模擬腸道環境下腸道益生菌對三種重金屬離子的富集作用的研究

張 何,羅程印,傅 昕

(湖南工程學院化學化工學院,湖南湘潭 411104)

模擬腸道環境下腸道益生菌對三種重金屬離子的富集作用的研究

張 何,羅程印,傅 昕

(湖南工程學院化學化工學院,湖南湘潭 411104)

本研究考察了嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌三種腸道益生菌在模擬腸道環境條件下生長情況及對Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性。結果顯示:嗜酸乳桿菌對Cr6+有較強的吸附和富集作用,最大吸附率為70%,吸附量為0.0021 mg/g;嗜熱鏈球菌對Cr6+、Cd2+均有較強的吸附和富集作用,最大吸附率分別為50%和62%,吸附量分別為0.0015 mg/g和0.1057 mg/g;雙歧桿菌對Cr6+、Cd2+均有較強的吸附和富集作用,最大吸附率分別為66.6%和69.9%,吸附量分別為0.0019 mg/g和0.1298 mg/g;三種腸道益生菌在模擬腸道環境下對Pb2+均無明顯吸附作用。

腸道益生菌,腸道環境,重金屬離子,富集

隨著人類對重金屬的開采、冶煉、加工以及工業廢水的不當排放,造成大量重金屬如鉛、汞、鎘、鉻等進入大氣、水、土壤中,造成了嚴重的環境污染。近年來,食品安全事件也頻頻發生[1-3]。在對重金屬處理的方法中,生物處理技術已被證明比傳統的化學沉淀法、離子交換法、活性炭吸附法等更為優越,而生物處理法中目前應用最多的是生物吸附法[4-5]。當前發現的通?？梢晕街亟饘匐x子的微生物種類較多[6-9],主要是由細菌[10]、真菌[11]和藻類[12]組成。

益生菌(Probiotics)是一種通過改善宿主腸道微生物平衡而發揮作用的活性微生物,具有廣泛的生理功效,能夠為人體營養和健康提供良好的保障[13-19]。由于益生菌對人體有著極其重要的保健功能,已被廣泛應用于食品、醫藥保健等領域,如活性益生菌乳飲料、酸奶等。然而,腸道益生菌對于腸道中重金屬的吸附及轉化性能研究還未見報道。

環境中污染物對人體的生物有效性胃腸體外實驗始于營養學研究食物中鐵元素對人體的生物有效性[20]。MRS培養基是一種用于模擬體外胃腸道環境的常用細菌培養基[21-22],而對于重金屬離子的體外腸道模擬分析,由于pH對其溶解析出有較大的影響,腸道模擬方法中的pH一般控制在5.5～7.5左右[23]。本研究考察了三種腸道益生菌(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌)在模擬腸道環境條件下對重金屬(鉻、鎘、鉛)的吸附性能,探索其減弱重金屬危害的有益性,可更加全面的認識腸道益生菌的健康維護作用,能夠為益生菌在食品中的進一步應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三種腸道益生菌(嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus),嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus),雙歧桿菌(Bifidobacterium) 北京豫鼎鑫捷科技有限公司;酵母膏、蛋白胨 青島高科園海博生物技術有限公司;吐溫80、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、葡萄糖、六次甲基四胺、重鉻酸鉀、二甲酚橙、孔雀綠、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸鎘、硝酸鉛 生工生物工程上海(股份)有限公司;二苯碳酰二肼 上?？婆d商貿有限公司;所用試劑均為分析純,使用前未進一步純化,實驗用水為電阻率大于18 MΩ·cm 的超純水。

電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器公司;TDL-40B型離心機、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上?；|實驗儀器設備有限公司;UV-1800 型紫外-可見分光光度計 日本島津公司;超純水器 重慶力德高端水處理設備;厭氧培養罐 瑞世康科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 益生菌的培養 為了考察模擬腸道環境下益生菌對金屬離子的富集作用,采用MRS為細菌培養基,溫度控制在37 ℃左右,pH為6.8。采用的MRS培養基成分為:酵母膏5.0 g;吐溫80 1.0 mL;乙酸鈉5.0 g;磷酸氫二鉀2.0 g;檸檬酸氫二銨2.0 g;牛肉膏10 g;硫酸鎂0.58 g;硫酸錳0.189 g;葡萄糖20.0 g;蛋白胨10 g;蒸餾水1000 mL,pH調節至6.8,在121 ℃蒸汽滅菌30 min。將實驗室保藏的菌種劃線接種到MRS固體培養基,37 ℃培養24～32 h,長出單菌落后進行革蘭氏染色鏡檢,確定為純種,再將純菌種接種到MRS液體培養基中擴增。接種后,于37 ℃、180 r/min條件下培養,而由于雙歧桿菌需要在厭氧靜置條件下培養,但為了增加傳值,每天搖動培養瓶2～3次。

1.2.2 三種重金屬標準曲線的測定

1.2.2.1 六價鉻(K2Cr2O7)標準曲線 分別準確移取0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mL的鉻標準溶液(1×10-5mol/L)于7個50 mL容量瓶中,再向每個50 mL容量瓶中加入0.5 mL未加鉻離子的空白MRS培養液,依次加入0.6 mL(1+1)H2SO4(1體積濃硫酸加1體積蒸餾水等體積混合)和1.0 mL二苯碳酰二肼溶液,立即混勻,用蒸餾水定容到刻度,再靜置反應5 min后,以不加Cr6+溶液為參比,在540 nm波長測定其吸光度,然后繪制吸光度與鉻離子濃度的標準曲線[24]。

1.2.2.2 二價鎘(Cd(NO3)2)標準曲線 將0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的10 mg/L的鎘標準溶液分別加入到50 mL的容量瓶中,然后加入0.5 mL 未加鎘離子的空白MRS培養液,再分別加入5 mL六次甲基四胺-KNO3-HNO3緩沖溶液(pH6.3),4.0 mL的0.1%二甲酚橙水溶液,再用蒸餾水定容到刻度,搖勻靜置20 min,于室溫25 ℃時,以不加Cd2+溶液為參比,在波長為578.4 nm處測定吸光度并繪制標準曲線[25]。

1.2.2.3 二價鉛(Pb(NO3)2)標準曲線 將0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的100 mg/L的鉛標準溶液依次加入到50 mL的容量瓶中,分別加入0.5 mL未加鉛離子的空白MRS培養液,然后分別加入2 mL 0.05% 孔雀綠,2 mL pH4.0的Clark-Lubs緩沖溶液,10 mL KI(10%),用蒸餾水定容至刻度,靜置反應10 min,以不加Pb2+溶液為參比,在波長為700 nm處測定吸光度并繪制標準曲線[26]。

1.2.3 三種腸道益生菌對三種重金屬的吸附特性測定 三種腸道益生菌分別在加入一定濃度重金屬離子(六價鉻(0.05 mg/L)、二價鎘(0.3 mg/L)、二價鉛(2 mg/L))的模擬腸道環境的MRS培養基中培養,平行三次。在無菌操作下每隔4 h移取5 mL腸道益生菌(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌)MRS培養液于離心管中,在4000 r/min下離心10 min后,移取0.5 mL上清培養液于50 mL容量瓶中待測,另取一50 mL容量瓶加入0.5 mL MRS培養液(未加重金屬離子)作為對照,依次加入相應的反應試劑(所加試劑與標準曲線測定試劑一致),立即搖勻,用蒸餾水定容至刻度。反應完成后,在相應波長下測定其吸光度,然后由標準曲線計算出溶液中重金屬離子的濃度。

2 結果與分析

2.1 三種重金屬離子標準曲線的建立

圖1 Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的測定標準曲線Fig.1 Standard curve of Cr6+(a), Cd2+(b)and Pb2+(c)determination

2.2 嗜酸乳桿菌對Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

微生物對重金屬的吸附作用機理為:重金屬對微生物的生長代謝過程有著非常重要的作用,比如Zn、Ni、Cr等在微生物的生化反應過程中起著催化劑的作用,可以穩定蛋白質的結構、細胞壁以及可以維持滲透壓的平衡;而Ag、Cd、Hg、Pb等非必需元素則可以取代結合位點的必需元素,能夠與配基反應,從而達到吸附及富集的作用[27]。

嗜酸乳桿菌是一類存在于胃和小腸內具有調整腸道菌群平衡、抑制腸道不良微生物的增殖益生菌?？疾炝耸人崛闂U菌在模擬腸道環境的培養過程中對三種重金屬離子的吸附特性。從圖2曲線a可看出,嗜酸乳桿菌對Cr6+的吸附一直到培養12 h時仍不明顯,但在12 h培養后,對Cr6+的吸附能力迅速上升,在培養36 h時吸附率達到最大,吸附率可達初始濃度的70%,吸附量為0.0021 mg/g。然而,在培養36 h后,嗜酸乳桿菌對Cr6+的吸附率逐漸下降,可能由于菌齡的增加、菌體老化、活力降低等因素導致嗜酸乳桿菌對Cr6+的吸附能力下降,在培養48 h時其吸附率降低到初始濃度的36%。由此可以說明嗜酸乳桿菌對Cr6+有較強的吸附和富集作用。從圖2曲線b可看出嗜酸乳桿菌直到培養12 h后,對Cd2+的吸附能力才開始逐漸增強,吸附率達到初始濃度的14.3%,在培養36 h時吸附率達到最大,僅為初始濃度的20.6%,由此說明嗜酸乳桿菌對Cd2+有較弱的吸附和富集作用。從圖2曲線c可看出,嗜酸乳桿菌對Pb2+未有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據圖2可以知道,嗜酸乳桿菌只對Cr6+有較強的吸附特性,同時這種吸附性在一定程度上受到環境的影響(如菌齡、pH等),而對Cd2+只有較弱的吸附能力。

圖2 嗜酸乳桿菌對Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.2 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c)by Lactobacillus acidophilus

2.3 嗜熱鏈球菌對Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

嗜熱鏈球菌被認為是“公認安全性(GRAS)”成分,廣泛用于生產一些重要的發酵乳制品,包括酸奶和奶酪,且對人體具有多種保健作用,如抗癌、調節血壓、延緩衰老等。

考察了嗜熱鏈球菌在模擬腸道環境的培養過程中對三種重金屬離子的吸附特性。從圖3曲線a可看出,在嗜熱鏈球菌的培養過程中,對Cr6+的吸附在培養16 h前未有明顯變化,但在培養16 h后對Cr6+的吸附率迅速上升,在24 h時吸附率達到最大,吸附率達到初始濃度的50%,吸附量為0.0015 mg/g,但在培養24 h后可能由于菌齡等因素的影響,嗜熱鏈球菌對Cr6+的吸附能力下降,在培養40 h時其吸附率降低到初始濃度的38.6%。從圖3曲線b可看出,嗜熱鏈球菌對Cd2+也具有較強的吸附和富集作用,培養12 h后吸附能力開始加強,在24 h時達到最大,吸附率達到初始濃度的62%,吸附量為0.1057 mg/g。其后隨著培養時間的延長,嗜熱鏈球菌對Cd2+的吸附能力開始下降,在培養40 h時其吸附率降低到初始濃度的39.3%。從圖3曲線c可看出,嗜熱鏈球菌對Pb2+未有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據圖3可以知道,嗜熱鏈球菌對Cr6+、Cd2+都有較強的吸附特性,但這種吸附性在一定程度上也受到環境的影響(如菌齡、pH等)。

圖3 嗜熱鏈球菌對Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.3 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Streptococcus thermophilus

2.4 雙歧桿菌對Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

雙歧桿菌是人體腸道中的一種重要的益生菌,因其末端常常分叉而得名,其保健作用包括:腫瘤防治、保護肝臟、防治心血管疾病等?？疾炝穗p歧桿菌在模擬腸道環境的培養過程中對三種重金屬離子的吸附特性。從圖4曲線a可看出,培養12 h前雙歧桿菌對Cr6+的吸附較少,但培養12 h后對Cr6+的吸附率快速上升,32 h時吸附率達到最大,可達初始濃度的66.6%,吸附量為0.0019 mg/g。在培養32 h后雙歧桿菌對Cr6+的吸附率開始下降,表明雙歧桿菌對Cr6+的吸附能力下降,在培養40 h時其吸附率降低到初始濃度的25.9%,由此可見嗜熱鏈球菌對Cr6+有較強的吸附和富集作用。從圖4曲線b可看出,雙歧桿菌對Cd2+也具有較強的吸附和富集作用,培養8 h后吸附開始加強,在20 h時達到最大,可達初始濃度的69.9%,吸附量0.1298 mg/g。在隨后的培養中雙歧桿菌對Cd2+的吸附性能保持穩定,并不隨著菌齡的增加而降低,在培養40 h時其吸附量仍可達到初始濃度的67.9%。從圖4曲線c可看出,雙歧桿菌對Pb2+沒有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據圖4可以知道,雙歧桿菌對Cr6+、Cd2+都有很強的吸附特性。然而,雙歧桿菌對Cd2+的吸附并沒有受到培養環境的影響,在培養40 h時仍可達到67.9%,這說明雙歧桿菌與Cd2+的吸附方式更加穩定。

圖4 雙歧桿菌對Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.4 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Bifidobacterium

3 結論

通過對嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌培養液中Cr6+、Cd2+、Pb2+的測定,可以發現:嗜酸乳桿菌對Cr6+有較強的吸附和富集作用,在培養12 h時吸附率開始上升,36 h達到最大,隨后由于菌齡老化等因素,吸附率開始下降;嗜熱鏈球菌對Cr6+、Cd2+均有較強的吸附和富集作用,在培養16 h時對Cr6+吸附率開始上升,36 h達到最大,而對于Cd2+的吸附率是在培養12 h時開始上升,24 h達到最大,隨后嗜熱鏈球菌對這兩種離子的吸附率都開始下降;雙歧桿菌對Cr6+、Cd2+也有一定的富集作用,對Cr6+的吸附率是在培養12 h后開始上升,32 h時達到最大,隨后吸附率開始隨著培養時間的延長逐漸下降,而對Cd2+的富集顯得更加明顯,在培養8 h后吸附率開始上升,20 h時達到最大,且隨著培養時間的延長,雙歧桿菌對Cd2+的吸附能力并不降低,根據“吸附+細胞膜傳輸”模型,可能是生長的雙歧桿菌對Cd2+具有胞內運輸的能力;嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌在模擬腸道環境下對Pb2+均無明顯富集作用。該研究的完成進一步了解了腸道益生菌的保健作用,證明了腸道益生菌可通過吸附或胞內運輸作用減輕腸道對重金屬的吸收,可為其在食品中的進一步應用提供支持。

[1]Bagchi D,Bagchi M,Stohs S J. Chromium(VI)-induced oxidative stress,apoptotic cell death and modulation of p53 tumor suppressor gene[J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2001,222:149-158.

[2]Shrivastava R,Upreti R K,Seth P K,et al. Chromium on the immune system[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology,2002,34:1-7.

[3]Mirsalis J C,Hamilton C M,O'Loughlin K G,et al. Chromium(VI)at plausible drinking water concentrations is not genotoxic in theinvivobone marrow micronucleus or liver unscheduled DNA synthesis assays[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis,1996,28:60-63.

[4]Liu R X,Tang H X,Zhang B W. Removal of Cu,Cd and Hg from wastewater by poly(acylaminophosphonic)-type chelation fiber[J]. Chemosphere,1999,38(13):3169-3179.

[5]Nejmeddine A,Fars S,Echab A. Removal of dissolved and particulate form of metals(Cu,Zn,Pb,Cd)by an anaerobic pond system in Marrakesh[J]. Environmental Technology,2000,21(2):225-230.

[6]Srivastava S,Thakur I S. Evaluation of bioremediation and detoxification potentiality of Aspergillus niger for removal of hexavalent chromium in soil microcosm[J]. Soil Biology and Biochemistry,2006,38(7):1094-1911.

[7]Pal A,Ghosh S,Paul A K. Biosorption of cobalt by fungi from serpentine soil of Andaman[J]. Bioresource Technology,2006,97(10):1253-1258.

[8]Say R,Denizli A,Arica M Y. Biosorption of cadmium(II),lead(II)and copper(II)with the filamentous fungus Phanerochaete chrysosporium[J]. Bioresource Technology,2001,76(1):67-70.

[9]Wang J,Chen C. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae:A review[J]. Biotechnology Advances,2006,24(5):427-451.

[10]Arjomandzadegan M,Rafiee P,Moraveji M K,et al. Efficacy evaluation and kinetic study of biosorption of nickel and zinc by bacteria isolated from stressed conditions in a bubble column[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014,7S1:S194-198.

[11]Kan S H,Sun B Y,Xu F,et al. Biosorption of aquatic copper(II)by mushroom biomass Pleurotus eryngii:kinetic and isotherm studies[J]. Water Science and Technology,2015,71(2):283-288.

[12]Dixit S1 Singh D P. Role of free living,immobilized and non-viable biomass of Nostoc muscorum in removal of heavy metals:an impact of physiological state of biosorbent[J]. Cellular and molecular biology(Noisy-le-Grand),2014,60(5):110-118.

[13]陳衛,翟齊嘯. 益生菌對食品安全危害因子的拮抗與減除[J]. 中國食品學報,2014,14(11):1-10.

[14]周雨霞,候先志. 益生菌與腸道疾病[J]. 中國微生態學雜志,2006,18(2):147-148.

[15]Didari T,Mozaffari S,Nikfar S,et al. Effectiveness of probiotics in irritable bowel syndrome:Updated systematic review with meta-analysis[J]. World Journal of Gastroenterology,2015,21(10):3072-3084.

[16]董坷,劉晶晶,郭曉奎. 益生菌增強機體免疫和抗腫瘤作用的分子機制[J]. 中國微生態學雜志,2005,17(1):79-81.

[17]薛超輝,張蘭威,張迎春,等. 篩選具有抑制引起腹瀉致病菌黏附功能的益生菌[J]. 食品工業科技,2015,36(2):227-230.

[18]張娟,楊彩梅,曹廣添,等. 解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應用[J]. 動物營養學報,2014,26(4):863-867.

[19]陳佩,黨輝,張秋香,等. 1株具有潛在降糖作用的益生菌的篩選[J]. 中國食品學報,2014,14(11):27-33.

[20]Miller D D,Schricker B R,Rasmussen R R,et al. An in-vitro method for estimation of iron availability form meals[J]. American Journal of Clinical Nutrition,1981,34(10):2248-2256.

[21]徐麗丹,鄒積宏,袁杰利. 一株降血壓功能乳酸菌在模擬胃腸環境中抗性的研究[J]. 中國微生態學雜志,2011,23(2):112-114.

[22]賴文,劉書亮,張倩穎,等. 降膽固醇乳酸菌鑒定及其在體外模擬胃腸環境中抗性研究[J]. 中國釀造,2011,3:90-93.

[23]張東平,余應新,張帆,等. 環境污染物對人體生物有效性測定的胃腸模擬研究現狀[J]. 科學通報,2008,53(21):2537-2545.

[24]裴翠錦,姚國光,周福林,等. 紫外分光光度法測定水中鉻(VI)的方法研究[J]. 湖北農業科學,2009,48(4):4-5.

[25]蔣桂華,王曉菊,唐燕紅,等. 分光光度法測定海產品中微量鎘[J]. 光譜學與光譜分析,1999,19(3):474-475.

[26]吳霖生,任煒. 分光光度法水相快速測定鉛[J]. 滁州學院學報,2008,10(5):65-66.

[27]吳海江,茆燦泉,郭紅光. 微生物與重金屬作用機理研究[J]. 安徽農業科學,2009,37(11):5068-5071.

Study on the enrichment of intestinal probiotics to three heavy metal ions under simulated intestinal environment

ZHANG He,LUO Cheng-yin,FU Xin

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China)

In this paper,the absorption characteristics ofLactobacillusacidophilus,StreptococcusthermophilusandBifidobacteriumto Cr6+、Cd2+、Pb2+under the simulated intestine environment were studied. The results indicated theLactobacillusacidophilushad strong adsorption and enrichment to Cr6+,and the adsorption ratio was 70% and the adsorption amount was 0.0021 mg/g.Streptococcusthermophilusalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 50% and 62%,and the adsorption amount was 0.0015 mg/g and 0.1057 mg/g,respectively.Bifidobacteriumalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 66.6% and 69.9%,and the adsorption amount was 0.0019 mg/g and 0.1298 mg/g,respectively. There was no obvious adsorption of Pb2+among the three kinds of intestinal probitics under simulated intestinal environment.

intestinal probiotics;intestinal environment;heavy metal ions;enrichment

2015-01-23

張何(1977-),男,博士,副教授,研究方向:生物分析化學,E-mail:mzhang_he@126.com。

湖南省自然科學基金(2015JJ2039,14JJ3133);湖南省教育廳優秀青年基金(12B029);湖南工程學院博士啟動基金。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.064