卷枝毛霉Δ12-脫飽和酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的高效表達

劉小琳,江賢章,張明亮,黃建忠

(1.福建師范大學閩南科技學院生命科學與化學系,福建泉州 362332;2.福建師范大學生命科學學院福建省現代發酵技術工程研究中心工業微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

卷枝毛霉Δ12-脫飽和酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的高效表達

劉小琳,江賢章,張明亮,黃建忠*

(1.福建師范大學閩南科技學院生命科學與化學系,福建泉州 362332;2.福建師范大學生命科學學院福建省現代發酵技術工程研究中心工業微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

Δ12-脫飽和酶是亞油酸合成的關鍵酶,為提高Δ12-脫飽和酶的活性,本研究利用RT-PCR對Mucor sp. EIM-10的Δ12-脫飽和酶cDNA進行克隆,并導入pYES2.0質粒中,構建重組表達載體。運用醋酸鋰轉化法將重組質粒導入釀酒酵母,成功構建pYMD12釀酒酵母表達系統。為了進一步提高Δ12-脫飽和酶的表達水平,用GAP啟動子替代pYES2.0質粒自帶的啟動子,成功構建pYGAPMD12重組菌。最終產物經GC-MS檢測顯示,pYGAPMD12重組菌轉化C18∶1的轉化率為69.172%,比pYMD12重組菌提高32.771%。本文為進一步提高Δ12-脫飽和酶的表達水平提供參考依據。

Δ12-脫飽和酶,GAP啟動子,釀酒酵母,卷枝毛霉

多不飽和脂肪酸(PUFAs)在機體內具有廣泛的生理功能和生物學效應[1],亞油酸作為一種多不飽和脂肪酸,不僅具有降膽固醇和甘油三酯,預防動脈粥樣硬化的作用,而且還是亞麻酸和花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的合成前體[2]。而Δ12-脂肪酸脫飽和酶[3-4]是脂肪酸生物合成途徑中形成亞油酸(LA)的限速酶,在脂肪酸鏈C12與C13之間插入1個雙鍵,催化油酸轉變為亞油酸[5-6]。

酵母表達系統具有脂肪酸延長酶和脫飽和酶催化所需的各種因子,而且不存在脫飽和酶后的脂肪酸延長酶和脫飽和酶,適用作脫飽和酶的表達系統。釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVSc是一種尿嘧啶合成缺陷型菌株,在不含尿嘧啶的SC-U選擇培養基上不能生長,而釀酒酵母表達質粒pYES2.0可以產生尿嘧啶,可以用來篩選陽性克隆子[7-8]。

圖1 表達載體pYMD12和pYGAPMD12的構建Fig.1 Construction of pYMD12 and pYGAPMD12 vector

本文從Mucorsp.EIM-10中克隆Δ12-脫飽和酶cDNA基因,連接到pYES2.0質粒中,構建重組表達載體,并實現其在釀酒酵母中的表達,為進一步研究脫飽和酶的高效表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與質粒Mucorsp.EIM-10 福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶營養缺陷型INVSc1和pYES2.0載體 Invitrogen公司;pMD-18 Simple T載體 TAKARA公司。

1.1.2 培養基 Sc-U培養基:成分均購自Invitrogen公司,按其操作手冊推薦方法配制;誘導培養基:在SC-U液體培養基中添加2%半乳糖。

1.1.3 主要試劑與儀器 ExTaq DNA聚合酶,限制性內切酶EcoR Ⅰ,XhoⅠ,KpnⅠ和BamH Ⅰ、T4連接酶 TaKaRa公司;亞油酸、棉子糖、Sc-U培養基所需各種氨基酸 sigma公司;其余試劑均為進口或國產分析純,引物合成和測序由上海生工完成。

ABI2720 PCR儀 Amersham Biosciences;JS-380A自動凝膠圖像分析儀 上海培清科技有限公司;高速臺式冷凍離心機 Beckman;氣質聯用儀GC-MS 安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 cDNA序列的克隆 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10的總RNA。以總RNA為模板,以PC1(CCGGAATTCATGGCAACCAAGAGAAACG)和PC2(CCGCTCGAGTTAGTTCTTAAAGAAGACAACATCG)為上下游引物,通過RT-PCR擴增得到Δ12-脂肪酸脫飽和酶cDNA序列。PCR反應條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,循環30次;72 ℃延長10 min;1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收產物。

PC1和PC2引物是根據NCBI已報道的絲狀真菌的Δ12-脂肪酸脫飽和酶基因的保守序列進行設計,以Mucorrouxii delta-12 desaturasegene(登錄號:AY533361)為模板,從頭設計引物,并在PC1和PC2前分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2.2 重組質粒pYMD12的構建與轉化 pYES2.0載體和Δ12-脫飽和酶cDNA分別經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,連接,轉化E.coliDH5α感受態細胞,運用氨芐抗性平板篩選得到陽性克隆子,命名為pYMD12重組質粒(圖1)。運用醋酸鋰轉化法[9],將pYMD12轉化釀酒酵母尿嘧啶營養缺陷型菌株INVSc1感受態,以pYES2.0質粒為空白對照,涂布在Sc-U合成培養基,于28 ℃培養3 d,獲得陽性克隆子。

1.2.3 重組質粒pYGAPMD12的構建與轉化

1.2.3.1 GAP啟動子的克隆 運用堿裂解法,提取畢赤酵母表達載體pGAPZα質粒[10]。以pGAPZα質粒DNA為模板,以Pgap1(CGGGGTACCAGATCTTT TTTGTAGAAATGTCTTGG)和Pgap2(CGCGGATCC ATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGG)為引物進行PCR擴增。PCR反應條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min;循環30次。

Pgap1和Pgap2引物是根據畢赤酵母表達載體pGAPZα中GAP啟動子[11]的序列設計,并分別加入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點。

1.2.3.2 重組質粒的構建與轉化 重組質粒pYMD12和GAP啟動子片段分別于37 ℃水浴,用KpnⅠ和BamHⅠ進行雙酶切,保溫過夜,酶切產物經分別回收后,16 ℃連接過夜,將重組質粒命名為pYGAPMD12,如圖1所示,并轉化大腸桿菌,雙酶切驗證。轉化和篩選方法同1.2.2。

1.2.4 重組質粒的表達 分別挑取SC-U平板上的陽性克隆子pYMD12,pYGAPMD12接種于2 mL SC-U液體培養基中,28 ℃,230 r/min振蕩培養過夜;取2 mL接種于30 mL的SC-U液體培養基中,28 ℃,230 r/min振蕩培養,運用分光光度計測量菌液OD600;培養至OD600=0.2～0.3時,接種pYMD12的培養基中添加2%半乳糖進行誘導,而接種pYGAPMD12的培養基不添加,分別轉至25 ℃,230 r/min振蕩培養72 h。

1.3 測定方法

分別離心收集菌體,提取總油脂并甲酯化,利用安捷倫6890N/5975MS氣相色譜-質譜分析脂肪酸組成。GC-MS分析條件如下[12]:.氣相色譜條件:氣相色譜儀,HP-INNOWax polyethylene glycol極性柱(30.0 m×0.25 mm×φ0.25 μm)。柱加熱程序:150 ℃維持1 min,150 ℃至210 ℃(10 ℃/min),210 ℃保持5 min,210 ℃至230 ℃(2 ℃/min),230 ℃保持4 min,240 ℃保持5 min。進樣口溫度:250 ℃,檢測器溫度:280 ℃,進樣量:1 μL的,分流比:5∶1。質譜條件:質譜儀,檢測器離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;電離能70 eV,電離模式,EI;測量方式:全掃描,掃描范圍:M/Z30-500,1.61scans/s;溶劑切除時間:3 min。

2 結果與討論

2.1 重組質粒pYMD12的構建

2.1.1 總RNA的提取 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10總RNA,在2%瓊脂糖凝膠上明顯出現28S、18S兩條帶(圖2),說明所提RNA的完整性好。

圖2 卷枝毛霉EIM-10總RNAFig.2 Total RNA of Mucor sp. EIM-10

2.1.2 cDNA序列克隆 以Mucorsp.EIM-10總RNA為模板,經RT-PCR擴增到約1200 bp的cDNA序列(圖3)。經NCBI序列比對發現,與Mucorrouxii(登錄號:AF533361.1)同源性高達94%,且該片段具有完整的閱讀框,說明cDNA克隆成功。

圖3 cDNA序列克隆 Fig.3 Coloning of cDNA sequenceM:200 bp DNA marker;1，2：樣品。

2.1.3 重組質粒pYMD12雙酶切驗證 運用EcoRⅠ和XhoI對篩選的陽性克隆子進行雙酶切驗證,如圖4所示:雙酶切結果顯示兩條清晰的條帶且條帶的位置與PCR克隆的結果一致,說明目的片段與pYES2.0載體成功連接。

圖4 雙酶切驗證Fig.4 Digested identification M:200 bp marker;1,2:雙酶切樣品。

2.2 重組質粒pYGAPMD12的構建

2.2.1 GAP啟動子克隆 以pGAPZα質粒DNA為模板,以Pgap1和Pgap2為引物,克隆的GAP片段約為500 bp,且條帶單一。經序列比對,克隆片段與已報道的序列完全一致,說明GAP片段克隆成功,結果如圖5:

圖5 GAP啟動子克隆Fig.5 Coloning of GAP promoterM：200 bp marker;1，2:GAP樣品。

2.2.2 重組質粒pYGAPMD12雙酶切驗證 用kpnⅠ和BamHⅠ對重組質粒pYGAPMD12進行雙酶切驗證,結果顯示兩條清晰的條帶且條帶位置正確(圖6),說明GAP啟動子片段與pYMD12質粒成功連接。

圖6 雙酶切驗證Fig.6 Digested identification M:1000bp marker;1:雙酶切樣品。

2.3 重組質粒pYMD12和pYGAPMD12的轉化

2.3.1 重組釀酒酵母的篩選和鑒定 運用醋酸鋰轉化法將重組質粒pYMD12和pYGAPMD12分別轉入釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc1,涂布在SC-U選擇性培養基上,28 ℃培養3 d至轉化子出現。挑取轉化子進行菌落PCR驗證,結果如圖7、圖8所示,PCR產物大小與預期一致,表明重組釀酒酵母構建成功。

圖7 pYMD12轉化子菌落PCR驗證Fig.7 Identification of pYMD12 transformants by Colony PCRM:200bp marker;1，2:MD12樣品。

圖8 GAP轉化子菌落PCR驗證Fig.8 Identification of GAP by Colony PCRM:200 bp marker;1，2:GAP樣品。

2.3.2 重組釀酒酵母的誘導表達 提取重組菌的總脂肪酸,并甲酯化,GC/MS分析結果顯示:重組菌pYMD12出現了與亞油酸(C18∶2)甲酯標準品相對應的峰(保留時間為10.584 min),而空白對照沒有出現此峰(圖9)。通過質譜分析證明新出現的峰為亞油酸(十八碳二烯酸)甲酯(保留時間為10.584 min)(圖10),說明在半乳糖的誘導下,重組菌pYMD12成功表達的Δ12-脫飽和酶,將底物油酸催化生成亞油酸。

另外,重組菌pYGAPMD12出現了與十六碳二稀酸(C16∶2)甲酯標準品相對應的峰(保留時間為8.115 min),而空白對照和重組菌pYMD12均沒有出現此峰(圖9)。通過質譜分析證明新出現的峰為亞油酸甲酯(保留時間為10.584 min),十六碳二稀酸(保留時間為8.115 min)(圖10)。因此,無需誘導劑半乳糖的作用,重組菌pYGAPMD12表達的Δ12-脫飽和酶也具有催化效率。

圖9 含有重組質粒的酵母脂肪酸甲酯的GC/MS分析Fig.9 GC/MS analysis of fatty acid methyl esters extracted from transformed yeast containing pYMD12

圖10 脂肪酸成分質譜鑒定Fig.10 Identification of fatty acid compositions by mass spectrometry

綜上,由于強啟動子GAP的引入,重組菌pYGAPMD12相比重組菌pYMD12的優勢在于無需誘導劑半乳糖的誘導,且重組菌pYGAPMD12可以催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)。

2.3.3 脂肪酸轉化效率 內源油酸(C18∶1)在Δ12-脫飽和酶的催化下生成亞油酸(C18∶1)的轉化效率為:轉化效率=產物/(底物+產物)×100%。由此可知從油酸到亞油酸,重組菌pYMD12和pYGAPMD12表達的Δ12-脫飽和酶的轉化效率分別為36.401%和69.172%。另外,重組菌pYGAPMD12催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)的轉化效率為32.943%,而重組菌pYMD12不能催化十六碳一稀酸(C16∶1),結果如表1所示。

表1 各表達載體脂肪酸轉化效率

3 結論

本文成功地從Mucor sp.EIM-10中獲得Δ12-脫飽和酶cDNA序列,并將該序列導入pYES2.0載體中,構建成功pYMD12重組質粒。運用醋酸鋰轉化法成功將pYMD12重組質粒轉化進釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc1中,從SC-U缺陷型平板中篩選得陽性克隆子,提取總脂肪酸進行GC-MS檢測分析,結果顯示:內源油酸(C18∶1)在Δ12-脫飽和酶的催化下生成亞油酸(C18∶1)的轉化效率為36.401%。

為了進一步提高表達量,用畢赤酵母表達載體pGAPZα上的GAP強啟動子替代pYES2.0質粒自帶的啟動子,成功構建pYGAPMD12表達載體。轉化表達,提取總脂肪酸進行GC-MS檢測分析,結果顯示:無需半乳糖誘導,pYGAPMD12轉化C18∶1的轉化率為69.172%,相對pYMD12,轉化率提高了32.771%,而且pYGAPMD12可以轉化C16∶1,轉化效率為32.943%。

[1]Mangano KM,Sahni S,Kerstetter JE,et al. Polyunsaturated fatty acids and their relation with bone and muscle health in adults[J]. Current osteoporosis reports. 2013,11(3):203-212.

[2]Okada S,Zhou X-R,Damcevski K,et al. Diversity of Δ12 fatty acid desaturases in Santalaceae and their role in production of seed oil acetylenic fatty acids[J]. Journal of Biological Chemistry. 2013,288(45):32405-32413.

[3]劉永紅,張麗靜,張洪榮,等. Δ12-脂肪酸脫氫酶及其編碼基因研究進展[J]. 草業學報. 2011,20(3):256-267.

[4]Sakuradani E,Kobayashi M,Ashikari T,et al. Identification of Δ12-fatty acid desaturase from arachidonic acid-producing Mortierella fungus by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae and the fungus Aspergillus oryzae[J]. European journal of biochemistry. 1999,261(3):812-820.

[5]馮云,任路靜,魏萍,等. 微生物發酵產二十二碳六烯酸代謝機理的研究進展[J]. 生物工程學報. 2010,26(09):105-109.

[6]Astrid Meyer,Helene Kirsch,Amine Abbadi,et al. Novel fatty acid elongases and their use for the reconstitution of docosahexaenoic acid biosynthesis[J]. Journal of Lipid Research. 2004,45:1899-1909.

[7]Zhang D,Pirtle IL,Park SJ,et al. Identification and expression of a new delta-12 fatty acid desaturase(FAD2-4)gene in upland cotton and its functional expression in yeast and Arabidopsis thaliana plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry. 2009,47(6):462-471.

[8]宋芬芬,江賢章,陳清霞,等. 毛霉Δ6-脂肪酸脫氫酶隨機突變文庫的構建與分析[J]. 微生物學通報. 2011:694-701.

[9]江賢章,秦麗娜,田寶玉,等. 海洋破囊壺菌thraustochytrium sp.fjn-10 dha生物合成途徑相關延長酶的克隆與表達[C]. 全國海洋生物技術與海洋藥物學術會議暨全國海洋藥物學術研討會. 2008,48.

[10]DongYan C,Qian L,XiaoYun H,et al. Progress in GAP promoter derived constitutive expression system of Pichia pastoris[J]. Journal of Food Safety and Quality. 2013,4(4):1217-1221.

[11]蔣慧慧,李豐功,陸毅,等. 三種酵母啟動子在畢赤酵母中的功能比較[J]. 中國生物工程雜志. 2011,31(05):60-68.

[12]陳曉峰,江賢章,毛若雨. 脂肪酸碳鏈延長酶與脫飽和酶在釀酒酵母中共表達[J]. 福建師范大學學報:自然科學版. 2010,4(04):105-109.

Cloning and high expression of Δ12-desaturase genes fromMucorcircinelloidesEIM-10

LIU Xiao-lin,JIANG Xian-zhang,ZHANG Ming-liang,HUANG Jian-zhong*

(1.Department of Chemistry and Life Science,Minnan Science and Technology Institute Fujian Normal University,Quanzhou 362332,China；2.Engineering Research Center of Industrial Microbiology,Engineering Research Center of Fujian Modern Ferment Technology,Ministry of Education,College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China)

Δ12-desaturase plays an important role in the biosynthesis of linoleic acid inMucorspEIM-10. To improve enzymatic on the Δ12-desaturase activity,a recombinant expression vector was constructed. The Δ12-desaturase gene was cloned by RT-PCR technology. The PCR products were ligated into pYES2.0 plasmid. And then the recombinant plasmid(pYMD12)was transformed intoSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1 by lithium acetate method. To improve enzymatic activity,built-in promoter of pYES2.0 was replaced by GAP promoter,another new recombinant expression(pYGAPMD12)were constructed inSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1. Gas chromatography analysis showed that conversion efficiency of pYGAPMD12 was 69.172% and the conversion efficiency of pYMD12 was 36.401%. This paper was provided important reference for further stay of Δ12-desaturase.

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0196-05

2015-01-12

劉小琳(1987-)，女，碩士，助教，研究方向：微生物學，E-mail：liuxiaolin19872@163.com。

*通訊作者:黃建忠(1966-)，男，博士，教授，研究方向：微生物學，E-mail：hjz@fjnu.edu.cn。

福建省發改委產業化項目(閩教發[2010]77號)。

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.032