Plackett-Burman設計和響應面法優化超聲協同酶法提取雞油菌多糖工藝

孟雅紅,李 輝

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

Plackett-Burman設計和響應面法優化超聲協同酶法提取雞油菌多糖工藝

孟雅紅,李 輝*

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

為優化超聲波協同酶法提取雞油菌子實體中多糖的工藝條件,在單因素實驗的基礎上,首先采用Plackett-Burman實驗設計篩選出影響雞油菌多糖得率的四個主要因素:酶解pH、固液比、超聲功率和酶解時間。隨后以雞油菌多糖得率為響應值,采用Box-Behnken實驗設計及響應面分析法優化提取條件,得到最佳提取工藝參數為:酶解pH5.5、固液比1∶46(g/mL)、超聲功率210 W、酶解時間68 min。在此條件下多糖理論得率為12.08%、實際得率為11.91%、相對誤差1.41%,表明Plackett-Burman設計結合響應面分析法可以很好地對雞油菌多糖超聲協同酶法提取工藝進行優化,可為雞油菌多糖的廣泛應用提供一定的技術支撐。

雞油菌多糖,Plackett-Burman設計,超聲波,纖維素酶

雞油菌(Cantharellescibarius)是一種外生根真菌,又稱為黃絲菌、杏菌、雞蛋菌,屬真菌界(Kingdomfungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、同擔子菌綱(homobasidiomycetes)、雞油菌目(Cantharellales)、雞油菌科(Cantharellaceae)和雞油菌屬(cantharellus),在我國主要分布于吉林、甘肅、江蘇、廣西、西藏、云南、四川等地[1]。雞油菌子實體富含碳水化合物、蛋白質、粗脂肪、膳食纖維、維生素及多種礦質元素,不但味道鮮美,而且還具有和胃、利肺、益腸、清肝、明目、減肥、美容抗衰老等功效[2]。多糖是雞油菌的主要活性成分,研究發現雞油菌多糖具有顯著的免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗突變、抗癌、降血壓、降血糖等功能[3-5]。因此研究雞油菌多糖的提取分離技術,對于進一步開發雞油菌相關保健產品和指導其精深加工具有重要意義。

關于雞油菌多糖提取工藝的報道主要集中在熱水浸提法[3]、微波萃取法[6]和超聲波萃取法[7]。超聲波提取中的次級振動效能能加速多糖的擴散釋放并充分與溶劑混合,有利于多糖的溶出[8]。酶處理不僅可以有效破壞細胞壁,使提取傳質阻力減小,提高多糖得率,同時還能保持多糖的生物活性[9]。目前,采用超聲波-生物酶協同技術提取雞油菌多糖的研究則尚未見報道。本實驗采用Plackett-Burman實驗設計和響應面分析法對雞油菌多糖的超聲協同酶法提取工藝進行優化,旨在提高雞油菌多糖的得率,為雞油菌資源的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞油菌 購自云南楚雄南華縣,野生菌;纖維素酶(酶活力22 IU/g) 購自百麥綠色生物能源有限公司;葡萄糖、無水乙醇、石油醚、濃硫酸、苯酚、檸檬酸、檸檬酸鈉等均為分析純;實驗用水為超純水。

Q-250B3型高速多功能粉碎機 上海冰都電器有限公司;SJIA-10N型真空冷凍干燥機 寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;AS-10200BT型超聲波清洗儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;UV-1800PC型紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;DK-8D超級恒溫水浴槽 上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞油菌多糖的提取工藝流程 雞油菌子實體→挑選,清洗→干燥→粉碎→石油醚脫脂→乙醇除低聚糖→纖維素酶酶解→超聲波提取→90 ℃滅酶30 min→離心(5000 r/min,10 min)→取上清液→定容→稀釋→測量吸光度→計算雞油菌多糖得率

1.2.2 雞油菌多糖的測定

1.2.2.1 標準曲線的制備 采用苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖(0.1 mg/mL)作為標準品繪制標準曲線(該實驗測定時的最大吸收波長為490 nm,標準曲線方程:A=10.861C-0.0091,式中C為葡萄糖濃度,A為吸光度,R2=0.9972,即葡萄糖含量在0.02～0.08 mg/mL范圍內與吸光度呈現良好的線性關系)。

1.2.2.2 樣品多糖含量的測定 吸取稀釋后的樣品1 mL于比色管中,以空白液作為對照,用苯酚-硫酸法于波長為490 nm處測定吸光度,根據標準曲線方程計算多糖含量,從而得各實驗組雞油菌多糖得率。

式中,W:多糖得率(%);C:多糖濃度(mg/mL);V:定容體積(mL);N:稀釋倍數;M:樣品質量(g);10-3:換算單位。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 單因素實驗 準確稱取一定量預處理后的雞油菌子實體粉末,設定固液比1∶40(g/mL)、酶用量7.5 IU/g、酶解pH4.8、酶解溫度50 ℃、酶解時間60 min、超聲溫度50 ℃、超聲功率240 W、超聲時間20 min,固定其中7個條件,以雞油菌多糖得率為響應值,分別考察不同固液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)、酶用量(2.5、5、7.5、10、12.5 IU/g)、酶解pH(3.2、4.0、4.8、5.6、6.4)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)、酶解時間(20、40、60、80、100 min)、超聲功率(60、120、180、240、300 W)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)和超聲時間(10、20、30、40、50 min)對雞油菌多糖提取效果的影響。

1.2.3.2 Plackett-Burman實驗 Plackett-Burman設計是一種兩水平的實驗設計方法,它基于非完全平衡塊原理,可以用最少實驗次數估計出因素的主效應,適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素[11-12]。在單因素實驗的基礎上,以雞油菌多糖得率作為響應值,對8個影響因素進行評價,篩選出主效應因子,每個因素選兩個水平,共12組實驗。實驗因素及水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素及水平

1.2.3.3 響應面實驗設計 依據Plackett-Burman實驗結果,選取固液比、酶解pH、超聲功率和酶解時間作為響應面設計的4個因素,運用響應面分析法對雞油菌多糖提取條件進行優化。實驗因素及水平編碼如表2所示。

表2 響應面設計的因素和水平

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 固液比對多糖得率的影響 如圖1所示,多糖得率隨著提取液用量的增加而增加。當固液比小于1∶40(g/mL)時,多糖得率增加速度較快,而超過1∶40(g/mL)時,多糖得率的變化較小,基本呈持平趨勢。這可能是當固液比較小時,物料粘度過大,多糖不能充分溶出,當達到適當的固液比時,多糖幾乎完全溶出,因而繼續增加固液比,得率增加不明顯。因此,兼顧多糖得率、試劑消耗量及后續處理,選擇1∶40(g/mL)為最佳固液比。

圖1 固液比對雞油菌多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of polysaccharides

2.1.2 酶用量對多糖得率的影響 如圖2所示,多糖得率隨著酶用量的增大而不斷增加。當酶用量從2.5 IU/g增至7.5 IU/g時,多糖得率顯著增加,此后再增加酶用量,多糖得率增幅不明顯。這是因為隨著酶用量的增大,酶與底物接觸的機會增加,同一時間內水解破壞含纖維質細胞壁的比例增加,致使多糖更多溶解出來,當酶用量從7.5 IU/g增至12.5 IU/g時,酶分子趨于飽和,一部分酶分子沒有機會與底物結合,因此盡管酶用量增加,但得率增加并不明顯,還造成了纖維素酶的浪費。因此選擇7.5 IU/g為最佳酶用量。

圖2 酶用量對雞油菌多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on yield of polysaccharides

2.1.3 酶解pH對多糖得率的影響 如圖3所示,多糖得率隨pH的增加先升高后下降。在pH為5.6時,多糖得率達到最大值。這是因為纖維素酶的最佳作用pH為3.0～6.0,在此范圍內纖維素具有較佳的活力,可加速雞油菌細胞壁中纖維素的降解,使多糖得率增加。因此選擇5.6為最適酶解pH。

圖3 酶解pH對雞油菌多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH on yield of polysaccharides

2.1.4 酶解溫度對多糖得率的影響 如圖4所示,在一定溫度范圍內(30～50 ℃),隨著溫度的升高,雞油菌多糖得率也隨之增加,這是因為溫度的升高使纖維素酶活力增強,提高了酶解反應速度,加快了細胞壁中纖維素的降解,使多糖得以更快更多溶出。當溫度超過50 ℃時,多糖得率開始下降。這可能是因為過高的溫度會導致部分酶的活力喪失。因此選擇50 ℃為最適酶解溫度。

圖4 酶解溫度對雞油菌多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on yield of polysaccharides

2.1.5 酶解時間對多糖得率的影響 如圖5所示,隨酶解時間的增加,多糖得率先增加后略有降低。這可能是因為酶解時間過長會導致多糖分解或結構發生變化。酶解60 min時多糖得率達最大值。因此選擇60 min為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對雞油菌多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of polysaccharides

2.1.6 超聲溫度對多糖得率的影響 如圖6所示,當溫度為50 ℃時,多糖得率達到最大值。當溫度大于50 ℃時,多糖得率反而下降,這可能是因為溫度過高導致多糖被降解或破壞,造成得率的降低。因此選擇50 ℃為最佳超聲溫度。

表3 Plackett-Burman實驗設計及結果

圖6 超聲溫度對雞油菌多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides

2.1.7 超聲功率對多糖得率的影響 如圖7所示,隨著超聲功率(60～240 W)的增大多糖得率增加,當超聲功率高于240 W時,多糖得率反而下降,這可能是由于大功率的超聲波物理剪切作用使多糖的糖苷鍵被打斷,多糖結構被破壞,造成多糖得率降低[13]。因此,選擇240 W為最佳超聲功率。

圖7 超聲功率對雞油菌多糖得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

2.1.8 超聲時間對多糖得率的影響 如圖8所示,雞油菌多糖得率隨著超聲時間的延長而增加,當超聲時間大于30 min時,多糖得率的增加趨于平緩。這說明多糖提取過程與超聲波處理時間密切相關,超聲波處理時間短,多糖溶出的不充分;隨著超聲時間的增長,由于超聲波的空化效應作用力有所減少,從而造成多糖得率增加趨于平緩。因此,選擇30 min為最佳超聲時間。

圖8 超聲時間對雞油菌多糖得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

2.2 Plackett-Burman實驗

本實驗選用n=12的PB實驗設計模塊,對固液比(A)、酶用量(B)、酶解pH(C)、酶解溫度(D)、酶解時間(E)、超聲功率(F)、超聲溫度(G)、超聲時間(H)這8個待選因素進行評價,篩選出對雞油菌多糖得率影響較為顯著的幾個因素。實驗設計及結果見表3,經Minitab15軟件處理得到顯著性檢驗結果見表4?？梢钥闯?酶解pH、固液比、超聲功率3個因素為極顯著影響因素(p<0.01),酶解時間(p=0.014)對多糖得率的影響也顯著,故選取8個因素中T值絕對值較大的4個因素作為主效應因素進行后續的響應面優化;對于其余的因素,在后續實驗中均選擇單因素實驗中的最優水平,具體取值為:酶用量7.5 IU/g、酶解溫度50 ℃、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃。

表4 Plackett-Burman實驗統計分析

2.3 響應面法分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 根據單因素實驗和Plackett-Burman實驗結果,選取固液比(X1)、酶解pH(X2)、超聲功率(X3)和酶解時間(X4)為自變量,以多糖得率(Y)為響應值,利用Minitab15軟件根據Box-Behnken原理進行響應面設計,優化雞油菌多糖提取工藝,以1、0、-1分別代表自變量的三個水平,實驗設計方案及結果見表5。

表7 回歸模型方差分析

表5 Box-Behnken響應面實驗設計

運用Minitab15數據統計分析軟件使用未編碼單位對實驗結果進行多元回歸擬合,回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表6?？梢钥闯?4個因素對多糖得率影響大小的排序為:X1>X4>X3>X2;X12、X22、X32、X42、X1X2、X1X3、X1X4,X3X4極顯著地影響多糖得率(p<0.01);X2(酶解pH)對得率有顯著影響(p<0.05),而X2X3和X2X4的影響不顯著(p>0.05)。由此可知,各影響因素對于多糖得率的影響不是簡單的線性關系。

采用逐步回歸得到X1(固液比)、X2(酶解pH)、X3(超聲功率)和X4(酶解時間)與Y(雞油菌多糖得率)之間的二次多項回歸方程:Y=11.94+0.264X1-0.067X2-0.128X3+0.133X4-0.427X12-1.046X22-0.325X32-0.621X42-0.123X1X2-0.178X1X3+0.363X1X4+0.01X2X3+0.003X2X4-0.27X3X4

表6 回歸方程偏回歸系數估計值

注:*在0.05水平顯著;**在0.01水平顯著。

圖9 兩因素交互作用對多糖得率的響應曲面圖Fig.9 Response surface plots for operating parameters on yield of polysaccharides

2.3.2 響應曲面分析 圖9直觀地給出了各個因子交互作用的響應面和等高線分析圖。從響應面中可以確定最佳因素的水平范圍,而等高線的形狀反映出交互作用影響效應的強弱與大小,橢圓形表示兩種因素的交互作用影響顯著,而圓形則表示兩種因素的交互作用影響不顯著。

由圖9a、圖9b、圖9c可以看出,隨著固液比的增加,多糖得率先增大后減小,在固液比約為1∶40～1∶50(g/mL)時,得率較高。固液比對得率的影響較大,溶劑量少時,物料粘度大,擴散速度慢,難以保證物料中大部分多糖成分溶到提取液中,使提取不完全;溶劑量過大,溶液中多糖濃度低,處理操作過程中易丟失多糖物質,因此會減少多糖得率。

由圖9c、圖9d、圖9f可知,酶解時間對得率的影響也較大,酶解時間過短或過長,均使多糖得率降低,這是由于酶解時間短影響多糖溶出量,酶解時間長雜質溶出量增多、多糖分解,因此本實驗選擇其最有效酶解時間為50～70 min。

由圖9b、圖9d、圖9e可以看出,隨著超聲功率增大,多糖得率逐漸提高,但太大的超聲功率也會降低多糖得率,因此超聲功率需控制在合適的范圍內。超聲波對多糖提取的影響非常顯著,超聲波可產生橫向振動和縱向振動,隨著超聲功率增大,振動程度、空化現象較劇烈,破壞了細胞壁的組織和細胞,胞內多糖不斷溶出,利于多糖的提取[14];當超聲功率增大到一定程度后,多糖得率反而降低,這可能是由于超聲功率過大時,多糖結構被破壞。

由圖9a、圖9e、圖9f可知,多糖得率隨酶解pH的增大而提高,當pH約為4.0～5.6時,得率提高的速率較快,當酶解pH超過5.6后,得率開始下降,可能是由于pH的升高影響了酶與底物的親和力,破壞了酶的活性[15],因此酶解pH需控制在合適的范圍內。

由等高線圖可知,固液比與酶解pH、固液比與超聲功率、固液比與酶解時間、超聲功率與酶解時間的等高線趨于橢圓形,表示交互作用顯著;而酶解pH與超聲功率、酶解pH與酶解時間的等高線趨于圓形,表示交互作用不顯著。

2.3.3 確定最優值和回歸模型的驗證實驗 對回歸方程中四個因素分別求偏導,并令等式為零,解方程可得到四個因素的最佳水平值,分別為:X1=0.59、X2=-0.07、X3=-0.53、X4=0.40,提取的最佳條件為:固液比1∶45.9(g/mL)、酶解pH5.54、超聲功率208.2 W、酶解時間68 min、此時雞油菌多糖得率為12.08%。與靳文娟[16]等報道的超聲波法提取雞油菌多糖(得率為4.72%)相比,超聲協同酶法顯著地提高了雞油菌多糖的得率?？紤]到實際操作的局限性,同時達到節省時間、提取效果好的目的,將雞油菌多糖的浸提工藝條件修正為:固液比1∶46(g/mL)、酶解pH5.5、超聲功率210 W、酶解時間68 min。在此條件下,雞油菌多糖得率為11.91%,表明響應面分析的優化結果與實際值相吻合,具有一定的實用價值。

3 結論

通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗設計以及在此基礎上四因素三水平響應面法實驗,建立了響應值與各因素之間的數學模型,依此模型預測了雞油菌多糖的理論得率,并結合實際操作,確定雞油菌多糖提取的最佳工藝參數:固液比1∶46(g/mL)、酶解pH5.5、超聲功率210 W、酶解時間68 min、酶用量7.5 IU/g、酶解溫度50 ℃、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃,雞油菌多糖理論得率可達12.08%,實際測定值為11.91%,相對誤差1.41%,表明Plackett-Burman設計與響應面分析方法(RSM)相結合可以快速、有效地從眾多影響雞油菌多糖得率的因素中篩選出比較重要的影響因素并實現其水平優化,優化結果與實際多糖得率吻合較好。同時也表明超聲波輔助纖維素酶提取方法簡單、效率高,可作為雞油菌多糖的提取工藝。

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Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic extraction of polysaccharides fromCantharelluscibariusby Plackett-Burman design and response surface methodology

MENG Ya-hong,LI Hui*

(Kunming University of Science and Technology,Yunnan Province Food Safety Research Institute,Kunming 650500,China)

To optimize the ultrasinic-assisted enzymatic extraction of polysaccharides fromCantharelluscibarius,on the base of the single factor experiment results,enzymatic hydrolysis pH,solid-liquid ratio,ultrasonic power and enzymatic hydrolysis time were identified as main factors that influence polysaccharides yield with the Plackett-Burman experiment design firstly. Then the Box-Behnken experiment design and response surface analysis were adopted to optimize the extraction conditions with polysaccharides yield as the response value. The optimized technological parameters were as follows:pH5.5,solid-liquid ratio 1∶46(g/mL),ultrasonic power 210 W and enzymatic hydrolysis time 68 min. Under these conditions,the theoretical and actual crude polysaccharides yield were 12.08% and 11.91%,respectively,with a relative error of 1.41%,which indicated that the combination of Plackett-Burman design and response surface analysis can well optimize the extraction technology of polysaccharides fromCantharelluscibariuswith the ultrasinic-assisted enzymatic extraction method and it can provide certain technical support for the widely used ofCantharelluscibarius.

Cantharelluscibariuspolysaccharides;Plackett-Burman design;ultrasonic;cellulase

2015-03-23

孟雅紅(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品化學與生物化學，E-mail：13085390970@163.com。

*通訊作者:李輝(1985-)，女，博士，副教授，研究方向：食品化學，E-mail：lihuiscut@126.com。

云南省科技計劃青年項目(2014FD008)；云南省省級人培項目(KKSY201305002)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)21-0242-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.042