誘變結果

通過1.4.3復合誘變的4種方法,得4株產酶活性較高菌株,分別命名為M1、M2、M3和M4,其酶活測定結果如圖11。

圖11 不同菌株產酶活性Fig.11 The enzyme activity of H3,M1,M2,M3 and M4

從圖11可以看出,復合誘變中,利用方法3所得突變菌株M3產酶活力最高,達到61.6 U/mL,均高于紫外和微波單因素誘變結果。說明復合誘變效果更好,該誘變菌株可以用于脂肪酶產酶實驗。

3 結論與討論

選育高產脂肪酶菌株的文獻,已有不少報道。譚珍連等[12]以白地霉GXU08為出發菌,通過紫外誘變,得到菌株4-39,其酶活為14.2 U/mL符小燕等[13]將廣式臘腸中株葡萄球菌進行微波和紫外單獨誘變、微波復合紫外和紫外疊加誘變等方法,獲得1株產脂肪酶酶活力為5.26 U/mL的菌株。冀頤之等[14]采用低能N+離子注入技術,對少根根霉BUCT-11進行誘變選育,篩選到高產脂肪酶突變株N103,在搖瓶發酵條件下,其脂肪酶水解酶活為175 U/mL。本實驗通過初篩、復篩及紫外、微波誘變,最終獲1產酶活性達61.6 U/mL的突變菌株M3。本菌株與其他文獻報道脂肪酶活力不同的原因可能有以下三個方面:分離篩選的菌種不同;脂肪酶水解目標物不同;對脂肪酶酶活的定義不同。本實驗直接從富油土樣中篩選產脂肪酶菌株,使出發菌株本身就具有較高分解和利用脂肪的能力,再通過誘變選育,所得的產酶活力更強的菌株更有利于分解環境中油類脂肪。如果優化菌株M3的產酶條件,其酶活可能會更高。有研究認為,由于外力影響DNA的正常復制和轉錄,從而使子代DNA形成缺口,堿基錯誤插入該缺口,造成新鏈的堿基序列與母鏈不同而使誘變能提高菌株產酶活性[15]。如果能夠測得從出發菌株到經誘變選育所得的目的菌株的基因圖譜,對比分析找出導致菌株產酶活力增大的控制基因,將有利于從分子水平對菌株產酶活性進行定向選育,這也是本實驗亟需完成的后續工作。

[1]戴清源,朱秀靈.非水相中脂肪酶催化合成糖酯類食品添加劑的研究進展[J].食品工業科技,2012,33(10):385-389.

[2]汪薇,白衛東,趙文紅.生物法制備奶味香精的研究進展[J].中國調味品,2009,34(4):27-30.

[3]EI-syed H,Hamed R R,Kantouch A,et al. Enzyme-based felt proofing of wool[J].AATCC Rev,2002,2(1):25-28.

[4]胡學智.酶制劑工業概況及其應用進展[J].工業微生物,2003,33(4):32-41.

[5]何義國,趙興秀.脂蛋白酯酶的分離純化及其部分性質研究[J].四川理工學院學報:自然科學版,2012,25(6):1-5.

[6]李宇輝,劉成江,王俊鋼,等.微生物脂肪酶的性質及應用研究現狀[J].食品工業,2013(9):162-165.

[7]宋英攀,馮苗,詹紅兵.石墨烯納米復合材料在電化學生物傳感器中的應用[J].化學進展,2012,24(9):1665-1673.

[8]苗長林,羅文,呂鵬梅,等.脂肪酶產生菌微波-亞硝基胍復合誘變及培養條件優化.林產化學與工業,2013,33(5):30-34.

[9]Beisson F,Gardies AM,Teissere M,et al. Anesterase neosynthesized in post-germinated sunflower seeds is related to a new family of lipolytic enzymes. Plant PhysiolBiochem,1997,35(10):761-765/.

[10]王歡,何臘平,周換景,等.脂肪酶活力測定方法及其在篩選產脂肪酶微生物中的應用[J].生物技術通報,2013,23(1):203-208.

[11]穆昭艷,汪立平,張大兵,等.異甘露聚糖酶生產菌的誘變育種及固態發酵條件的優化[J].食品科學,2012,33(15):220-225.

[12]譚珍連,梁靜娟.原生質體紫外誘變選育白地霉GXU08脂肪酶高產菌株[J].生物技術,2007,17(2):42-44.

[13]符小燕,郭善廣,蔣愛民.廣式臘腸中高產脂肪酶葡萄球菌的選育[J].食品與機械,2010(4):5-9.

[14]冀頤之,李政,譚天偉,等.低能N+離子注入選育少根根霉脂肪酶高產菌株[J].食品工業科技,2011(7):197-200.

[15]曹國珍,陸棟,張苗苗,等.重離子輻照釀酒酵母DNA損傷修復途徑研究進展[J].激光生物學報,2013,22(3):201-209.

Research of UV/microwave irradiation for breeding of a high lipase-producing strain

ZHAO Xing-xiu,HE Yi-guo,ZHAO Chang-qing*,FANG Chun-yu,ZHANG Jing,ZOU Wei

(Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

Breeding of a high lipase-producing strain was studied. The original strain H3 was treated by UV mutation,microwave mutation and compound mutation of 40 s UV and 80 s microwave,the optimum effect was determined by comparing with the enzyme activity. The result showed that the enzyme activity of the strain treated by UV mutation and microwave was 57.984 U/mL and 57.1 U/mL. The enzyme activity was improved 38.3% and 36.2% than H3. The enzyme activity of the stain treated by compound mutation was 61.6 U/mL,it was improved 46.85% than H3.

lipase;UV;microwave;compound mutation;the strain producing lipase

2015-01-28

趙興秀(1977-)，女，碩士，副教授，主要從事微生物研究，E-mail：zhaoxingxiu@sohu.com。

*通訊作者:趙長青(1981-)，女，博士，副教授，主要從事微生物研究，E-mail：33137390@qq.com。

四川省教育廳項目(14ZA0206，11ZB244);綠色催化四川省高校重點實驗室項目(LYJ1304);四川理工學院科研項目(2012PY08);釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目(NJ2012-16);瀘州老窖科研獎學金項目(13ljzk05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0192-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.031