抗疲勞類保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查

顏偉華,宋劍鋒,程 闖,鄭 明,王笑笑,方一超

(衢州市食品藥品檢驗研究院，浙江衢州 324002)

抗疲勞類保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查

顏偉華,宋劍鋒*,程 闖,鄭 明,王笑笑,方一超

(衢州市食品藥品檢驗研究院，浙江衢州 324002)

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法,建立保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查方法。色譜條件:Agilent ZOBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈、磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調pH至2.8±0.05)為二元梯度洗脫流動相,流速1.0 mL/min,柱溫 18 ℃,檢測為波長 230 nm。結果表明,12種抗疲勞化藥成分在相應的濃度范圍內,峰面積和進樣量有良好的線性關系(r≥0.999)。檢出限在4.02～9.17 ng之間,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間。應用本方法從38批樣品中檢出1批非法添加化藥成分西地那非。本法簡單快速準確,精密度好,適用于基層藥檢機構,可以用于抗疲勞類保健食品中12種化藥非法添加的快速篩查。

抗疲勞類化藥,保健食品,HPLC-DAD,快速篩查

西地那非等PDE5型抑制劑類藥物的主要功效為治療男性勃起功能障礙疾病。由于其特殊用途,一些不法商販為了賺取高額利潤,在抗疲勞類保健食品中非法添加PDE5型抑制劑。此類藥物為處方藥,服用時具有一定的禁忌和副作用,高血壓、冠心病、腦血栓等患者在不知情的情況下使用此類產品,容易引起嚴重的藥物不良反應甚至死亡[1-2]。為此,國家藥監局發布了2006009、2008016、2009030共三個補充檢驗方法批件[3-5]。2006009和2008016分別檢測2種和8種成分,2009030檢測11種,但其中羥基豪莫西地那非、西地那非和豪莫西地那非三種成分的分離度[6]難以達到1.5以上,且使用液-質色譜檢測器檢測。液-質色譜測定抗疲勞類保健食品中的化藥成分,由于儀器設備和維護費昂貴,在地市食品藥品檢驗機構無法普及[7-9];HPLC測定報導較多,但測定品種局限[10-11],經實際應用發現部分PDE5型抑制劑類藥物保留時間非常接近,分離效果差,易發生假陽性、本底干擾等問題。二極管陣列檢測器(DNA)是一種基于光電二極管陣列技術的新型檢測器。使用二極管陣列檢測器,可以對色譜峰進行光譜掃描、峰純度鑒定等定性分析[12-14],可以有效地解決PDE5型抑制劑類藥物在檢測過程中常出現的假陽性問題。此外,DAD在方法研究中可以快速選擇最佳檢測波長,在多組分混合物分析中可以編輯波長程序。由于具有這些明顯優勢,二極管陣列檢測器在化藥分析中有著良好的應用前景。

本實驗選用液相色譜,利用DAD專屬檢測器,通過對流動相的組成、pH和柱溫等進行實驗優化,最終確定色譜條件?？紤]到不法商販為了達到明顯療效的目的,一般添加化藥成分的量都較大,遠高于液相的定量限,結合二極管陣列檢測器的獨特優勢,故本實驗僅考察了HPLC-DAD的方法學。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對照品那紅地那非(批號1591-080A3)、羥基豪莫西地那非(批號1441-048A6)、豪莫西地那非(批號1220-030A3)、二甲基西地那非(批號1215-003A2)、氨基他達那非(批號1638-004A2)、他達那非(批號1156-051A1)、那莫西地那非(批號1646-055 A2) 加拿大TLC公司;紅地那非(批號C0802052)、西地那非(批號C0802055) 西班牙Valencia,GM公司;伐地那非(批號11320-035A1)、硫代艾地那非(批號1-JMS-114-1)、偽伐地那非(批號1217-011 A2) 上海安譜科學儀器有限公司。

供試品 為衢州市食品藥品檢驗研究院在專項監督工作中從衢州市本級及各縣(市、區)各大醫院和藥店的抽樣,共30個品種38批。乙腈為色譜純。其他化學試劑為分析純,水為自制超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有G1311C 泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B DAD檢測器、B.03.02[341]LC 3D系統化學工作站) 安捷倫公司;Xp205電子天平 Metter toledo公司;KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 參考《國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件》[3-5],通過對流動相的組成、pH和柱溫等進行實驗優化,最終確定色譜條件。色譜柱:Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);二元流動相:C相為乙腈;D相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調pH至2.8±0.05)。梯度洗脫,流速:1.0 mL·min﹣1,柱溫:18 ℃;進樣量:10 μL;檢測器:DAD檢測器;檢測波長:230 nm;以色譜峰的保留時間定性,并以DAD紫外吸收光譜圖(200～400 nm)輔助定性。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 那紅地那非23.25 mg,紅地那非13.26 mg,伐地那非14.33 mg,羥基豪莫西地那非17.33 mg,西地那非23.98 mg,豪莫西地那非12.37 mg,二甲基西地那非15.03 mg,氨基他達那非19.91 mg,他達那非21.43 mg,硫代艾地那非9.75 mg,偽伐地那非14.50 mg,那莫西地那非16.33 mg置25 mL量瓶中,用乙腈溶解,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理15 min,冷卻至室溫,稀釋至刻度,搖勻,即得標準品儲備溶液。精密量取適量,用流動相D稀釋成每1 mL約含50 μg的混合對照品溶液。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.2.2 供試品溶液的制備 若供試品為固體制劑,精密稱取一次服用量,研細,置50 mL容量瓶中,加乙腈40 mL,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)15 min,冷至室溫,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過;若供試品為液體制劑,精密量取一次服用量,置50 mL容量瓶中,加乙腈約40 mL,振搖3 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過。精密量取續濾液適量,用流動相D稀釋至與對照品溶液濃度相當,搖勻,濾過,即得。

2 結果與討論

2.1 色譜分析條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇 C相選擇不同比例的甲醇、乙腈進行系統適應性實驗,D相選擇不同濃度的磷酸三乙胺溶液,用磷酸調不同pH,結果表明C相為純乙腈、D相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調pH至2.8±0.05)最為理想。D相pH過低,羥基豪莫西地那非和西地那非達不到分離效果;pH過高,伐地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非和豪莫西地那非的分離度達不到要求。

2.1.2 柱溫 柱溫過高,氨基他達拉非峰變形,且其他峰分離度下降。柱溫太低,柱子壓力太大,結果表明,柱溫18 ℃左右,分離效果較好,且柱壓在可承受范圍。

2.1.3 檢測波長 利用二極管陣列檢測器記錄光譜圖,觀察混合對照溶液的3D光譜圖,表明上述色譜條件下,230 nm波長處的信號值響應較強,且分離度較好,因此選擇230 nm作為檢測波長。

2.1.4 提取溶劑 12種抗疲勞類化藥都溶于乙腈,選用乙腈超聲15 min提取基本完全,但需用流動相D稀釋后進樣,否則容易產生溶劑效應,分離度達不到要求。

表2 12種抗疲勞類化藥成分的回歸曲線

2.2 系統適用性實驗

取混合對照品溶液,在1.2.1項色譜條件下分析,12種常見的抗疲勞類藥得到了良好的分離,分離度均大于1.6,如圖1所示。根據混合對照品出峰保留時間和單個對照品保留時間,可以確定其色譜峰流出順序依次是:那紅地那非(7.182 min)、紅地那非(7.804 min)、伐地那非(8.766 min)、羥基豪莫西地那非(11.969 min)、西地那非(12.418 min)、豪莫西地那非(13.326 min)、二甲基西地那非(14.503 min)、氨基他達那非(22.952.09 min)、他達那非(29.017 min)、硫代艾地那非(30.605 min)、偽伐地那非(38.094 min)、那莫西地那非(41.667 min)。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Reference Chromatogram注:1-那紅地那非;2-紅地那非;3-伐地那非;4-羥基豪莫西地那非;5-西地那非;6-豪莫西地那非;7-二甲基西地那非;8-氨基他達那非;9-他達那非;10-硫代艾地那非;11-偽伐地那非;12-那莫西地那非。

2.3 線性關系的考察

精密吸取1.2.2.1項下的對照品標準儲備液0.5、1.0、2.0 mL分別置100 mL和10 mL量瓶中,用流動相D稀釋至刻度,按1.2.1項色譜條件進樣分析,記錄色譜峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標(X),峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線結果見表2。

2.4 精密度實驗

取1.2.2.1項下的混合對照品溶液,重復進樣6次,記錄色譜圖,各成分峰面積的RSD為0.23%～1.43%,色譜峰保留時間一致,表明精密度較好。

2.5 穩定性實驗

取1.2.2.1項下的混合對照品溶液,于配制后0,2,6,12,24,48 h測定,各組分色譜峰的保留時間和峰面積均無明顯變化,RSD均小于1.5%,穩定性較好。

2.6 檢出限和定量限

取1.2.2.1項下的對照品溶液,以不同比例稀釋后測定,信噪比(S/N)為3作為最低檢出限(LOD),信噪比(S/N)為10作為定量限(LOQ),12種化學組分的檢出限和定量限結果見表3。

表3 12種抗疲勞類化藥成分的檢出限和定量限

2.7 回收率實驗

取陰性樣品,研細,分別精密加入12種對照品,按1.2.2.2項的方法,平行制備6份,測定,結果見表4,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間,結果較好。

表4 12種抗疲勞類化藥成分的回收率

2.8 樣品測定

用本文建立的方法,對市場上30個品種38批次不同劑型的抗疲勞類保健食品同時進行檢測,37批次均未檢出,其中有1批檢出峰的保留時間與西地那非對照品溶液峰相同,進一步比較兩者的DAD光譜圖(圖2),圖譜相似度達99.9%,因此初步判定該保健食品中可能添加了西地那非,含量為14.3 mg/g。

圖2 DAD掃描圖譜Fig.2 DAD scanning map注:A：陽性樣;B：西地那非對照品。

3 結論

本實驗建立了用HPLC-DAD法同時檢測抗疲勞類保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查方法。12種抗疲勞化藥成分在相應的濃度范圍內,峰面積和進樣量有良好的線性關系(r≥0.999)。檢出限在4.02～9.17 ng之間,定量限在12.57～29.25 ng之間,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間。精密度實驗的RSD為0.23%～1.43%,48 h內穩定性實驗的RSD均小于1.5%。12種抗疲勞化藥成分的分離度均大于1.6,實現了同時分離與專屬性鑒別。利用該方法快速篩查了市場上30個品種38批次抗疲勞類保健食品,通過比較樣品的色譜圖與紫外光譜圖,初步判定某種保健品中非法添加有疑似西地那非的成分,可進一步采用HPLC-MS等方法進行結構確證。本方法操作快速準確,成本相對較低,易在基層食品藥品檢測機構推廣。

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Rapid screening of 12 anti-fatigue agents in health care products by HPLC

YAN Wei-hua,SONG Jian-feng*,CHENG Chuang,ZHENG Ming,WANG Xiao-xiao,FANG Yi-chao

(Quzhou Institute for Food and Drug Control,Quzhou 324002,China)

A high-performance liquid chromatography-diode array detection(HPLC-DAD)method was established for detection the simultaneous determination of 12 kinds anti-fatigue agents,which were illegally added in health care products. The sample were separated on Agilent ZOBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm),gradient eluted with mixture of acetonitrile and phosphoric acid-triethylamine(7 mL triethylamine,dilute with water to 1000 mL,with phosphoric acid to regulate pH to 2.8±0.05)at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 18 ℃ and the detection wavelength was set at 230 nm. Results showed that good linearity was obtained for 12 kinds anti-fatigue agents in 12 components in a wide range and correlation was greater than 0.999. The LOD was from 4.02 to 9.17 ng. The recovery rate was from 98.69% to 109.07% and RSD was from 0.20% to 2.46%. Using this method,1 batch of illegally added chemicals were detected from 38 batches of samples. This method was simple and precise,it can provide a reliable way for detecting 12 Anti-fatigue agents in health care products.

anti-fatigue agents;health care products;HPLC-DAD;rapid drug testing

2015-01-23

顏偉華(1986-),女,碩士研究生,助理工程師,研究方向:食品檢測與分析,E-mail:weihuawww@163.com。

*通訊作者:宋劍鋒(1974-),男,本科,副主任中藥師,研究方向:中藥材質量控制與檢測,E-mail:13567082896@163.com。

浙江省衢州市重點實驗室項目(衢市科發高[2015]8號);衢州市115人才項目(衢市人社專[2013]146號)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)21-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.053