響應面法優化超聲提取木槿花多酚的工藝研究

張雪嬌,金晨鐘,2,胡一鴻,2,譚顯勝,何麗芳,王 艷,陳 勇,2,*

(1.湖南人文科技學院農業與生物技術學院,湖南婁底 417000;2.湖南省2011協同創新中心,湖南婁底 417000)

響應面法優化超聲提取木槿花多酚的工藝研究

張雪嬌1,金晨鐘1,2,胡一鴻1,2,譚顯勝1,何麗芳1,王 艷1,陳 勇1,2,*

(1.湖南人文科技學院農業與生物技術學院,湖南婁底 417000;2.湖南省2011協同創新中心,湖南婁底 417000)

以木槿花為原料,利用響應面法對提取木槿花多酚的工藝條件進行優化。在單因素實驗的基礎上,以超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數為影響因素,利用Box-Behnken中心組合方法進行4因素3水平實驗設計,以多酚得率為響應值進行響應面分析。結果表明,最優提取條件是:超聲功率112 W,時間49 min,料液比1∶36(g/mL),乙醇體積分數69%,在此條件下木槿花多酚得率達20.507 mg/g,與理論值20.518 mg/g相近,比用乙醇溶液浸提的多酚得率提高12.91%;超聲波輔助法提取木槿花多酚簡便、提取率高,回歸模型合理可靠,可用于實際預測。

木槿花,多酚,響應面，超聲輔助提取

植物多酚又稱為植物單寧,是植物體內復雜酚類的次生代謝物,其含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素,具有獨特的生理活性和藥用價值[1],在制藥、食品以及精細化工等領域具有廣闊的應用前景。近年來,植物多酚因其在人體健康方面的積極作用成為了研究熱點[2]。研究表明,植物多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗病毒、抗微生物、抗腫瘤、抗輻射、抗誘變、抗衰老以及保護心血管系統等的重要功能[3]。木槿(HibiscussyriacusL.),又名木錦、籬障花、朱槿,為錦葵科木槿屬落葉灌木或小喬木[4],其花、果、根、葉和皮均可入藥。木槿花不僅具有觀賞價值,而且還具有食用和藥用價值。木槿花含有蛋白質、纖維素、胡蘿卜素、多種維生素等大量人體所需營養成分和鈣、鎂、鋅、銅、磷、鉀、硒、鉻等微量元素,并含有肥皂草苷、異牡荊素、皂苷、黃酮類化合物等,具有抗炎、降血脂、抑菌,治療腸風瀉血。目前國內外已經對木槿屬植物進行了一些研究,如張婕等[5]研究了木槿花中花青素的提取;呂惠卿等[4]研究了木槿花中總黃酮的提取;蔡定建等[6]對木槿花揮發油的成分進行了分析;金月亭等[7]對木槿花生物活性進行了初步研究;Bong-SikYun等[8]人從木槿根皮中提取出環狀縮氨酸,具有抗菌、抗癌的功能;Chang等[9]報道木槿屬植物的花青素可以誘導癌細胞凋亡;K.R.Christian等[10]用正己烷、乙酸乙酯和甲醇對三種木槿屬植物的花瓣進行提取,表明其提取物具有抗氧化活性和降低血液黏度的作用。但有關木槿花多酚的研究報道甚少,Folashade B. Awe等[11]在研究一種由可可、木槿花提取物、姜汁混合而成的飲料中發現,木槿花提取物的總酚含量較高,且具有較強的抗氧化活性。

超聲波提取法是通過超聲波的機械破損作用,利用空化效應、機械效應和熱效應破壞植物細胞,使溶媒滲透到植物細胞中,以期達到縮短浸提時間的效果。該方法具有提取溫度低、得率高、操作簡便快捷、成本低廉、提取物結構不易被破壞等特點,目前已廣泛應用于多種天然植物資源,如茶葉[12]、葡萄[13]、石榴[14]、板栗[3]、野木瓜[15]、紫菜[16]、蘋果[17]中多酚的提取,但目前采用該方法對木槿花多酚的提取研究尚未見報道。本研究選用超聲輔助溶劑提取木槿花多酚,運用 Folin-Ciocalteu法測定木槿花多酚的得率,并在單因素實驗的基礎上采用響應面法優化實驗設計,Design-Expert7.0軟件分析數據,確定最佳提取工藝條件,為木槿花多酚的深加工提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木槿花6～9月采自湖南株洲,經湖南省婁底市農科所劉澤發副研究員鑒定為木槿(HibiscussyriacusL.)的花部,凍干,粉碎,80目過篩備用;沒食子酸標準品、福林-酚試劑(FC) 美國Sigma公司;乙醇、Na2CO3(分析純) 天津市光復科技發展有限公司。

SK3300HP型超聲波清洗器 重慶東悅儀器有限公司;UV-1240紫外分光光度計 日本島津;FD-2A冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;D-37520冷凍離心機 Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 福林酚法測定木槿花多酚含量 采用Folin-Cio-calteu法確定最大吸收波長[18-19]。分別量取0.04 mg/mL沒食子酸標準液標準液0.5 mL和樣品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中,加入0.5 mL FC試劑,搖勻,5 min后,加入20% Na2CO3溶液1 mL,混勻后定容,30 ℃下避光反應1.5 h。在330～1100 nm波長范圍掃描,最佳吸收波長為765 nm。繪制以吸光度(A)與濃度(C)的標準曲線,并得到回歸方程為A=2.5618C+0.0169,R2=0.9993。提取液精確吸取0.5 mL,按照上述方法測定,樣品中多酚物質得率(以沒食子酸計,mg/g)GAE=C×V×N/W

式中,C為根據標準曲線求得的樣品濃度值(mg/mL);V為粗提液體積(mL);N為稀釋倍數;W為原料重量(g)。

1.2.2 木槿花中多酚的提取方法 稱取木槿花粉1 g,加入裝有一定濃度乙醇水溶液的100 mL錐形瓶中,用保鮮膜封口,避光放置潤濕20 min,使溶液充分滲入細胞組織內,經超聲一定時間后真空抽濾,然后4000 r/min離心,收集上層清液,定容到50 mL容量瓶中待測,每組做3次平行實驗。

1.2.3 單因素實驗 按照1.2.1中的方法,用超聲波功率130 W、超聲時間(提取時間)40 min、料液比1∶20(g/mL),乙醇濃度60%,作為單因素篩選實驗的基礎條件。研究超聲波功率(80、105、130、155、180 W)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)中的某一因素時,其他條件保持不變,提取多酚,平行實驗3次,測定多酚得率。顯著性差異分析采用SPSS13.0(LSD法,p<0.05),用小寫英文字母在圖表上標注。

1.2.4 超聲波輔助提取木槿花多酚工藝RSM優化實驗 在單因素實驗基礎上,綜合考慮各因素對木槿花中多酚物質得率的影響,采用統計分析軟件Design-Expert7.0建立4因素3水平的響應面分析實驗[20-21],通過實驗確定最優提取工藝,以木槿花多酚得率作為響應值,選擇超聲波功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數為自變量,變量編碼值根據下列方程確定:χi=(Xi-X0)/ΔXi

式中:χi-自變量代碼值;Xi-自變量真實值;X0-在實驗中心點自變量的真實值;ΔXi-自變量的變化步長。自變量X1(超聲功率,W),自變量X2(超聲時間,S),自變量X3(料液比),自變量X4(乙醇體積分數,%)4個自變量因素編碼及水平見表1。

注:對真實值的特征編碼:χ1=(X1-130)/25;χ2=(X2-50)/10;χ3=(X3-35)/5;χ4=(X4-70)/10。

2 結果與討論

2.1 超聲波功率對多酚得率的影響

如圖1A所示,當提取木槿花多酚的超聲波功率設定在80～180 W之間,隨著超聲波功率的增大,多酚得率提高,當功率130 W時多酚得率最高,而當大于功率130 W時,多酚得率略有下降,在一定時間內,超聲波功率越高,體系升溫越快,固液擴散速度也越快,有利于物料中有效成分的浸出。然而,當功率過大時,會破壞多酚的結構,多酚易發生降解,因此選取130 W為最佳提取功率。

圖1 木槿花多酚提取單因素實驗結果Fig.1 Single variable test of polyphenols extraction from Hibiscus syriacus L.

2.2 超聲時間對多酚得率的影響

從圖1B可以看出,當超聲時間為50 min時,多酚得率最高,隨著時間的延長,多酚得率有所下降。其原因可能是超聲時間過長使細胞內溫度升高,以及多酚暴露在空氣中時間的延長,使得多酚發生氧化、縮合、降解等反應的概率增加,導致木槿花多酚的表觀得率下降。因此,選取50 min作為較佳超聲時間。

2.3 料液比對多酚得率的影響

由圖1C可知,隨著料液比的增加,木槿花多酚得率增加,說明溶劑比例大有利于多酚物質的溶出。但當料液比增加到1∶30(g/mL)后,多酚得率基本保持不變,溶劑用量多少,關系生產成本,綜合考慮多酚得率,確定最佳料液比為1∶30(g/mL)。

2.4 乙醇體積分數對多酚得率的影響

如圖1D所示,隨著乙醇體積分數的增加,多酚得率整體呈先升高后降低的趨勢。當乙醇體積分數為60%時提取效果最佳。由于多酚是水溶性物質,根據相似相溶原理,提取多酚需使用與多酚極性相似的溶劑以使其充分溶出。多酚在植物體內常以氫鍵的形式與蛋白質等形成穩定復合物,過低體積分數的乙醇不足以使氫鍵破壞或破壞程度不夠,導致多酚得率不高;過高體積分數的乙醇使溶劑極性降低,導致多酚得率下降,因此,多酚得率在乙醇體積分數為60%～80%之間有所波動,考慮到節省試劑降低提取成本及乙醇體積分數過高會增加脂溶性物質的溶出,不利于后續多酚的分離純化[14],確定最優乙醇體積分數為60%。

2.5 響應面優化實驗

用Design-Expert7.0軟件對實驗數據進行回歸分析。Box-Behnken的4因素3水平實驗共29個實驗點,前24個是析因點,自變量取值在X1,X2,X3,X4所構成的三維頂點;后5個為零點,為區域的中心點,用來估計實驗誤差。木槿花多酚得率見表2。

2.5.1 模型建立與顯著性檢驗 運用De-sign-Expert7.0軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合,獲得響應值-多酚得率(Y)與4個因素(超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積)二次多項式回歸模型:

Y=-221.67+0.12X1+1.70X2+5.36X3+2.84X4+0.0021X1X2-0.0027X1X3+0.00050X1X4+0.0048X2X3-0.00049X2X4-0.0012X3X4-0.00073X12-0.21X22-0.073X32-0.021X42。

表2響應值中木槿花多酚的得率(實驗值)與回歸方程預測值的相關系數R2為0.9489,擬合狀況良好,說明建立的回歸模型可行。對回歸方程系數進行顯著性檢驗(表3),由F值可知4個因素對木槿花多酚得率影響的排序為:超聲功率(X1)>乙醇體積分數(X4)>料液比(X3)>超聲時間(X2)。其中,作用顯著的是X12,極顯著的是X1,X22,X32,X42?？梢?各因素對木槿花多酚得率的影響不是簡單的線性關系。在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項后,對模型式進行優化,其結果:Y=-221.67+0.12X1-0.00073X12-0.21X22-0.073X32-0.021X42。

2.5.2 反應條件的優化及模型驗證 結合回歸模型的數學分析結果,超聲波輔助提取木槿花多酚最佳工藝條件為:超聲功率111.91 W,超聲時間48.91 min,料液比1∶35.68 g/mL，乙醇體積分數69.05%。此時,木槿花多酚的理論得率達20.518 mg/g。為檢驗響應面的可靠性,采用最佳提取工藝條件做木槿花多酚超聲提取的驗證實驗。同時考慮實際操作的局限性,將工藝參數修正為超聲功率112 W,超聲時間49 min,乙醇體積分數69%,料液比1∶36(g/mL)。在此修正條件下做3次平行驗證實驗,測得木槿花多酚得率為20.507 mg/g,與理論預測值20.518 mg/g基本吻合,說明采用響應面法優化得的提取條件準確可靠。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

2.6 超聲波輔助木槿花多酚提取法與溶劑提取法的比較

通過前期單因素和正交實驗,溶劑法提取木槿花多酚的最佳條件為:提取溫度70 ℃,提取時間2 h,乙醇體積分數70%,料液比1∶40(g/mL),在此條件下,其多酚得率為18.163 mg/g(本文具體數據未列出)。在超聲功率112 W,超聲時間49 min,乙醇體積分數69%,料液比1∶36(g/mL)條件下,用超聲波輔助提取法提取木槿花多酚,木槿花多酚得率為20.507 mg/g。相對溶劑提取法,超聲波輔助提取法提取木槿花多酚,得率提高了12.91%。這可能是超聲促使樣品中偶極分子旋轉導致氫鍵破裂及離子遷移,加速了溶劑對樣品的滲透,并使多酚很快溶解于溶劑中;此外,超聲波具有生物效應,也會使樣品細胞壁破裂,從而加速多酚從細胞中釋放[22-23]。

表3 木槿花多酚提取的方差分析

注:**表示p<0.01,極顯著;*表示p<0.05,顯著。

3 結論

采用Folin-Ciocalteu法測定木槿花多酚得率,木槿花多酚的最大吸收峰在波長750 nm處。應用Design-Expert7.0軟件,采用Box-Behnken Design 建立了超聲功率(X1)、超聲時間(X2)、料液比(X3)、乙醇體積分數(X4)與木槿花提取液多酚得率之間數學模型,即:Y=-221.67+0.12X1-0.00073X12-0.21X22-0.073X32-0.021X42?；貧w分析表明,相關系數R2=0.9489,回歸模型顯著,擬合程度好,有實際應用前景。通過顯著性檢驗,各因素的影響排序為:超聲功率(X1)>乙醇體積分數(X4)>料液比(X3)>超聲時間(X2)。

通過單因素和響應面實驗得到最佳超聲波提取條件為:超聲功率112 W,超聲時間49 min,料液比1∶36(g/mL),乙醇體積分數69%。在此條件下做驗證實驗,得到木槿花多酚得率為20.507 mg/g。該值與理論預測值20.518 mg/g基本吻合,說明響應面模型可預測理論得率并用于木槿花多酚提取工藝條件的優化。相比于溶劑浸提法,超聲波輔助提取法木槿花多酚得率提高了12.91%,可顯著縮短提取時間,提高效率,且提取效果好。

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Ultrasonic-assisted extraction technology optimization of polyphenols fromHibiscussyriacusL.

ZHANG Xue-jiao1,JIN Chen-zhong1,2,HU Yi-hong1,2,TAN Xian-sheng1,HE Li-fang1,WANG Yan1,CHEN Yong1,2,*

(1.Department of Agriculture and Biotechnology,Hunan University ofHumanities,Science and Technology,Loudi 417000,China;2.Hunan Provincial Collaborative Innovation Center,Loudi 417000,China)

The ultrasonic-assisted extraction of polyphenols fromHibiscussyriacusL. was optimized by using response surface methodology. According to the previous study of single variable test,an ultrasonic procedure for the extraction of polyphenols fromH.syriacusL.was established. A three-level-four-factor test was employed in this study to optimize the factorial parameters(ultrasonic power,ultrasonic time,ratio of solvents to raw material,and ethanol concentration)by employing Box-Behnken design(BBD)of response surface methodology,and the polyphenols yield was taken as the response of the designed experiments. The results showed that the optimal extraction conditions for the extraction of polyphenols fromH.syriacusL. were ultrasonic power 112 W,ultrasonic time 49 min,ratio of solvents to raw material 1∶36(g/mL),and ethanol concentration 69%,respectively. Under these conditions,the yield ofH.syriacusL.polyphenols was 20.507 mg/g,close to the theoretical value 20.518 mg/g. Extraction rate of the ultrasonic assisted extraction of polyphenols fromH.syriacusL. was increased by 12.91% as compare to the ethanol extraction. The study revealed that this ultrasonic-assisted methodology,which was simply and high efficient,was suitable for extraction ofH.syriacusL. polyphenols,and the regression model was reliable for the yield prediction in practice.

HibiscussyriacusL.;polyphenols;response surface methodology;ultrasonic-assisted technology

2015-03-10

張雪嬌(1985-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產物提取，E-mail:380711974@qq.com。

*通訊作者:陳勇(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：天然產物提取，E-mail：renwen1000@sina.com。

湖南省教育廳項目(13C442)；湖南省自然科學基金(12JJ6019)；湖南省高校產業化培育項目(13CY030)；國家大學生創新性實驗項目(201410553005，2014-502)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)21-0228-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.039