冠瘤海鞘抗菌活性篩選及低極性組分氣相色譜-質譜分析

徐 艷,張秀國,黃國強,張 琴,楊家林,孫雪萍,*

(1.廣西海洋研究所,海洋生物技術重點實驗室,廣西北海 536000;2.北京航空航天大學北海學院，廣西北海 536000)

冠瘤海鞘抗菌活性篩選及低極性組分氣相色譜-質譜分析

徐 艷1,張秀國2,黃國強1,張 琴1,楊家林1,孫雪萍1,*

(1.廣西海洋研究所,海洋生物技術重點實驗室,廣西北海 536000;2.北京航空航天大學北海學院，廣西北海 536000)

目的:研究冠瘤海鞘的抗菌活性部位及有效成分。方法:采用抑菌圈法和最小殺菌濃度法,對中國南海冠瘤海鞘的乙醇提取物和不同極性部位進行了抗菌活性測定,并采用GC-MS技術對其石油醚相低極性組分進行了化學成分分析。結果:結果顯示,抗菌活性成分主要在冠瘤海鞘的正丁醇相,其次是石油醚相;從冠瘤海鞘石油醚相中鑒定出14個化合物,主要為脂肪類和甾醇類化合物;從甾體組分中鑒定出7個化合物,主要為膽甾醇,其中4個為首次從冠瘤海鞘中分離鑒定。結論:冠瘤海鞘的正丁醇相和石油醚相具有明顯的抗菌活性,石油醚相以膽甾醇類化合物為主。

冠瘤海鞘,抗菌活性,氣相色譜-質譜法(GC-MS),甾醇

海鞘(Ascidian)是尾索動物亞門(Uronordata)海鞘綱的尾索動物,主要分布在熱帶及亞熱帶海域[1]。海鞘是網箱、網籠等水產養殖設施上的主要有害海洋污損生物之一,其優勢種具有較大的生物量[2-3]。我國海鞘資源相當豐富,許多種屬在國際上未見研究報道,與國外相比,國內豐富的海鞘資源不僅沒有得到有效開發,而且困擾著漁業和航海業的發展。

海鞘生理活性成分的研究正受到越來越多研究者的關注。目前國內外已經對數種海鞘進行了化學成分研究,多種海鞘類污損生物具有較高的藥用價值,其所含的生物堿、環肽等化學成分,具有顯著的抗腫瘤、抗HIV等生物活性[4-5]。國內的王瑞等[6]對不同海鞘醇提物的體外抗乙肝HBsAg和HBeAg的作用進行了比較;王超杰等[7]對廣東大亞灣的冠瘤海鞘進行了化學成分研究的首次報道,從其甲醇-氯仿提取物中分離出混合甾醇和神經酰胺兩類化合物,王超杰等[8]還從冠瘤海鞘中分離出4種化合物,分別為鮫肝醇、鯊肝醇、胞嘧啶和胸腺嘧啶脫氧核糖。我國對海鞘化學成份的研究僅有零星報道,多數未涉及到生理活性問題[9-11]。本文對廣西北海冠瘤海鞘(StyelacanopusSavigny)的醇提物以及不同極性部位進行了抗菌活性檢測,研究了其對9種致病菌的抑制活性,并應用氣質聯用儀對活性部位進行了化學成分分析,為進一步研究其生物活性物質奠定基礎。

表1 冠瘤海鞘乙醇提取物及各有機相的抗菌活性

注:抑菌圈直徑以平均值表示;“-”表示無活性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 樣品 冠瘤海鞘(S.canopus) 于2010年04月采自廣西北海,由國家海洋局廈門第三海洋研究所鄭成興研究員鑒定,存放于廣西海洋研究所海洋生物標本館,樣品編號為20100420。

1.1.2 供試菌種 7株人體致病菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、四聯球菌(Micrococcustetragenus)和藤黃八疊球菌(Micrococcusluteus);2株海洋致病菌:副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum),菌株 均為海南師范大學化學化工學院鄭彩娟老師贈送。

1.1.3 培養基 根據文獻[12]進行培養基的制備,抑菌圈(DIZ:Diameter of inhitition zone,mm)的測定選用LB(Luria-Bertani)平板,最小殺菌濃度(MBC:minimum bactericidal concentration,mg/mL)的測定選用LB液體培養基。

1.1.4 試劑與儀器 乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯 均為分析純,購自成都市科龍化工試劑廠;旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社;蒸發工作站 英國GeneVac公司;高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司;正相硅膠 青島海洋化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試樣品的制備 鮮海鞘洗凈、去殼(提取后干重271.5 g),于組織搗碎機中勻漿,經95%的乙醇室溫浸泡提取6次,每次30min,過濾,合并提取液,減壓濃縮后得浸膏(73.5 g)。浸膏用水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,減壓濃縮后得到石油醚相(9.8 g)、乙酸乙酯相(6.5 g)、正丁醇相(2.7 g)和水相(43.5 g)。石油醚相經正相硅膠層析,石油醚∶乙酸乙酯(100∶1～1∶1)洗脫,得石油醚相白色甾體組分3.7 g。

1.2.2 初篩方法 初篩采用紙片擴散法(disk-diffusion method)[13],全部操作均為無菌操作,實驗為單濃度三次重復。

1.2.3 最小殺菌濃度的測定 采用試管稀釋法(Tube dilution method)[14]測定了初篩有活性樣品的最小殺菌濃度。

1.2.4 GC-MS分析條件 ThermoTrace GC ultra DSQ II色質聯用儀,色譜柱:VF-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);電離源:70 eV;操作系統:Xcalibur;譜庫NIST02;石油醚相的升溫程序:50 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至130 ℃,再以25 ℃/min升至300 ℃;甾體組分的升溫程序:160 ℃開始,以10 ℃/min升至260 ℃,然后5 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。

2 結果與分析

2.1 冠瘤海鞘提取物的抑菌活性

由表1可以看出,冠瘤海鞘軟體組織的5種提取物對供試細菌的抑菌作用表現不同,冠瘤海鞘正丁醇相的抑菌效果最好,其次是石油醚相,乙醇提取物、乙酸乙酯相和水相的抑菌效果較弱。

冠瘤海鞘正丁醇相對所有供試菌株都表現出抑菌活性,其中對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好,抑菌圈直徑達到8 mm,對藤黃八疊球菌和白色念珠菌的最小殺菌活性分別為25 mg/mL和50 mg/mL,對蠟狀芽孢桿菌、副溶血弧菌和鰻弧菌的最小殺菌活性均為100 mg/mL,對金黃色葡萄球菌、四聯球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的最小殺菌濃度均大于100 mg/mL。

冠瘤海鞘石油醚相對5株菌(金黃色葡萄球菌、四聯球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)表現出抑菌活性,但對此5株菌的最小殺菌濃度均大于100 mg/mL。

冠瘤海鞘水相對4株供試菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌和副溶血弧菌)表現出抗菌活性,其中對副溶血弧菌的最小殺菌濃度為100 mg/mL,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌的最小殺菌濃度均大于100 mg/mL;冠瘤海鞘乙酸乙酯相對3株供試菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃八疊球菌)表現出抑菌活性,對藤黃八疊球菌的最小殺菌濃度為25 mg/mL,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小殺菌濃度均為100 mg/mL;冠瘤海鞘乙醇提取物僅對白葡萄球菌有抑菌作用,其最小殺菌濃度大于100 mg/mL。

表2 冠瘤海鞘乙醇提取物及各相的最小殺菌濃度

注:“>100”表示最小殺菌濃度大于100mg/mL;“/”表示未測。

表3 冠瘤海鞘石油醚相GC-MS分析

2.2 石油醚相化學成分分析

為探討冠瘤海鞘石油醚相中抗菌活性物質的組成,本文對石油醚相進行了GC-MS分析。冠瘤海鞘石油醚相經甲酯化處理后用GC-MS聯用儀分析,得冠瘤海鞘石油醚相總離子流譜(見圖1),共檢測到30個峰,總離子流色譜圖中的各峰經質譜掃描后得到相應的質譜圖,通過Xcalibur工作站NIST標準質譜圖庫進行檢索,共鑒定出其中的14個化合物,均為首次從冠瘤海鞘中分得,結果見表3。

圖1 冠瘤海鞘石油醚相氣質分析總離子流Fig.1 Total ion current(TIC)chromatogram of petroleum ether fraction from S. canopus

GC-MS分析表明,鑒定出的化合物占冠瘤海鞘石油醚相總質量的90.38%,以二氫膽固醇(Dihydrocholesterol)為主,占22.21%;其次是(E)-9-十二烯酸甲酯((E)-9-Dodecenoic acid methyl ester)和壬酸甲酯(Nonanoic acid,methyl ester),各占19.86%和13.50%。冠瘤海鞘石油醚相以脂肪類化合物為主,共有10個,其中飽和脂肪酸類化合物9個(見表3),不飽和脂肪酸類化合物只有1個:(Z,Z)-9,15-十八烷二烯酸甲酯((9Z,15Z)-9,15-Octadecadienoic acid,methyl ester);另外還有醇類化合物2個:2-甲基-6-亞甲基-1,7-辛二烯-3醇,(2-Methyl-6-methylene-octa-1,7-dien-3-ol)和1,14-十四烷二醇(1,14-Tetradecanediol),膽甾醇類化合物1個:二氫膽固醇(Dihydrocholesterol),以及1個環氧烷類化合物:1,2-環氧十六烷(1,2-Epoxyhexadecane)。

表4 冠瘤海鞘甾體組分的GC-MS分析

經GC-MS分析,從冠瘤海鞘甾體粗晶中鑒定出7個化合物,其中化合物1、3、5、7為冠瘤海鞘中首次分離鑒定。所鑒定化合物占甾體粗晶總質量的90.42%,其中,2個膽甾醇衍生物:膽甾-5,22-二烯-3β-醇和膽甾醇,占甾體粗晶總質量的 41.89%;3個麥角甾:22(Z)-26,27-二降-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇、麥角甾-5,22-二烯-3β-醇和26,26-二甲基-麥角甾-5,24(28)-二烯-3β-醇占甾體粗晶總質量的 39.37%;另外2個豆甾醇:豆甾-7,22-二烯-3β-醇和豆甾-5-烯-3β-醇所占比重最小,為9.16%。

3 結論

本研究結果表明,廣西沿海冠瘤海鞘的正丁醇相和石油醚相具有明顯的抗菌活性;冠瘤海鞘石油醚相以膽甾醇類化合物為主;從冠瘤海鞘甾體粗晶中鑒定出7個甾體,其中甾體1、3、5、7為首次分離鑒定。研究結果對冠瘤海鞘抗菌活性物質的進一步分離純化具有一定的指導意義。

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Antibacterial activities and GC-MS analysis of low polar components fromStyelacanopusSavigny

XU Yan1,ZHANG Xiu-guo2,HUANG Guo-qiang1,ZHANG Qin1,YANG Jia-lin1,SUN Xue-ping1,*

(1.Guangxi Institute of Oceanology,Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Beihai 536000,China;2.Beihai College of Beihang University,Beihai 536000,China)

Objective:To screen the antibacterial fractions and constituents ofStyelacanopusSavigny. Method:The antibacterial activities of the ethanolic extract and organic fractions ofS.canopusfrom the South China Sea was evaluated by diameter of antibacterial circle and the minimum bactericidal concentration(MBC),and the low-polar compounds in the petroleum ether fraction were also analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Results:The results showed that the antibacterial substances were mainly in the n-butanol and petroleum ether fraction,and 14 compounds were identified by GC-MS from petroleum ether fraction,most of which were lipids and sterols. Seven compounds were identified by GC-MS from the sterol component,and cholesterol was the dominant sterol. Four compounds were identified for the first time fromS.subcrenata. Conclusion:The antibacterial activities of n-butanol and petroleum ether fraction fromS.canopuswere obvious,and cholesterol was the dominant sterol of petroleum ether fraction.

StyelacanopusSavigny;antibacterial activity;gas chromatography-mass spectrometry;sterols

2014-08-11

徐艷(1981-),女,碩士,助理研究員,研究方向:海洋活性物質，E-mail:xuyango528@163.com。

*通訊作者:孫雪萍(1982-),女，博士，助理研究員，主要從事海洋天然產物研究,E-mail:sunxueping2012@126.com。

廣西科學院基本科研業務費資助項目(13YJ22HYS15);廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻 09321004)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)21-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.052