雙酶水解玉米醇溶蛋白制備抗氧化肽的工藝優化

徐 飛,成向榮,2,Riyadh,施用暉,2,樂國偉,2,*

(1.江南大學食品學院,營養與功能因子中心,江蘇無錫 214122;2.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122)

雙酶水解玉米醇溶蛋白制備抗氧化肽的工藝優化

徐 飛1,成向榮1,2,Riyadh1,施用暉1,2,樂國偉1,2,*

(1.江南大學食品學院,營養與功能因子中心,江蘇無錫 214122;2.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122)

為了制備抗氧化活性肽,利用 Alcalase 堿性蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解玉米醇溶蛋白。在單因素的基礎上,以1.1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基清除率、羥基自由基清除率和水解度(DH)為響應值,采用響應面(RSM)中心組合實驗,選取Alcalase堿性蛋白酶加酶量、中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比、底物濃度為自變量,探討最佳酶解工藝條件。采用Design-Expert軟件,通過響應面優化確定修正后各因素的最佳工藝條件為:Alcalase堿性蛋白酶加酶量12880 U/(g底物)、中性蛋白酶與 Alcalase 堿性蛋白酶活力之比為1∶4,底物濃度為3.4%。在此修正條件下,DPPH· 自由基清除率為42.98%,水解度為32.18%,與預測值的相對誤差為1.04%。濃度為20 mg/mL時,玉米醇溶蛋白的DPPH· 自由基清除率和羥基自由基清除率分別為同濃度VC的85.8%和67.0%。

玉米醇溶蛋白,Alcalase堿性蛋白酶,中性蛋白酶,響應面分析法

生物活性肽是特殊蛋白質分子片段,往往具有眾多的生理活性,如降血壓[1]、降膽固醇[2-3]、抗疲勞[4]、抗腫瘤作用[5],抗氧化作用[6]和促進乙醇代謝[7]等?；钚噪氖翘厥獾牡鞍踪|氨基酸片段,天然狀態下的活性肽含量少,而且不易實現分離[8]。有研究表明,雙酶協同水解比單一的蛋白酶進行水解效果更好,水解度更高[9-11]。目前研究主要以水解度為指標對玉米醇溶蛋白酶解工藝進行優化,但是有研究表明蛋白質酶解產物的水解度與其抗氧化活性在一定范圍內不存在線性關系,抗氧化活性不一定隨著水解度增大而增大[12]。單純的追求高水解度,有可能會使抗氧化活性降低[13]。因此,本文選取水解玉米蛋白常用的Alcalase堿性蛋白酶和中性蛋白酶進行分步酶解實驗,并以DPPH·自由基清除率、羥基自由基清除率和水解度(DH)為檢測指標對酶解工藝進行優化,尋找最佳的水解條件以制備高活性抗氧化活性肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米醇溶蛋白 吳江市八坼藥用輔料廠;Alcalase堿性蛋白酶(20×104U/g) Novo 公司;中性蛋白酶(5×104U/g) 夏盛公司;二苯代苦味?；诫?DPPH·) Sigma公司;福林酚試劑 國藥集團化學試劑有限公司;菲啰啉 國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸 國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑 均為分析純。

高速大容量冷凍離心機 Eppendorf公司;Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S 集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫療儀器廠;FD-1CE冷凍干燥機 北京天佑科技有限公司;DK-600型 電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司;UV-2100 型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙酶分步酶解方法 首先,配制濃度為0.03%的Na2SO3水溶液,量取一定體積加入到水解反應器中,用1 mol/L的NaOH溶液調節pH至8.5,同時將溫度穩定在55 ℃,然后邊攪拌邊快速加入玉米醇溶蛋白粉,形成分散懸浮液,然后加入Alcalase堿性蛋白酶進行水解反應。反應過程中以1 mol/L的NaOH水溶液維持溶液pH恒定。待水解2 h后用0.1 mol/L HCl水溶液調節溶液pH至7.5,溫度降至50 ℃,然后加入適量的中性蛋白酶,水解1 h后立即在95 ℃水浴中靜置滅酶10 min,然后在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,收集上清液,定容到同一濃度進行活性測定。

1.2.2 DPPH·自由基清除能力的測定 將待測樣品定容到同一濃度,取1.5 mL待測樣品,加入 1×10-4mol/L DPPH·的無水甲醇溶液1.5 mL,混合均勻后在室溫下避光反應30 min,然后在517 nm下測定吸光度,空白組以等體積無水甲醇代替DPPH·溶液,對照組以等體積蒸餾水代替樣品,以無水乙醇空白調零[14]。DPPH·自由基清除率的計算公式為:

式中:ODi-樣品組(樣品+DPPH·)；ODj-空白組(樣品+無水甲醇)；OD0-對照組(蒸餾水+DPPH·)。

1.2.3 清除羥基自由基活性的測定 采用Sminoff[15]的水楊酸鈉方法,并略有改動。取2.3mmol/LFeSO4溶液1mL,加入2.3mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液1mL,樣品溶液0.5mL,最后加入1mL2.2mmol/LH2O2溶液,37 ℃反應1h后,于510nm下測定吸光值。計算公式如下:

1.2.4 蛋白含量測定 采用Folin-酚試劑法測定蛋白質含量[16]。

1.2.5 水解度的測定 pH-stat法[17]和甲醛滴定法[18]。

1.3 實驗設計

1.3.1 雙酶分步水解玉米醇溶蛋白的單因素實驗 分別固定Alcalase堿性蛋白酶和中性蛋白酶最適溫度和pH,以Alcalase堿性蛋白酶加酶量、中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比、底物濃度作為實驗因素,以DPPH·自由基清除率、羥基自由基清除率和水解度(DH)作為考察指標進行實驗設計。

1.3.2 雙酶分步水解的響應面優化實驗 固定酶液pH、溫度和酶解時間條件,在單因素實驗基礎上,運用Box-Behnken中心組合設計實驗,選擇Alcalase堿性蛋白酶加酶量(X1)、中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比(X2)、底物濃度(X3)為因素變量,以酶解液DPPH·自由基清除率(Y1)羥基自由基清除率(Y2)和水解度(DH,Y3)為作為響應變量。實驗設計與分析采用Design-expert.V8.0.6。

表1 單因素實驗因素和水平

表2 響應面實驗設計因素水平及編碼

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 Alcalase堿性蛋白酶加酶量對玉米醇溶蛋白水解效果的影響 固定底物濃度4%,中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比為1∶6,考察不同Alcalase堿性蛋白酶加酶量對DPPH·自由基清除、羥基自由基清除率和水解度(DH)的影響,結果如圖1所示。

圖1 Alcalase堿性蛋白酶加酶量對玉米醇溶蛋白水解效果的影響Fig.1 Effect of Alcalase dosage on hydrolysis of zein

由圖1可知,加酶量達到12000 U/(g底物)時,DPPH·自由基清除率達到最大值42.5%;當加酶量達8000 U/(g底物)時,羥基自由基清除率達到最大值37.7%。水解度隨著加酶量的增大而增大,但是DPPH·自由基清除率和羥基自由基清除率達到最大值以后活性反而下降,這可能是由于隨著水解度增大,具有抗氧化活性的多肽繼續水解為無抗氧化活性的短肽或氨基酸,導致抗氧化活性降低[13]。

2.1.2 中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比對玉米醇溶蛋白水解效果的影響 固定底物濃度為4%,Alcalase堿性蛋白酶加酶量為12000 U/(g底物),考察不同中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比對DPPH·自由基清除率、羥基自由基清除率和水解度(DH)的影響。結果如圖2所示。

由圖2可知當中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比達到1∶6之時,羥基自由基清除率達到最大值。酶活力之比為1∶4時,DPPH·自由基清除率達到最大值。圖1和圖2中,隨著中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比以及加酶量增大,水解度也逐漸增大,但當酶活力之比達到一定值以后變化趨于平緩。這可能是由于加酶量過度增大,蛋白酶之間產生競爭性抑制[19],從而限制水解效率。

圖2 中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比對玉米醇溶蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of Neutral protease/Alcalase on hydrolysis of zein

2.1.3 底物濃度對玉米醇溶蛋白水解效果的影響 固定Alcalase堿性蛋白酶加酶量為12000 U/(g底物),中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比為1∶6,考察不同底物濃度對DPPH·自由基清除率、羥基自由基清除率和水解度(DH)的影響。結果如圖3所示。

圖3 底物濃度對玉米醇溶蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on hydrolysis of zein

由圖3可知當底物濃度達到3%時,DPPH·自由基清除率達到最大值;當底物濃度達到4%時,羥基自由基清除率達到最大值。水解度(DH)隨著底物濃度的增大而增大,但整體變化緩慢。這可能是因為濃度過高,不利于玉米醇溶蛋白的充分分散,降低了酶與底物的接觸,從而影響了水解[20]。

綜上所述,響應面實驗設計因素水平及編碼見表2。

2.2 響應面實驗設計及結果

2.2.1 回歸方程的建立 對Alcalase堿性蛋白酶加酶量、中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比、底物濃度3個因素分別在3個水平上進行中心組合設計,共15次實驗,其中12次為分析因子,3次為中心點估計誤差。實驗設計及結果如表3。

由表3可見,達到最大DPPH·自由基清除率、羥基自由基清除率具有一定的相似性,但是抗氧化活性與水解度的因素條件并不完全一致,說明水解度和抗氧化活性之間不是線性關系。

利用Design-Expert軟件對表3中的實驗數據進行回歸分析,以DPPH·自由基清除率(Y1)為因變量,各因素為自變量,對模型進行多次擬合,得到堿性蛋白酶加酶量(X1)、中性蛋白酶/堿性蛋白酶(X2)、底物濃度(X3)為:

Y=43.43+1.15X1+0.15X2+0.19X3-0.047X1X2+0.79X1X3-0.49X2X3-1.18X12-0.88X22-3.85X32

對該模型方程進行方差分析,結果及模型系數顯著性檢驗如表4。

結合軟件分析結果和成本問題,確定制備抗氧化活性肽的最優酶解工藝條件為:Alcalase堿性蛋白酶加酶量為12880 U/(g底物),中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力比例為1∶4,底物濃度為3.4%。在此條件下DPPH·自由基清除率和水解度預測值分別為43.43%和32.84%。

表3 Box-Behnken 實驗設計及結果

表4 玉米醇溶蛋白水解液DPPH·自由基清除能率的回歸模型方差分析及模型系數顯著性檢驗

圖4 酶活力之比和Alcalase 2.4L 加酶量之間的響應面圖Fig.4 The response surface graph between the neutral protease/Alcalase and Alcalase dosage

注:p<0.05.影響顯著;p<0.01.影響極顯著。

2.2.2 響應面分析 各因素對DPPH·自由基清除率的交互作用見圖4、圖5和圖6。圖4可以看出中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比不變,隨著Alcalase堿性蛋白酶加酶量的增加,DPPH·自由基清除率也隨之增加;Alcalase堿性蛋白酶加酶量不變,隨著中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比的增大,DPPH·自由基清除率變化不明顯。

由圖5可見:底物濃度不變,隨著Alcalase堿性蛋白酶加酶量的增加,DPPH·自由基清除率隨之增加,達到最大值時略有下降;Alcalase堿性蛋白酶加酶量不變,隨著底物濃度的增加,DPPH·自由基清除率先上升,達到最大值以后開始下降,變化比較明顯。由圖6可見:底物濃度不變,隨著中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比的增大,DPPH·自由基清除率略有增加,然后趨于平緩;中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶活力之比不變,隨著底物濃度的增加,DPPH·自由基清除率顯著增加,達到最大值后又顯著下降,呈現二次函數關系。

圖5 底物濃度和Alcalase堿性蛋白酶加酶量之間的響應面圖Fig.5 The response surface graph between the substrate concentration and Alcalase dosage

2.2.3 最佳提取工藝的優化及驗證 為驗證模型的可靠性和實驗操作方便,采用修正后的酶解條件即Alcalase堿性蛋白酶加酶量為12880 U/(g底物),中性蛋白酶與堿性蛋白酶活力之比為1∶4,底物濃度為3.4%進行玉米醇溶蛋白的酶解實驗,平行3次,取平均值,測得玉米醇溶蛋白酶解液DPPH·自由基清除率和水解度分別為42.98%和32.18%,與預測值之間的誤差為1.04%,與Design-Expert軟件的預測值基本一致。

圖6 底物濃度和酶活力之比之間的響應面圖Fig.6 The response surface graph between the substrate concentration and neutral protease/Alcalase

2.2.4 抗氧化活性對比分析 將不同濃度的玉米醇溶蛋白抗氧化肽的DPPH·自由基清除率和羥基自由基清除率分別與對應濃度的VC的DPPH·自由基清除率和羥基自由基清除率進行比較,如圖7和8圖所示。

由圖7、圖8可知,當底物濃度為20 mg/mL時,玉米醇溶蛋白的DPPH·自由基清除率和羥基自由基清除率分別為同濃度VC的85.8%和67.0%。

圖7 玉米抗氧化肽與VC的DPPH·自由基清除率Fig.7 The scavenging rate of DPPH· free radical of the Zein peptide and VC

圖8 玉米抗氧化肽與VC的羥基自由基清除率Fig.8 The hydroxyl radical rate of the Zein peptide and VC

3 結論

Alcalase堿性蛋白酶與中性蛋白酶分步酶解的最佳條件為:Alcalase堿性蛋白酶加酶量為12880 U/(g底物),中性蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶為1∶4,底物濃度為3.4%。此條件下,DPPH·自由基清除率最大值為43.43%,水解度為32.84%。實驗結果說明抗氧化活性與水解度之間并不成線性相關。Alcalase堿性蛋白酶和中性蛋白酶分步水解玉米醇溶蛋白工藝是可行的。

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Optimization of dual-enzymatic preparation of antioxidant peptides from zein

XU Fei1,CHENG Xiang-rong1,2,Riyadh1,SHI Yong-hui1,2,LE Guo-wei1,2,*

(1.Institute of Nutrition and Food Safety,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In order to prepare antioxidative peptides,zein powder was subjected to stepwise hydrolysis initially with Neutral protease followed by Alcalase. DPPH· cleavage activity and degree of hydrolysis were used to evaluate antioxidative activity of hydrolysates. Furthermore,response surface methodology(RSM)was employed to optimize hydrolysis conditions,including Alcalase dosage,Neutral protease/Alcalase,and substrate concentration. The modified optimum conditions obtained were as follows:Alcalase dosage of 12880 U/g,Neutral protease/Alcalase of 1∶4,and substrate concentration of 3.4%. Under the modified condition,DPPH· radical scavenging activity of 42.98% and DH of 32.18% were obtained,and the relative error of forecast value was 1.04%. When the concentration was 20 mg/mL,the DPPH· radical scavenging activity and the hydroxyl radical rate were 85.8% and 67% of VC,respectively.

zein;alcalase;neutral protease;response surface methodology

2015-01-13

徐飛(1988-)，男，碩士，研究方向：營養與功能因子,E-mail:edward20130827@163.com。

*通訊作者:樂國偉(1956-)，男，博士，教授，從事分子營養與應用營養研究，E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn。

“十二五”科技支撐計劃(2012BAD33B05)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)21-0218-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.037