酶標抗原直接競爭ELISA方法檢測呋喃唑酮代謝物殘留

樊曉博,徐社會,蔣 寶,柴喜春

(1.渭南職業技術學院渭南市農產品食品檢驗檢測研究中心,陜西渭南 714000;2.廣州瑞森生物科技有限公司,廣東廣州 511400)

酶標抗原直接競爭ELISA方法檢測呋喃唑酮代謝物殘留

樊曉博1,徐社會2,蔣 寶1,柴喜春1

(1.渭南職業技術學院渭南市農產品食品檢驗檢測研究中心,陜西渭南 714000;2.廣州瑞森生物科技有限公司,廣東廣州 511400)

采用酶標抗原建立了高效、高靈敏的呋喃唑酮代謝物直接競爭的ELISA檢測方法。以呋喃唑酮單克隆抗體包被作為固相抗體,HRP標記的抗原與標準品(或樣品)中呋喃唑酮的代謝物衍生物競爭結合抗體,建立了直接競爭酶聯免疫檢測體系。以3-氨基-2-惡唑烷酮的衍生物(CPAOZ)為標準品建立標準曲線,得到方法的IC50為0.08 μg/L,靈敏度為0.015 μg/L,線性范圍0.025～0.5 μg/L;檢測樣品的平均回收率為82.0%～121.0%,與其他結構類似物基本無交叉反應。建立呋喃唑酮酶標抗原直接競爭酶聯免疫檢測方法,靈敏度高、特異性強、操作簡單,可以滿足畜禽水產實際樣品的檢測需要。

呋喃唑酮,3-氨基-2-惡唑烷酮,酶標抗原,直接競爭酶聯免疫吸附檢測

呋喃唑酮是人工合成的光譜抗菌藥,屬于硝基呋喃類藥物,因其具有抗病菌[1]、防止感染[2]等作用在養殖業中廣泛應用,也作為預防畜禽和水產腸道疾病的飼料添加劑[3-6]使用,硝基呋喃類藥物殘留已引起民眾廣泛關注[7-8]。呋喃唑酮為致癌藥物,被動物服用后,硝基呋喃類藥物在食品中代謝產物會具有潛在的毒理性危害[9-10],普通的食品加工方法,如燒烤、微波加工、烹調等,均難以使其降解,對人類健康造成嚴重的威脅[11]。硝基呋喃類藥物在歐盟列為A類禁用藥物,規定在魚、蝦等水產品中不得檢出[12-15],我國農業部 2002文件也要求在動物源食品中不得檢出硝基呋喃類藥物[16]。

目前硝基呋喃類藥物的檢測主要有儀器方法,如超高效液相色譜法(UHPLC)[17]、液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)[18-20]和酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)[21]等。儀器法比較準確,但操作繁瑣,設備昂貴,難以滿足現場檢測的需要。酶聯免疫檢測方法基于抗原抗體具有高度特異性,操作簡單、準確,檢測樣大,彌補儀器法的不足,非常適用于樣品快速篩查。目前,國外有報道建立高靈敏度的AOZ直接競爭ELISA方法[22-23],但國內ELISA技術在檢測呋喃唑酮殘留方面的研究多采用間接競爭的方法,其檢測靈敏度普遍不如高效液相色譜法及其聯用技術[24]。本研究通過酶標記抗原,固相包被抗體,建立了直接競爭AOZ-ELISA檢測方法,顯著提高了方法的穩定性和靈敏度,通過對不同樣品的檢測,驗證了方法的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

呋喃唑酮代謝物(AOZ)、辣根過氧化物酶(HRP) Sigma公司;呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物標準品 百靈威化學;CPAOZ-OVA(Ovalbumin)、抗CPAOZ單克隆抗體本實驗室自制;96孔微量反應板 雷博公司;其它化學試劑均為國產市售分析純。

G16-2恒溫培養箱 美國SHELL LAB;P200微量可調移液槍 吉爾森公司;Wellwash MK-2洗板機、MK-3酶聯免疫檢測儀 美國Thermo公司;恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;1-13型快速離心機 Sigma公司;dc-12型水浴氮吹儀 上海安普科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CPAOZ標準曲線的配制 CPAOZ以甲醇配制成質量濃度10 mg/L溶液,用PBS(0.01 mol/L,pH7.4))稀釋到500 μg/L作為標準貯備液。使用前配制成質量濃度梯度為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/L的CPAOZ的標準工作曲線。

1.2.2 CPAOZ-OVA酶標記物的制備 參考文獻[25]溶解5 mg HRP于1 mL 0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5.6)中,加入新配置的0.1 mol/L過碘酸鈉0.5 mL,置4 ℃冰箱反應30 min。反應完后加0.5 mL 2.0%的乙二醇,4 ℃反應30 min。向活化的酶溶液中加入0.5 mL 3 mg/mL CPAOZ-OVA(10%甲醇溶解)溶液混勻,于4 ℃先用蒸餾水透析2次,再換用0.01 mol/L PBS(pH7.4)透析2 d。透析完畢后取出,3000 r/min離心30 min,除去沉淀,上清液即為酶標記物。

1.2.3 固相包被抗體制備 將CPAOZ單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH9.6)稀釋至0.1 mg/L,96孔微孔板中各加入200 μL,37 ℃放置過夜,棄去包被液,加入封閉液,每孔20 μL,封閉3 h。棄去封閉液,烘干,備用。

1.2.4 酶標記物效價測定 取包被單克隆抗體的板條,將制備好的酶標記物從1:100開始倍比稀釋,每孔加入100 μL,室溫反應30 min,再加入100 μL底物溶液顯色,室溫避光20 min,終止后,酶標儀以單波長450 nm測吸光值。以蒸餾水做空白對照。

1.2.5 反應條件優化 將CPAOZ單克隆抗體1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000 4種稀釋度包被,加入50 μL標準品和100 mL稀釋度為1∶1000的酶標記物,確定最佳包被稀釋度。用最佳包被稀釋度包板,加入50 μL標準品和質量濃度為0.1、0.4、0.8、1.6 mg/L的酶標記物,確定最佳的酶標記物濃度。

1.2.6 直接競爭AOZ-ELISA操作步驟 取包被好的板條,加入50 μL標準品(或處理好的樣品)到相應的微孔中,加入分析緩沖液稀釋的酶標記物100 μL,室溫避光反應30 min,將微孔中的反應液甩掉,再將清洗液加滿每一微孔后甩掉,重復洗3次。在每一微孔加入底物溶液100 μL后,在室溫下避光靜置20 min。每一微孔加入100 μL反應終止液,酶標儀以單波長450 nm判讀。

1.2.7 樣品處理

1.2.7.1 測物為組織(魚肉、蝦肉,雞肉) 衍生反應:取1 g均質樣品于離心管中,加入4 mL H2O和0.5 mL HCl及100 μL衍生試劑。振蕩混合1 min。置于37 ℃烘箱靜置過夜(約16 h)。

萃取流程:加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4,0.4 mL NaOH,5 mL乙酸乙酯。振蕩混合約1 min。離心10 min(3000 r/min)。取2 mL上層溶液(乙酸乙酯層)至10 mL玻璃瓶中。于50 ℃下,利用氮氣將乙酸乙酯層快速吹干。加入1 mL正己烷,先將殘余物完全溶解,再加入1.6 mL PBS,3000 r/min離心10 min。取下層溶液進行檢測。樣品稀釋倍數為4。

1.2.7.2 待測物為生乳 生乳需先離心10 min(3000 r/min),避開上層乳脂,取下層液1 mL置入離心管中,加入4 mL H2O和0.5 mL 1 mol/L HCl及100 μL衍生試劑,其余歩驟同組織。

1.2.7.3 待測物為蜂蜜 取1 mL蜂蜜樣品置入離心管中,加入1 mL H2O,0.5 mL 1 mol/L HCl,10 mL正己烷。振蕩混合約1 min,用離心機離心10 min(3000 r/min),置于-20 ℃冷凍60 min。移去上層液后,50 ℃水浴,將冷凍層融化。加入50 μL衍生試劑,振蕩混合約1 min。其他步驟同組織樣。

1.2.8 考核指標 靈敏度:以10%抑制率的對應濃度作為最低檢測限(LOD),抑制率20%～80%作為定量線性檢測范圍。

式(1)

式中，B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值,B0為0濃度的平均吸光度值。

特異性:將AOZ的結構類似物呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因及其衍生物配成不同質量濃度的溶液,采用ELISA方法檢測其IC50,計算交叉反應率。

式(2)

回收率:向各種陰性樣品中分別添加不同質量濃度的AOZ標準品,處理后用ELISA方法檢測,每個濃度作3個平行測定。

1.2.9 進口試劑盒檢測結果對比 與德國拜發ELISA試劑盒檢測相同的樣品,對結果進行比較。兩種試劑盒分別對相同的樣品進行檢測,計算拜發試劑盒檢測樣品的回收率,以拜發試劑盒檢測結果為參考計算試劑盒樣品檢測回收率。

2 結果與分析

2.1 HRP-CPAOZ-OVA酶標記物效價測定

由圖1可知,酶在標記抗原的過程中,酶活損失較小,標記后酶活力很高,酶標記物效價都在1∶101200以上,可以滿足后期檢測的要求。

圖1 酶標記物效價曲線(n=3)Fig.1 Titer determination curve of enzyme labled antigen(n=3)

2.2 反應條件優化

抗原和抗體的質量濃度對免疫檢測方法的靈敏度和特異性有重要的影響,因此有必要對抗體和抗原的濃度進行優化。

2.2.1 最佳抗體稀釋度的確定 以最高OD值(Amax)、IC50和Amax/IC50為綜合參考指標,由圖2可知,最高OD值與包被抗體濃度呈正比,抗體濃度過高時,抗體與酶標抗原結合過多,方法的靈敏度下降。當抗體稀釋倍數2000時,與稀釋倍數4000時IC50比較接近,但稀釋4000倍表示靈敏度的Amax/IC50數值最大,靈敏度最高,其最高OD值也在適宜的范圍內,所以選擇包被抗體的稀釋度為4000。

圖2 包被抗體稀釋度曲線Fig.2 Dilution curve of antibody

2.2.2 最佳酶標抗原濃度確定 選擇包被抗體稀釋度為1∶4000,選擇不同濃度的酶標抗原做直接競爭ELISA實驗,結果如圖3所示。隨著酶標抗原的濃度降低,最高OD值隨之下降,在酶標抗原濃度為0.8 mg/L時,Amax值在適宜的范圍內,IC50值最小,Amax/IC50最大,此濃度下體系的靈敏度最高。故選擇此濃度為最佳的酶標抗原濃度。

圖3 酶標抗原濃度曲線Fig.3 Concentration curve of HRP-CPAOZ-OVA

2.3 AOZ-ELISA方法考核

2.3.1 方法靈敏度 在優化條件下,以標準溶液質量濃度(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/L)的對數值做橫坐標,以抑制率為縱坐標繪制標準曲線,如圖4所示。

圖4 AOZ-ELISA標準曲線(n=3)Fig.4 Standard curve of AOZ-ELISA(n=3)

在一系列條件優化的基礎上方法LOD(IC10)為0.015 μg/L,IC50為0.08 μg/L,線性檢測范圍0.025～0.5 μg/L,R2=0.9902,線性關系良好。

2.3.2 方法特異性 將AOZ的結構類似物及其衍生物配成不同質量濃度的溶液作為被測物,采用ELISA方法測定其IC50。結果如表1所示,與呋喃妥因衍生物的交叉反應率為0.5%,與其他結構類似物基本沒有交叉反應,說明抗體對AOZ衍生物特異性很高。

表1 交叉反應率的測定

2.3.3 方法準確度 樣品加標回收率是評價ELISA檢測方法準確度的一個重要指標。對樣品進行檢測時,由于抗體對AOZ基本不識別,所以需要對樣品進行衍生化處理,以對醛基苯甲酸作為衍生試劑使藥物轉化成衍生產物。添加回收實驗中,模擬實際樣品,向待測樣品中添加AOZ標準品。根據方法的檢測限及稀釋倍數添加濃度為0.4、1.0和1.5 μg/kg,檢測樣品分別為魚肉、蝦肉、雞肉、生乳和蜂蜜。由表2可見,組織樣品和生乳樣品添加回收率在80%～120%之間,蜂蜜樣品添加回收率在82.0%～121.0%之間,符合檢測的要求,說明該方法重復性好,準確度高,滿足實際樣品的檢測要求。

表3 兩種試劑盒檢測結果比較

表2 回收率實驗結果

2.3.4 檢測結果對比 采用德國拜發呋喃唑酮試劑盒檢測相同的樣品,與本研究建立的ELISA方法比較,確定其回收率,檢測方法的可信度。以拜發ELISA試劑盒的檢測結果為依據計算回收率,結果如表3所示,回收率在可接受的范圍內,兩種方法對相同樣品的測定值接近,建立直接競爭ELISA的方法結果準確、可靠。

3 結論

本研究利用辣根過氧化物酶成功標記抗原,標記后酶標記物的效價可以滿足檢測要求,建立了直接競爭呋喃唑酮酶聯免疫分析方法。該方法包被抗原的稀釋倍數為4000,酶標抗原的工作濃度為0.8 mg/L;在CPAOZ質量濃度在0.025～0.5 μg/L時有較好的線性關系,檢測限為0.015 μg/L,IC50為0.08 μg/L,與其他結構類似物不存在交叉反應,實際樣品檢測平均回收率在82.0%～121.0%之間。相比現有的酶聯免疫檢測方法,本方法檢測速度快、靈敏度和穩定性有了明顯的提高,與進口試劑盒進行比較,檢測結果準確可靠,可以滿足現有的檢測需要,具有良好的應用前景。

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Direct competitive ELISA with HRP labeled antigen for determination of furazolidone metabolite residues

FAN Xiao-bo1,XU She-hui2,JIANG Bao1,CHAI Xi-chun1

(1.Weinan Testing & Inspection and Research Center of Agricultural Products and Food,Weinan Vocational & Technical College,Weinan 714000,China;2.Guangzhou Ruisen Biotechnology Corporation,Guangzhou 511400,China)

In this study,a rapid and high sensitive direct competitive enzyme-linked immunoassay(dc-ELISA)method based on the antigen labeled by Horseradish Peroxidase(HRP)was established,which could be applied to the detection of 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ)that is a metabolite of furazolidone in real sample. In the direct competitive assay,monoclonal antibody was bound on the surface of a microtiter plate,then the standards(or the sample)competed with CPAOZ antigen for the antibody binding sites. Calibration curve was prepared for 3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]amino}-2-oxazolidinone(CPAOZ),the IC50of dcELISA was 0.08 μg/L,the limit of detection was 0.015 μg/L,detection range was 0.025～0.5 μg/L. The recoveries of all kinds of samples were range from 82.0% to 121.0%. There was almost no cross reaction with other drugs of similar construction. The conclusion suggested that the AOZ-ELISA was a great method with high sensitivity for detecting AOZin samples.

furazolidone;3-amino-2-oxazolidinone(AOZ);Horseradish Peroxidase(HRP)labeled antigen;direct competitive ELISA(dc-ELISA)

2015-02-12

樊曉博(1984-)，女，碩士研究生，講師，研究方向:食品快速檢測技術,E-mail：shine2786@163.com。

渭南職業技術學院青年科研基金項目(WZYQ201405)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)21-0318-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.057