響應面法優化純種米根霉酒曲制備工藝的研究

楊建剛,趙中開,吳赫川,周 健,潘訓海,馬瑩瑩，*

(1.四川理工學院,四川自貢 643000;2.自貢市食品藥品監督管理局,四川自貢 643000)

響應面法優化純種米根霉酒曲制備工藝的研究

楊建剛1,趙中開2,吳赫川1,周 健1,潘訓海1,馬瑩瑩1，*

(1.四川理工學院,四川自貢 643000;2.自貢市食品藥品監督管理局,四川自貢 643000)

以南方秈米為原料,利用單因素實驗和BBD響應面實驗以糖化酶活力為指標對純種米根霉酒曲制備工藝進行研究。主要對影響酒曲糖化酶活力的3個重要因素:培養溫度、培養時間、接種量進行研究。結果表明最佳工藝條件為:培養溫度33 ℃,接種量0.6 mL/瓶,培養時間115 h。在此條件下糖化酶活力的預測值為295.2 U/g。在最佳培養條件下對預測值進行驗證,實測糖化酶活力為290.5 U/g,與模型預測值基本一致,從而驗證了模型的可靠性和實用性。

米根霉,響應面法,酒曲,制備工藝,優化

霉菌作為一種在各種酒曲中都存在的功能菌,是我國酒曲微生物的重要組成部分。霉菌具有糖化力強的優點,并能產生多種影響酒類風味的物質,在酒的發酵過程中發揮著不可替代的作用。常用于釀酒的霉菌主要包括根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)、青霉屬(Penicillium)等[1]。其中米根霉與米曲霉作為兩種糖化力很強的霉菌,廣泛存在于各種酒曲中。呂旭聰等[2]對紅曲中的絲狀真菌進行了研究,在分離得到的43種真菌中發現了11種根霉,其種類數量僅次于曲霉,其中米根霉的出現頻率最高。于博等[3]對廣東肇慶傳統小曲的優勢霉菌進行了分離,得到糖化酶活力強的菌株F6,經鑒定為米根霉。Hye-Ryun Kim等[4]在韓國的傳統酒曲中也發現了米根霉與米曲霉。

在眾多的創新工藝里,以純種根霉代替傳統工藝制曲就是其中很有代表性的一項。相比于傳統小曲,純種根霉曲具有糖化發酵力高、制作周期短、生產成本低等顯著優勢。王新惠[5-6]在米根霉產糖化酶研究中得出反應時間、不同底物、底物濃度、反應溫度、底物pH及金屬離子等因素影響該菌株分泌的糖化酶酶活力。徐成勇[7]、龍可[8]在根霉曲、釀酒小曲研究進展中闡述了米根霉在釀酒生產中的重要地位。本研究參考李云雁[9]、徐向宏[10]、劉寅[11]在響應面實驗設計、數據處理方法,在純種米根霉種曲的制備及工藝條件優化基礎上[12],旨在優化出最佳的純種米根霉酒曲制作工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:米根霉CICC 40467購于中國微生物菌種網,保藏于葡萄糖馬鈴薯瓊脂(PDA)斜面中。

原輔料:南方秈米,市售,含水量12.5%;蒸餾水,符合GB5749-2006《生活飲用水衛生標準》。

恒溫培養箱(LHP-250) 常州普天儀器制造有限公司;生物顯微鏡(BH200) 寧波舜字儀器有限公司;高溫蒸汽滅菌鍋(SYQ-DSX-280B) 申安醫療器誡廠;電子天平(6102) 杭州友恒稱重有限公司;電冰箱(BCD-256L) 青島樂家電器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒曲制作工藝流程 原料(秈米)→淘米→浸米12 h→瀝水→分裝三角瓶25 g→蒸米110 ℃,45 min→降溫→接種米根霉菌懸液→培養→扣瓶 1次/12 h→出曲

1.2.2 工藝操作要點 淘米:除去附在米粒表面的雜質,如糠、塵土及夾雜物等。

浸米:采用蒸餾水在20 ℃的條件下浸泡12 h以上。當米粒從外觀上看透明感消失,變成純白色,用手碾米粒,能將米粒碾碎時,即可將秈米撈出,瀝水30 min,分裝蒸米。

蒸米:每個250 mL三角瓶中分裝25 g生米,用高壓蒸汽滅菌鍋蒸米,條件為110 ℃,45 min。使蒸出的秈米熟而不爛,內無白心生米;降溫:將蒸熟后的米置于接種箱內降溫。

接種:當米的品溫降至約35 ℃時接種米根霉菌懸液(取一支33 ℃條件下培養5 d的米根霉斜面,在超凈工作臺中以無菌操作的方式加入10 mL無菌水,然后用接種環將斜面上的孢子輕輕刮下制成孢子懸液)。

恒溫培養:前24 h為31 ℃恒溫培養,24 h之后調至所需溫度培養;扣瓶:由于菌絲的生長會造成米粒結塊,使米曲的質量下降。因此應及時扣瓶,將結塊的米粒打散。本實驗的扣瓶頻率為1次/12 h。

1.2.3 粗酶液的制備 稱取5 g絕干米曲樣品,置于研缽中充分研磨;然后向研缽中加入25 mL、pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液,繼續研磨至糊狀;用75 mL蒸餾水將其完全轉移至250 mL燒杯中,35 ℃水浴浸提1 h,期間每15 min攪拌1次;浸提完成后以脫脂棉過濾,濾液即為供試酶液[13]。

1.2.4 糖化酶活力的測定糖化酶活力的定義 1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)于40 ℃、pH4.6的條件下,1 h分解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖即為一個酶活力單位,以U/g(或U/mL)表示[13]。測定方法:采用GB8267-2006中規定的方法對曲的糖化酶活力進行測定[14]。

1.2.5 單因素實驗 首先利用溫度、接種量、培養時間三個單因素進行實驗分析(單因素實驗結果均為兩次實驗的平均值),找出各因素的水平范圍,然后通過BBD響應面實驗確定最佳制曲工藝。

1.2.5.1 制曲時間對糖化酶活性的影響 分別采用2、3、4、5、6 d的制曲時間進行單因素實驗,培養結束后,取樣測糖化酶活力。單因素實驗中溫度為35 ℃,接種量為0.5 mL/瓶,每12 h翻曲一次。

1.2.5.2 接種量對糖化酶活性的影響 分別采用0.1、0.3、0.5、1、1.5、2 mL/瓶的接種量進行單因素實驗,培養結束后,取樣測糖化酶活力。該單因素實驗中溫度為35 ℃,培養時間為4 d,每12 h翻曲一次。

1.2.5.3 培養溫度對糖化酶活性的影響 分別在29、31、33、35、37 ℃下進行制曲實驗,培養結束后,取樣測糖化酶活力。該單因素實驗中接種量為0.5 mL/瓶,制曲時間為4 d,每12 h翻曲一次。

1.2.6 響應面實驗 為了研究不同因素對米根霉曲糖化酶活力的影響并確定最佳制曲條件,本實驗選擇對曲糖化酶活力影響較大的3個因素(培養溫度、接種量、培養時間)做響應面回歸分析,實驗因素水平表見表1。

表1 實驗因素水平表

1.2.7 數據處理方法 利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養時間對米根霉曲糖化酶活力的影響 實驗結果如圖1所示。

圖1 培養時間對米根霉曲糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of culture time on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

由圖1可知,當培養時間在2～6 d時,糖化酶活力隨培養時間的增加先上升后下降,在4 d時糖化酶活力達到最大,隨著培養時間的繼續延長,糖化酶活力開始逐漸降低。在小曲中優良根霉的分離篩選及產酶條件研究[15]中顯示,分離的根霉菌株培養3、4 d有利于其生長和產酶,與本實驗結果相符。因此,在響應面實驗中選擇3、4、5 d三個培養時間。

2.1.2 接種量對米根糖化酶活力的影響 結果如圖2所示。

圖2 接種量對米根糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculation quantity on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

由圖2可知,當接種量在0.1～2 mL/瓶的范圍內變化時,糖化酶活力先快速上升而后逐漸下降。當接種量為0.5 mL/瓶時,糖化酶活力最高,隨著接種量的繼續增大,糖化酶活力開始逐漸降低。分析原因,當接種量較大,營養物質都用來米根霉自身生長,較早進入衰老期,不利于代謝產物的合成分泌,因此,合適的接種量有利于米根霉在較短的時間內產生更多高活性的糖化酶[16]。因此,在響應面實驗中選擇0.1、0.5、1 mL/瓶三個接種量。

2.1.3 溫度對米根霉曲糖化酶活力的影響 由圖3可知,隨著溫度的升高,糖化酶活力呈現出先升高后降低的變化規律,在33 ℃時,糖化酶活力最高。當溫度大于33 ℃時,糖化酶活力開始逐漸降低。究其原因,可能是因為在溫度較低時,米根霉的生長不旺盛,產酶量較低,而溫度過高時同樣也會對米根霉的生長產生抑制,使曲的糖化酶活力較低。在米根霉液態發酵產糖化酶工藝條件研究[17]中,米根霉在32 ℃條件下發酵產糖化酶活力最高,與本研究相符。因此在設計響應面實驗時,選用31、33、35 ℃三個培養溫度。

圖3 溫度對米根霉曲糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

2.2 響應面實驗

該響應面實驗共包含15個實驗點,這15個實驗點大體可分為兩類:一類是析因點,是自變量取值在正方體棱的中間處的實驗點,共有12個;另一類是零點,是自變量取值在正方體中心的實驗點,零點實驗共重復3次,用來估計實驗誤差。

表2 響應面實驗設計及結果

利用Design-Expert軟件對實驗數據進行二次回歸分析,最終得到的回歸方程為:Y=263.82-2.38A+25.74B+74.75C+19.56AB-27.52AC+5.80BC-127.46A2-96.83B2-49.56C2,R2=0.9605。然后,對回歸模型進行方差分析,結果見表3。

從表3可以看出,此模型的p<0.01,說明該響應面回歸模型達到極顯著水平。其決定系數R2=0.9605,表明模型中96.05%的數據可用這個模型解釋。本實驗所建模型中C、A2、B2、C2對糖化酶活力的影響顯著(p<0.05),失擬項數據分析表明該模型失擬不顯著,因此該二次模型能夠較好地擬合真實的響應面數據。

2.2.1 模型分析討論 利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行處理,得到響應曲面(RSM)的三維圖,其綜合反映了各變量與響應值之間、變量與變量之間的關系。

培養溫度和接種量的交互作用：由圖4可知,響應曲面的坡度較為陡峭,表明響應值(糖化酶活力)對培養溫度和接種量的改變較為敏感。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用較弱,對糖化酶活力的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析

圖4 培養溫度和接種量的響應面Fig.4 Response surface plot of the culture temperature and inoculation quantity

注:R2=0.9605;p<0.01為極顯著,用**表示;0.010.05為不顯著。

培養溫度和培養時間的交互作用：由圖5可知,響應曲面的坡度較為陡峭,表明響應值(糖化酶活力)對培養溫度和培養時間的改變較為敏感。當培養時間保持不變時,隨著培養溫度的升高,糖化酶活力先快速升高再緩慢下降;當培養溫度保持恒定時,隨著培養時間的延長,糖化酶活力先快速增加而后趨于平穩。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用較弱,對糖化酶活力的影響不顯著。

圖5 培養溫度和培養時間的響應面Fig.5 Response surface plot of the culture temperature and culture time

接種量和培養時間的交互作用：由圖6可知,響應曲面的坡度較為陡峭,表明響應值(糖化酶活力)對接種量和培養時間的改變較為敏感。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用較弱,對糖化酶活力的影響不顯著。

圖6 接種量和培養時間的響應面Fig.6 Response surface plot of the inoculation quantity and culture time

2.2.2 驗證實驗 在以上實驗結果分析及模型擬合的基礎上,利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對制曲工藝進行優化,得到其最佳工藝養條件為:培養溫度32.84 ℃,接種量0.56 mL/瓶,培養時間4.79 d。在此條件下糖化酶活力的預測值為295.20 U/g。在最佳培養條件下(33 ℃、0.6 mL/瓶、115 h,實際實驗參數)對預測值進行驗證,實際測得的糖化酶活力為(290.46±4.4)U/g,與計算機預測值基本一致,表明預測值和真實值之間擬合較好,驗證了模型的可靠性。

王新惠等[6]曾利用黃豆粉麩皮液體培養基對米根霉產糖化酶的發酵條件作了研究,其糖化酶活力最高達到135 U/g,遠低于本實驗最佳工藝下的糖化酶活力。對實驗過程分析后發現,二者所采用的培養基存在較大的區別。在劉達玉等的實驗中以黃豆粉和麩皮為培養料,并制成液體培養基進行振蕩發酵培養;而在本實驗中則是用秈米固體培養基以恒溫靜置的方式培養。因此推斷,與王新惠等的實驗結果相比較,本研究在培養基上的巨大差異應為實驗結果區別較大的主要原因。

3 結論

通過BBD響應面實驗對影響米根霉(CICC 40467)曲糖化酶活力的3個主要因素(培養溫度、培養時間、接種量)及制曲的最佳工藝條件進行了研究,結果顯示回歸模型是顯著的。利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對制曲工藝進行優化,得到其最佳工藝條件為:培養溫度33 ℃,接種量0.6 mL/瓶,培養時間115 h。在此條件下糖化酶活力的預測值為295.2 U/g。在本實驗最佳培養條件下對預測值進行驗證,實際測得的糖化酶活力為290.5 U/g,與模型預測值基本一致,從而驗證了模型的可靠性。

隨著白酒行業的發展,純種根霉酒曲替代傳統小曲應用于小曲酒的生產勢不可擋,在這種情況下,必然會有越來越多的小曲酒企業應用這種工藝。在這種背景下,本實驗達到了預期的效果,同時為接下來的純種根霉酒曲釀酒實驗奠定了基礎。

[1]譚映月,胡萍,謝和.我國白酒釀造微生物多樣性的研究現狀及展望[J].釀酒科技,2011,(11):100-105.

[2]Lv XC,Huang ZQ,Zhang W,et al. Identification and characterization of filamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing[J]. The Journal of General and Applied Microbiology，2012,58(1):33-42.

[3]于博,董開發,張鳳英.廣東肇縣傳統酒曲優勢霉菌的分離及鑒定[J].中國食品學報,2007,(1):95-98.

[4]Hye-Ryun Kim,Jae-Ho Kim,Dong-Hoon Bai,et al. Identification and characterization of useful fungi with α-amylase activity from the Korean traditional Nuruk[J]. Mycobiology，2011,39(4):278-282.

[5]王新惠,李再新,劉達玉,等.米根霉糖化酶酶促反應條件的研究[J].食品科技,2008,(5):26-29.

[6]王新惠,劉達玉.米根霉產糖化酶發酵條件的研究[J].中國釀造,2009,(9):85-87.

[7]徐成勇,郭波,周蓮,等.釀酒小曲研究進展[J]. 食品與發酵工業,2002,28(3):72-75.

[8]龍可,趙中開,馬瑩瑩,等.釀酒根霉菌研究進展[J].現代食品科技,2013,29(2):443-447.

[9]李云雁,胡傳榮.實驗設計與數據處理[M].北京:化學工業出版社,2008.

[10]徐向宏,何明珠.實驗設計與Design-Expect、SPSS應用[M]. 北京:科學出版社,2010.

[11]劉寅,張永光,張汝兵,等.響應面法優化產酸丙酸桿菌丙酸發酵條件的研究[J]. 食品工業科技,2010,(5):167-170.

[12]楊建剛,趙中開,馬瑩瑩. 純種米根霉種曲的制備及工藝條件優化[J]. 釀酒科技,2014,(9):33-41.

[13]沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京:中國輕工業出版社,2014:618-619.

[14]GB8267-2006:食品添加劑-糖化酶制劑. 中華人民共和國國家標準,2006.

[15]葉磊. 小曲中優良根霉的分離篩選及產酶條件研究[D]. 西南大學，2009.

[16]Ali Oguz Büyükkileci,Haluk Hamamci,Meral Yucel. Lactate and ethanol production by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and activities of related pyruvate branch point enzymes[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2006,(102):464-466.

[17]林曉慶,黃志清,劉志彬,等.米根霉液態發酵產糖化酶工藝條件研究[J].釀酒科技,2014,(9):9-13.

Study on the optimum technique of koji-making in pureRhizopusoryzaewith response surface methodology

YANG Jian-gang1,ZHAO Zhong-kai2,WU He-chuan1,ZHOU Jian1,PAN Xun-hai1,MA Ying-ying1,*

(1.Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.Zigong Food and Drug Administration,Zigong,643000,China)

South indica rice was used for raw material and single factor experiment and BBD response surface methodology were applied to optimize the preparation technology of pureRhizopusoryzaekoji with saccharifying enzyme activity as an index. Three important factors(culture temperature,culture time,inoculating quantity)that had effects on Koji saccharifying enzyme activity and the optimum preparation technology condition were studied. Result showed that the process conditions as follows:culture temperature was at 33 ℃,the inoculating quantity was 0.6 mL/flask,and culture time was 115 h. In this condition,the predictive value of saccharifying enzyme activity was 295.2 U/g. And this prediction was verified under the optimum culture conditions. It showed that the actual measured saccharifying enzyme activity was 290.5 U/g. The predicted and measured were basically in accordance,which was verified the model was reliable and practical.

Rhizopusoryzae;response surface methodology;koji;processing;optimum

2015-01-28

楊建剛(1961-)，男，博士，研究方向：食品發酵與釀造技術,E-mail：jgyang29@163.com。

*通訊作者:馬瑩瑩(1963-)，女，碩士，研究方向：食品發酵與釀造技術，E-mail：xidaya@163.com。

四川省(科技廳)科技創新苗子工程(2015022)；四川理工學院人才引進項目(2015RC14)；四川省大學生創新創業訓練計劃(201510622055)；四川理工學院培育項目基金(2014PY05)。

TS261

B

1002-0306(2015)21-0232-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.040