制備抗五氯酚鈉單克隆抗體及其應用于酶聯免疫試劑盒的初步研究

劉 歡,馮才偉,賈芳芳,馮 靜,彭 鴿,張 瑜

(1.中國水產科學研究院,北京100141;2.北京勤邦生物技術有限公司,北京 102206)

制備抗五氯酚鈉單克隆抗體及其應用于酶聯免疫試劑盒的初步研究

劉 歡1,馮才偉2，*,賈芳芳2,馮 靜2,彭 鴿2,張 瑜2

(1.中國水產科學研究院,北京100141;2.北京勤邦生物技術有限公司,北京 102206)

本文通過五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯經過一系列反應,得到半抗原,制備出抗五氯酚鈉單克隆抗體,然后利用酶聯免疫技術研制了一種快速檢測魚肉、蝦肉中的五氯酚鈉試劑盒,經過測試,該試劑盒對魚肉、蝦肉樣本的檢測限為0.75 μg/kg,IC50為0.31 μg/L,平均回收率為71.5%～104.7%,試劑盒的標準曲線范圍為0.05～4.05 μg/L,批內、批間相對標準偏差小于10%,穩定性良好。

五氯酚鈉,單克隆抗體,酶聯免疫試劑盒

五氯酚鈉是一種性質穩定的農藥,可用于殺蟲、抗菌、防腐、除草等[1-3]。由于五氯酚鈉容易污染環境,并且容易在人體內富集[4-5],因此,五氯酚鈉被美國列為可疑致癌物質,限制其使用;我國農業部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》,禁止在水生動物養殖中使用[6-7]。

由此可見,研究水產中五氯酚鈉殘留量的檢測方法是有必要的。然而,目前現有的氣相色譜法、氣相色譜-電子捕獲法、氣相色譜-氫火焰法等儀器方法[8-14],由于其費用昂貴及操作難度等缺點,較難用于基層單位對大量樣本的篩查。因此,我們制備了抗五氯酚鈉單克隆抗體,并將其應用于檢測魚肉、蝦肉等水產組織中五氯酚鈉含量的酶聯免疫試劑盒的開發。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五氯酚鈉標準品 北京標準物質研究中心;牛血清白蛋白、卵清蛋白、氫氧化鈉以及磷酸鹽 北京百欣試劑公司;魚肉、蝦肉 超市。

酶標儀(最大量程為4.0) 上海雷勃分析儀器有限公司;渦旋儀、均質器 湖南湘立科學儀器有限公司。

1.2 制備抗原

1.2.1 制備半抗原 1.0 g五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯在DMF中,在無水碳酸鉀與碘化鈉的催化下,反應生成五氯酚-4溴-丁酸乙酯產物,經乙酸乙酯萃取,水洗,柱層析純化分離,得到中間產物,中間產物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應,水解生成半抗原,經乙酸乙酯提取,二氯甲烷重結晶,得到半抗原產物。

圖1 五氯酚鈉半抗原合成Fig.1 Synthesis of pentachlorophenoI-Na hapten

1.2.2 制備免疫原——半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成 取18 mg半抗原,溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺中,得到溶液(1),取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中,4 ℃下攪拌30 min,得到反應液A。稱取BSA 50 mg,使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH7.2)中,將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24 h,用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液,于-20 ℃保存備用。通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯是否偶聯成功。

1.2.3 制備包被原——半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯物合成 取18 mg半抗原,溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺,得到溶液(1),取50 μL氯甲酸異丁酯加入(1)中,4 ℃下攪拌30 min,得到反應液A。稱取50 mg的卵清蛋白,溶解于4.0 mL PBS(pH7.2)中,將反應液A滴加到蛋白溶液中,室溫攪拌24 h,用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液,于-20 ℃保存備用。通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯是否偶聯成功。

1.3 制備單克隆抗體以及酶標記抗抗體

1.3.1 單克隆抗體的制備

1.3.1.1 動物免疫 按照150 μg/只的免疫劑量將免疫原注入到Balb/c小鼠體內,從而獲得抗血清。

1.3.1.2 細胞融合和克隆化 測定小鼠血清,測定血清效價,效價結果達到1∶2000～1∶1000,取小鼠脾細胞,按照8∶1的數量配比和SP2/0骨髓瘤細胞融合,利用間接競爭酶聯免疫法測定細胞上清液,進行陽性孔篩選。通過有限稀釋法克隆化陽性孔,從而得到能夠分泌五氯酚鈉單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

1.3.1.3 細胞凍存和復蘇 用凍存液將1.3.1.2得到的單克隆雜交瘤細胞株制成1×106個/mL的細胞懸液,用液氮保存。復蘇時,將取出的凍存管立即放入37 ℃水浴中,離心去除凍存液,最后移入培養瓶內培養。

1.3.1.4 單克隆抗體的生產與純化 按照0.5 mL/只的滅菌石蠟油劑量注入Balb/c小鼠腹腔,一周后,按照5×105個/只的劑量向腹腔注射穩定的單克隆雜交瘤細胞株,一周后可采集腹水?？赏ㄟ^辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水。

1.3.2 酶標記抗抗體的制備 將1.3.1得到的鼠源抗體免疫無病原體羊,得到羊抗鼠抗抗體[15],利用過碘酸鈉法,將其與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯[16],得到酶標記抗抗體。

1.4 篩選抗原包被濃度以及單克隆抗體濃度

百分吸光率(%)=(標準品或樣本溶液的平均吸光度值/0 μg/L標準溶液的平均吸光度值)×100。測定濃度為0,0.05 μg/L的五氯酚鈉標準品的百分吸光率,測定波長為450 nm,抗原稀釋倍數依次為:1∶2000,1∶4000,1∶8000;單克隆抗體稀釋倍數依次為:1∶50000,1∶100000,1∶200000,1∶400000;酶標記抗抗體液的稀釋倍數為1∶1000。

1.5 制備酶標板

將優選濃度的抗原包被液100 μL包被于96孔酶標板中,置于37 ℃,孵育2 h,洗板后,加入150 μL封閉液(0.05%BSA溶解于0.02mol/L PBS),置于37 ℃,孵育2 h。

1.6 魚肉、蝦肉的前處理方法

向1.0 g攪拌均勻的樣本中加入2 mL 0.1 mol/L NaOH,渦旋2 min,再加入8 mL乙腈,渦旋3 min,離心5 min,轉速為3000 r/min。取上清液1 mL到10 mL的玻璃試管中,50～60 ℃水浴氮氣流下吹干;再加入1.5 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液,渦旋30 s即可。

1.7 測定魚肉、蝦肉的OD450 nm值

向酶標板每孔中加入50 μL標準品(濃度為0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 μg/L)和50 μL魚肉、蝦肉樣本,再加入適宜稀釋后的抗體液50 μL,25 ℃避光30 min。洗板后,每孔加入100 μL酶標記抗抗體,25 ℃避光30 min。洗板后,每孔加入50 μL過氧化氫,再加入50 μL四甲基聯苯胺,25 ℃避光15 min。最后加入50 μL 2 mol/L H2SO4,測定酶標板孔OD450 nm值。

1.8 魚肉、蝦肉中五氯酚鈉的實際濃度計算方法

分別以五氯酚鈉標準品濃度(μg/L)的對數、標準品百分吸光率為標準曲線的橫、縱坐標,然后將魚肉、蝦肉的OD450 nm代入標準曲線,得到相應的濃度,該濃度乘以稀釋倍數即為魚肉、蝦肉中五氯酚鈉含量。

1.9 靈敏度和檢測限

分別檢測20份魚肉、蝦肉的空白樣本,利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標準差計算檢測限(LOD)。LOD是檢測方法可檢測出的最低被測物濃度,也稱為檢測低限或最小檢出濃度[17]。

1.10 精密度和準確度

我國農業部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(中華人民共和國農業部公告第193號),禁止在水生動物養殖中使用?！掇r殘辦技術材料要求及審查程序》對獸藥殘留酶聯免疫檢測試劑盒的備案技術資料要求:對于禁用藥物,添加濃度至少為1倍定量限和2倍定量限。定量限(LOQ)是指在精密度和正確度可接受的情況下檢測系統能夠得到可靠結果的被測物最低濃度,分析物在這個濃度下被可靠檢出[18]。分別對魚肉、蝦肉樣本添加五氯酚鈉,使其濃度達到1倍定量限和2倍定量限,測定添加回收率,用來考察準確度。同時,每個樣本做4個平行,包被3批酶標板,計算相對標準偏差(RSD%),用來考察精密度。

1.11 穩定性

將試劑盒存放在4 ℃,每個月測定一次,連續測定12個月;將試劑盒存放在37 ℃,每天測定一次,連續測定7 d。記錄試劑盒的最大吸光度值(0 μg/L)、50%抑制濃度以及1.5、3.0 μg/kg的添加魚肉、蝦肉空白樣本的回收率,評價不同時間、不同溫度對試劑盒的穩定性影響。

1.12 交叉反應率實驗

2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚與五氯酚鈉具有類似結構[19],對其進行酶聯免疫吸附測定,通過標準曲線分別得到其50%抑制濃度,用下式計算試劑盒對2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應率:

交叉反應率(%)=引起50%抑制的五氯酚鈉濃度/引起50%抑制的五氯酚鈉類似物濃度×100

2 結果與分析

2.1 半抗原與人工抗原的鑒定

2.1.1 鑒定半抗原 核磁共振氫譜測定已制備的五氯酚鈉半抗原,其質子核磁共振(H-NMR)數據:11.0(1H,COOH)、4.0(2H,Ph-O-CH2-)、2.0(2H,-CH2-)、2.3(2H,-CH2-COO-)譜圖見圖2。

圖2 五氯酚鈉半抗原核磁共振氫譜Fig.2 Proton NMR Spectra of pentachlorophenoI-Na hapten

取上述產物經核磁共振氫譜測定,化學位移在4.0 ppm處的為鄰近酚氧的亞甲基信號峰,2.0 ppm處兩組為亞甲基信號峰,11 ppm處為羧基氫信號峰,說明半抗原合成成功[20-21]。

2.1.2 鑒定人工抗原 通過紫外掃描法鑒定人工偶聯抗原,見圖3、圖4。偶聯抗原、半抗原、載體蛋白的紫外吸收曲線各不相同,說明人工抗原有效偶聯。

圖3 五氯酚鈉半抗原-牛血清白蛋白的紫外吸收光譜Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of PCP-Na Hapten-BSA

圖4 五氯酚鈉半抗原-卵清蛋白的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of PCP-Na hapten-OVA

2.2 篩選抗原包被濃度以及單克隆抗體濃度

測定濃度為0 μg/L和0.05 μg/L的五氯酚鈉標準品的OD450 nm,見表1。

當OD450 nm(0.05 μg/L)/OD450 nm(0 μg/L)的抑制率在70%～85%時,以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數[22],由此可見,本研究中的最佳抗原稀釋倍數為4000,最佳單克隆抗體稀釋倍數為200000。

表1 抗原、抗體的濃度篩選(OD450nm)

2.3 標準曲線

實驗表明,標準曲線的范圍為0.05～4.05 μg/L,IC50(50%抑制濃度)為0.31 μg/L;線性方程y=-0.7x+6.579,R2為0.9942。

表2 標準曲線的酶聯免疫法測定

表3 魚肉空白樣本檢測限測定結果(μg/L)

表4 蝦肉空白樣本檢測限測定結果(μg/L)

表5 魚肉、蝦肉精密度及準確度實驗

2.4 靈敏度和檢測限

本研究對魚肉、蝦肉樣本的檢測限為0.75 μg/kg，見表3、表4。

2.5 精密度和準確度

測定添加不同濃度五氯酚鈉的魚肉、蝦肉樣本,平均回收率范圍是70.8%～90.2%,可見當添加濃度為1.5、3.0 μg/kg時,試劑盒符合農醫發[2005]17號規定的回收率范圍大于40%或符合相應檢測標準的要求,并且符合本實驗平臺技術要求的60%～130%,即檢測樣本能夠得到可靠結果,LOQ=1.5 μg/kg,建立的LOD和LOQ的關系符合LOD≤LOQ[23];批內相對標準偏差范圍是5.7%～9.9%;批間相對標準偏差范圍是9.4%～9.8%，見表5。

2.6 穩定性

將試劑盒分別保存在4 ℃和37 ℃,測定的試劑盒的最大吸光度值(0 μg/L)范圍是1.75～1.99,50%抑制濃度范圍是3.0～4.0 μg/L,五氯酚鈉添加回收率范圍是71.5%～104.7%,由此可見,各指標均在正常范圍之內，結果見表6、表7。從測定結果可知,該試劑盒在4 ℃至少能夠保存12個月,在37 ℃至少能夠保存7 d。

表6 試劑盒在4 ℃保存的穩定性

表7 試劑盒在37 ℃保存的穩定性

2.7 交叉反應率實驗

五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應率見表8。

表8 交叉反應率實驗

由表8可知,五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應率分別為1.6%,4.9%,0.3%。

3 討論

余宇燕[23-24]等采用了氯乙酸法合成五氯酚(PCP)的衍生物五氯苯氧乙酸半抗原,在此基礎上,采用活化酯法合成五氯酚的人工抗原,制備單克隆抗體。本文制備的五氯酚鈉半抗原結構的間隔臂為4個碳長度的碳鏈,與蛋白結合后,能夠更大限度地暴露在其表面,突出小分子結構特征,使免疫出的抗體具有更好的親和力。

GB 29708-2013《食品安全國家標準 動物性食品中五氯酚鈉殘留量的測定》使用氣相色譜-質譜法測定動物性食品中的五氯酚鈉殘留量,該方法的實驗樣本為豬的肌肉、肝臟和腎臟及雞的肌肉和肝臟組織[25],未使用魚肉、蝦肉作為樣本。目前,尚未檢索到魚肉、蝦肉樣本中五氯酚鈉含量檢測的國家標準,相關文獻也較少。因此,可為檢測水產樣本中五氯酚鈉提供一定的手段。

4 結論

本研究制備了抗五氯酚鈉單克隆抗體,并將其應用于酶聯免疫試劑盒的開發,通過一系列實驗,確定了最佳的抗原液濃度和單克隆抗體濃度,得到該試劑盒的標準曲線范圍為0.05～4.05 μg/L,魚肉、蝦肉的檢測限為0.75 μg/kg,平均回收率為71.5%～104.7%。批內相對標準偏差范圍是5.7%～9.9%,批間相對標準偏差范圍是9.4%～9.8%,重現性較好。五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應率分別為1.6%,4.9%,0.3%。穩定性是評價試劑盒質量的一個重要方面[26-27],本研究的試劑盒在4 ℃能夠保存12個月,在37 ℃下能夠保存7 d,各項測定指標均在正常范圍之內,說明該試劑盒具有良好的穩定性。

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Study on the production of pentachlorophenoi-na monoclonal antibodies and its enzyme linked immunosorbent assay kit for rapid detection

LIU Huan1,FENG Cai-wei2，*,JIA Fang-fang2,FENG Jing2,PENG Ge2,ZHANG Yu2

(1.Chinese Academy of Fishery Sciences,Beijing 100141,China;2. Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China)

The synthesized pentachlorophenoI-na hapten was prepared from a sequence of reactions that used pentachlorophenoI-Na and 4-Bromobutyric acid ethyl ester. And pentachlorophenoI-Na monoclonal antibodies were prepared by pentachlorophenoI-Na antigen. Then the limit of detection and relative standard deviation(RSD)of pentachlorophenoI-Na enzyme linked immunosorbent assay kit was studied. The limit of detection was 0.75 μg/kg in fish and shrimp,with the IC50values of 0.31 μg/L. The average recoveries were between 71.5% and 104.7%. The standard curve ranged from 0.05 to 4.05 μg/L,and RSD was less than 10%. The stability tests results revealed that the kit can be kept for a long time.

PentachlorophenoI-Na;monoclonal antibodies;enzyme linked immunosorbent assay kit

2014-12-30

劉歡(1980-),女,博士,研究方向:水產品質量安全檢測技術及管理,E-mail:liuh@cafs.ac.cn。

*通訊作者:馮才偉(1978-),男,碩士,研究方向:食品安全檢測技術研究,E-mail:fengcaiwei@kwinbon.com。

TS207.3

A

1002-0306(2015)21-0307-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.055