橄欖苦苷對糖尿病大鼠腎組織的保護作用及其機制

王 昱,王勝青,葉文斌,何九軍,祁林林

(1.隴南師范高等?？茖W校生化系,甘肅成縣 742500;2.中國科學院遺傳與發育生物學研究所,北京 100101)

橄欖苦苷對糖尿病大鼠腎組織的保護作用及其機制

王 昱1,王勝青1,葉文斌1,何九軍1,祁林林2

(1.隴南師范高等?？茖W校生化系,甘肅成縣 742500;2.中國科學院遺傳與發育生物學研究所,北京 100101)

為了探討橄欖苦苷對糖尿病大鼠腎組織的保護作用及其機制。將雄性SD大鼠隨機分成正常組、糖尿病模型組、橄欖苦苷組和陽性藥物貝那普利組,采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型1周后,給予橄欖苦苷或陽性藥物貝那普利治療7周。檢測大鼠尿、血液和腎臟的各項指標。結果顯示,與模型對照組相比,橄欖苦苷明顯降低糖尿病大鼠腎臟指數、血糖、血脂、Scr、BUN、UA、UALB、UAER水平,降低MDA含量(p<0.05,p<0.01),提高血清IgG、IgM和補體C3、C4含量、腎臟端粒酶、SOD、CAT活性(p<0.05,p<0.01),抑制腎臟TGF-β1和Smad4的表達(p<0.05,p<0.01)。提示橄欖苦苷對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟具有明顯的保護作用,其機制可能與其提高了腎臟的抗氧化能力和端粒酶活性及機體的免疫功能,抑制腎臟TGF-β1和Smad4的表達有關。

橄欖苦苷,糖尿病腎病,抗氧化酶,轉化生長因子β1,Smad4

糖尿病性腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病引起的嚴重和危害性最大的一種慢性并發癥,是糖尿病全身性微血管病變表現之一,臨床特征為蛋白尿、高血壓、水腫、腎功能衰竭等,也是糖尿病患者死亡最常見的病因之一[1]。早期干預性治療對改善 DN的預后至關重要,但DN確切的病因及發病機制還不清楚,現代醫學尚無有效的方法能夠防止其發生和惡化。近年來研究認為,糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等代謝紊亂、遺傳易感性及單核細胞趨化蛋白-1、細胞間黏附分子-1和轉化生長因子β1表達增加等因素在DN的發病機制中起重要作用[2]。目前西醫防治糖尿病腎病中,藥物副作用較大,而且僅通過嚴格控制血糖來降低DN發病的效果不明顯、不長久。因此,尋找新的防治糖尿病腎病的方法和途徑已成為重要的研究課題。

油橄欖,俗稱洋橄欖(OleaeuropaeaL.),系木犀科植物,油橄欖是以“高產、優質、高效”為特征的世界名貴常綠木本油料和果用樹種。有多篇文獻報道過橄欖油和橄欖葉的粗提物中含大量的多酚、黃酮類天然活性物質,有降血糖、抗高血壓、抗氧化及抗微生物作用,還有促進骨骼鈣化、防治骨質疏松、預防鈣質流失等作用[3-4]。橄欖苦苷是油橄欖中最主要的含量最多的成分,但關于橄欖苦苷的藥理作用研究較少。本實驗建立了鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠模型,給藥后觀察大鼠尿、血液、腎組織生化指標的變化,以此研究橄欖苦苷對STZ誘導的腎損傷是否有效果,同時探討橄欖苦苷對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟保護的可能機制,為油橄欖的基礎研究和臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橄欖苦苷(純度≥98%) 隴南田園油橄欖科技開發有限公司;鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司;超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所;貝那普利片(10 mg/片,批號:0804Xl07) 北京諾華制藥有限公司生產;端粒酶PCR檢測ELISA試劑盒 上海嶸崴達實業有限公司;白蛋白(ALB)放射免疫試劑盒 天津協和醫學科技有限公司;NN-GS575M微波爐 日本松下公司。

One TouchⅡ型自動血糖分析儀 美國強生公司;U-1800型UV-VIS全自動分光光度計 日本島津公司;SpectraMax M5型酶標儀 美國Molecular Devices公司;全自動生化分析儀、TGL-16M高速臺式冷凍離心機 美國Beckman-coulter公司;DKZ系列恒溫水浴箱 上海一恒科技有限公司;Nikon FX-35WA顯微鏡 日本Nikon 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立與給藥 雄性SD大鼠40只(清潔級,購于蘭州大學實驗動物中心),在光-暗周期12 h、溫度(22±4)℃的環境下飼養一周后,按體重隨機分正常組、糖尿病模型組、橄欖苦苷組和陽性藥物貝那普利組,每組10只。除正常組外,其余各組動物單次腹腔注射STZ 65 mg/kg,72 h后尾靜脈取血,測全血空腹血糖≥16.7 mmol/L,確定為DM模型,血糖穩定1周后列入觀察對象[2]。模型建立后第2 d起,橄欖苦苷組每天灌胃100 mg/kg的橄欖苦苷[5],陽性藥物組每天灌胃10 mg/kg貝那普利,每日于上午9:00給藥1次,連續灌胃7周,正常組和糖尿病模型組每天灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥后次日以代謝籠收集24 h尿液,之后將4組大鼠全部處死,采用主動脈取血,再迅速剝離出雙側腎臟,精確稱重后,計算腎臟指數。公式為腎臟指數=大鼠腎臟重量/大鼠體重×1000。

1.2.2 血糖、血脂、腎功能、24 h尿白蛋白定量及尿白蛋白排泄率的檢測 用放免法測定尿微量尿白蛋白(UALB),并計算24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)。用One TouchⅡ自動血糖儀測定血糖,用全自動生化分析儀測定血甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)。

1.2.3 血清IgG、IgM和補體C3、C4含量及腎臟端粒酶活性的測定 取大鼠動脈血漿離心10 min(3000 r/min),取上層血清,按照ELISA檢測試劑盒說明書的方法測定IgG、IgM和補體C3、C4含量。取大鼠腎臟按照PCR-ELISA試劑盒操作步驟測定端粒酶活性,酶標儀450 nm處測定吸光度值。

1.2.4 抗氧化酶活性測定 取大鼠腎臟,在預冷的生理鹽水中漂洗,濾紙吸干,精確稱重后,滴加組織重量9倍的生理鹽水,置入勻漿器中在冰水中勻漿(5 min),再3000 r/min離心(10 min),用微量移液器吸取上清液按試劑盒的操作要求分別測定SOD、CAT的活性及MDA的含量。

1.2.5 免疫組化SP法檢測腎臟TGF-β和Smad4的表達 取大鼠腎臟數塊,迅速投入15%的中性福爾馬林液固定24 h,常規石蠟包埋切片(6 μm)。石蠟切片脫蠟至水,微波(先用高檔火加熱沸騰后改用中低檔加熱10 min)處理進行抗原修復,用3% H2O2室溫孵育10 min,正常兔血清室溫封閉30 min,然后用兔抗鼠Smad4和TGFβ1多克隆抗體(均為1∶100),4 ℃過夜,PBS洗滌,滴加生物素二抗羊抗兔IgG 30 min,SABC工作液孵育30 min,最后DAB顯色,蘇木素復染,空白對照以PBS代替一抗。常規乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與討論

2.1 橄欖苦苷對大鼠腎臟指數的影響

糖尿病模型大鼠腎臟出現腫大等病理現象,造成腎臟重量較正常對照組大鼠顯著增加(p<0.01),腎臟指數變大(表 1)。橄欖苦苷可以降低STZ對腎臟造成的影響,腎臟的腫大情況較糖尿病模型組有所緩解,腎臟指數顯著降低(p<0.01)。腎損傷出現后腎臟重量會明顯變重,出現腫大,造成腎臟指數增加,在臨床診療中已經作為判斷腎臟損傷的重要指標[2]。由表1可以看出,橄欖苦苷可以降低糖尿病模型大鼠的腎臟重量和腎臟指數,具有緩解腎臟損傷的效果。在減少腎臟指數方面,橄欖苦苷的效果顯著優于陽性藥物貝那普利(p<0.05)。

2.2 橄欖苦苷對大鼠血糖、血脂的影響

由表2可見,STZ誘導大鼠腎損傷后,糖尿病模型組大鼠的血糖、CHO和TG水平最高、HDL水平最低,正常組大鼠血糖、CHO和TG水平最低、HDL水平最高。陽性藥物組和橄欖苦苷組血糖、CHO和TG的水平較糖尿病模型組顯著下降(p<0.05,p<0.01),HDL的水平較糖尿病模型組顯著升高(p<0.05,p<0.01),但與正常組有差異。橄欖苦苷處理大鼠的血糖、血脂水平更為接近正常組,且與陽性藥物對照組沒有統計學差異(p>0.05)。血糖、血脂是診斷腎實質損害的重要檢測指標,其含量的高低可反映腎組織和糖脂代謝的改變[3]。當腎臟處于病理狀態時,腎臟的結構和功能發生變化,血糖、血脂的變化是最直觀的體現。橄欖苦苷能明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖、CHO和TG含量,升高HDL的含量,可見橄欖苦苷調整并改善了糖尿病模型大鼠的血糖和血脂水平。

表2 橄欖苦苷對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響±s,n=10)

表3 橄欖苦苷對糖尿病大鼠Scr、UA、BUN、UALB和UAER的影響

表 1 橄欖苦苷對糖尿病大鼠體重、腎臟重量和腎臟指數的影響±s,n=10)

注:與正常組比較:ap<0.05,bp<0.01;與糖尿病模型組比較:cp<0.05,dp<0.01;與陽性藥物組比較:ep<0.05. 同表2～表6同。

2.3 橄欖苦苷對大鼠腎功能和尿蛋白的影響

Scr是肌肉內磷酸肌酸經水解產生的,正常動物體內Scr產生速度比較穩定,但當腎小球濾過率降低時,Scr的含量會明顯高于正常狀態。BUN是人體蛋白質代謝的終末產物,血液中尿素全部從腎小球濾過,正常情況下大部分被腎小管重吸收,腎臟受損時,尿酸排出減少,從而使血液中的BUN升高[6]。故血清中Scr、BUN的含量若是增高則可以在一定程度上反映腎小管細胞損害的程度。UA是動物體內嘌呤核苷酸分解代謝的近終末產物,正常情況下人體的尿酸生成與排泄是平衡的,如果體內產生過多來不及排泄或者尿酸排泄機制受損,則體內尿酸滯留過多,血液中尿酸濃度會升高[7]。UALB是目前臨床上DN 的主要臨床表現之一,并且與 DN的腎臟損傷程度密切相關,而腎小球濾過屏障結構和功能的改變是引起DN蛋白尿的主要病理生理基礎[8]。因此,選用Scr、UA、BUN、UALB和UAER五個指標來反應腎損傷的情況。

由表3數據可以得出,與正常組相比,糖尿病模型組大鼠血清的Scr、UA、BUN和尿UALB、UAER水平顯著增高(p<0.01),表明模型組的腎功能異常、腎組織嚴重損傷。橄欖苦苷大鼠血清Scr、UA、BUN和尿UALB、UAER水平明顯低于模型組(p<0.05,p<0.01),可見橄欖苦苷可以減小腎損傷對Scr、UA、BUN、UALB和UAER水平的影響,起到對腎臟的保護作用。

2.4 橄欖苦苷對大鼠腎臟SOD、CAT的活性及MDA含量的影響

SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶,在清除活性氧自由基、減輕脂質過氧化作用和膜傷害等方面起著重要作用,從而保護機體免受自由基傷害[9]。CAT存在于紅細胞及某些組織細胞的微體中,催化H2O2轉化為H2O和O2而使機體免受H2O2的損傷。MDA是超氧化物陰離子自由基作用于生物膜磷脂結構不飽和脂肪酸所形成的終產物之一,機體組織MDA含量可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[4]。在糖尿病動物模型中,腎臟SOD和CAT活性顯著下降、MDA含量顯著升高,機體清除自由基的能力下降[10]。因此,檢測腎組織中 SOD、CAT、MDA指標可以預測腎氧化損傷的程度。

由表4可知,糖尿病模型組與正常組相比,SOD、CAT的活力顯著降低(p<0.01),橄欖苦苷組的SOD、CAT活力與糖尿病模型組相比較明顯升高(p<0.05,p<0.01)。說明橄欖苦苷能增強腎臟的抗氧化功能,對腎損傷有一定的治療作用。而糖尿病模型組的MDA含量相較于正常組顯著增高(p<0.01),橄欖苦苷組的MDA含量與糖尿病模型組相比較明顯降低(p<0.01),表明橄欖苦苷可抑制MDA的產生,從而可減小細胞損傷,這同時也說明橄欖苦苷有助于提高腎臟的抗氧化功能。在提高腎臟SOD、CAT活力、降低MDA含量方面,橄欖苦苷的效果顯著優于陽性藥物貝那普利(p<0.05)。

表4 橄欖苦苷對糖尿病大鼠腎臟SOD、CAT的活性及MDA含量的影響

2.5 橄欖苦苷對大鼠免疫功能和腎臟端粒酶活性的影響

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是評價機體體液免疫狀況的常用指標,其中IgG、IgM 是血清抗體的主要成分,其含量的多少,可反映機體的免疫應答能力和體液免疫的水平,補體(C3、C4)在人體的免疫應答及免疫適應中起著調理、免疫附著、吞噬、白細胞的化學趨化及中和病毒等重要作用。糖尿病患者的體液免疫出現異常,IgG、IgM和補體C3、C4水平下降[11]。端粒酶是基本的核蛋白逆轉錄酶,可將端粒DNA加至真核細胞染色體末端,使因每次細胞分裂而逐漸縮短的端粒長度得以補償,進而穩定端粒長度。端粒DNA作為細胞的“生命鐘”,端粒長短和穩定性決定細胞的壽命[12]。表5結果表明,與糖尿病模型組相比,橄欖苦苷組大鼠血清IgG、IgM 和補體 C3、C4含量及腎臟端粒酶活性明顯升高(p<0.05,p<0.01),且橄欖苦苷組與陽性藥物組大鼠腎臟端粒酶活性差異明顯(p<0.05),更為接近正常大鼠。說明橄欖苦苷可通過提高糖尿病模型大鼠血清中 IgG、IgM 和補體 C3、C4含量及腎臟端粒酶活性,增強機體的免疫功能,延緩腎臟衰老。

表5 橄欖苦苷對糖尿病大鼠血清IgG、IgM 和補體 C3、C4含量及腎臟端粒酶活性的影響±s,n=10)

表6 TGFβ1和Smad4在腎臟表達的平均光密度和積分光密度

2.6 橄欖苦苷對大鼠腎臟TGFβ1 和Smad4表達的影響

在DN的發生和發展中,有多種細胞因子、生長因子以及黏附分子參與了DN的形成,其中TGFβ1 和Smad4起關鍵作用。TGF-β1 屬于TGF-β超家族,是目前公認的致纖維化的重要細胞因子,通過自分泌和旁分泌方式直接作用于腎小管細胞,導致腎臟肥大,而 TGFβ1生物效應的發揮必須通過特定的信號分子Smad4轉導過程。Smad4 屬于Smads 家族,是TGFβ1的唯一底物,它們可將TGFβ1信號直接從細胞膜導入細胞核內[13]。在DN大鼠模型中,TGFβ1和Smad4的表達增加導致TGFβ1/Smad4途徑下游靶基因的轉錄調控,從而促進糖尿病大鼠腎臟纖維化的進展[14]。因此,抑制TGFβ1的產生及阻斷其特定的信號轉導過程是糖尿病腎病治療的重要途徑之一。

由表6可知,STZ誘導大鼠腎損傷后,糖尿病模型組大鼠腎臟TGFβ1 和Smad4表達最強烈、陽性細胞數最多,正常組大鼠腎臟TGFβ1 和Smad4表達最弱、陽性細胞數最少。陽性藥物組和橄欖苦苷組腎臟TGFβ1 和Smad4表達水平明顯下降(p<0.05,p<0.01),與正常組有差異。但橄欖苦苷處理大鼠腎臟TGFβ1 和Smad4表達水平更為接近正常組,與陽性藥物對照組差異明顯(p<0.05)。實驗結果表明,橄欖苦苷可以通過抑制糖尿病模型大鼠腎臟TGFβ1的表達直接抑制腎臟的損害,或通過抑制Smad4 的表達來阻斷 TGFβ1信號轉導通路,從而延緩DN的進程。結果見圖1。

圖1 橄欖苦苷對大鼠腎臟TGFβ1 和Smad4表達的影響Fig.1 Effect of oleuropein on expression of TGF-β1 and Smad4 in rat kidney注:1:正常組中TGFβ1的表達,→.示陽性產物,A.腎皮質,B.腎髓質,標尺示20 μm(2～10同);2:糖尿病模型組中TGFβ1的表達;3:橄欖苦苷組中TGFβ1的表達;4:陽性藥物組中TGFβ1的表達;5:正常組中Smad4的表達;6:糖尿病模型組中Smad4的表達;7:橄欖苦苷組中Smad4的表達;8:陽性藥物組中Smad4的表達;9:腎皮質陰性對照;10:腎髓質陰性對照。

3 結論

橄欖苦苷是油橄欖提取物中含量最多的成分,具有很高的生物活性。本文為探究橄欖苦苷是否對STZ誘導的腎損傷有影響,進行了動物模型實驗,結果顯示橄欖苦苷對糖尿病模型大鼠的腎臟具有一定的保護作用,其機制與可能與改善腎功能、提高端粒酶活性和抗氧化能力、增強免疫功能、抑制TGFβ1和Smad4的表達有關。橄欖苦苷作為一種天然產物,可作為預防和治療的良好保健品和藥物,進一步開發其之前所不為人知的利用價值,可以產生很好的經濟效益。

[1]肖煒. 腎康丸對糖尿病腎病TGF-β1/Smad信號通路的影響[D]. 廣州:第一軍醫大學,2006.

[2]錢燕,李素梅,葉山東,等.辛伐他汀對糖尿病大鼠的腎臟保護作用及其抗炎機制探討[J].中國新藥雜志,2008,17(14):1212-1215.

[3]Badawi S,Ahmed S,Al-Ani N. Effect of ethanol olive leaf and its callus ethanol extracts in alloxan-induced diabetic mice(blood glucose and lipid profiles)[J]. Journal of Biotechnology Research Center,2013,7(2):62-66.

[4]Wang Y,Wang SQ,Cui WH, et al. Olive leaf extract inhibits lead poisoning-induced brain injury[J]. Neural Regen Res,2013,8(22):2021-2029.

[5]尹營松,蘇占輝,劉麗艷,等.橄欖苦苷在大鼠體內藥代動力學研究[J].時珍國醫國藥,2012,23(8):1896-1898.

[6]Orchard TJ,Forrest KY,Kuller LH,et al. Lipid and blood pressure treatment goals for type 1 diabetes:10-year incidence data from the pittsburgh epidemiology of diabetes complications study[J]. Diabetes Care,2001,24(6):1053-1059.

[7]張媛媛,張日華,杜新麗,等.血清尿酸水平與糖尿病各代謝因子的相關性研究[J].南京醫科大學學報：自然科學版,2013,33(1):62-67.

[8]Fioretto PB,ruseghin M,Barzon I,et al. Diabetic nephropathy:an update on renal structure[J]. Int Congr Ser,2007,1303:51-59.

[9]劉紅芳,鄧澤元,徐靚,等. 乳酸菌源納米硒對小鼠抗氧化性能的影響[J].食品工業科技,2014,35(23):360-365.

[10]Li W,Wang GG,Lu XH,et al. Lycopene ameliorates renal function in rats with streptozotocin-induced diabetes[J]. Int J Clin Exp Pathol,2014,7(8):5008-5015.

[11]景洪江,劉英華,王覲,等. 補充微量營養素對2型糖尿病患者免疫功能和感染的影響[J]. 營養學報,2010,32(1):11-16.

[12]Harman D. Free radical theory of aging:an update:increasing the functional life span[J]. Ann NY Acad Sci,2006,1067:10-21.

[13]Lan XY. Transforming growth factor-β/Smad signalling in diabetic nephropathy[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2012,39(8):731-738

[14]Shen N,Li X,Zhou T,et al. Shensong yangxin capsule prevents diabetic myocardial fibrosis by inhibiting TGF-β1/Smad signaling[J]. J Ethnopharmacol,2014,18(157):161-170.

Renal protection of Oleuropein on diabetic rats and relevant mechanism

WANG Yu1,WANG Sheng-qing1,YE Wen-bin1,HE Jiu-jun1,QI Lin-lin2

(1.Department of Biology and Chemistry,Longnan Teachers College,Chengxian 742500,China;2. Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

To investigate the protective mechanism of oleuropein on the kidney of diabetic rats,male SD rats were divided into normal control group,diabetic model group,oleuropein treated group and positive benazepril control group based on their body weights. The diabetic animal model was made by a single intraperitoneal injection of 65 mg/kg streptozotocin(STZ). One week after successful modeling,the diabetic rats were treated with oleuropein or positive benazepril for seven weeks,and then indexes of their urine,blood and kidneys were measured. Results:Compared with diabetic model group,the oleuropein treated rats showed significant decrease in levels of renal index,blood glucose,blood lipid,serum Scr,BUN,UA,UALB,UAER and MDA,increase in levels of serum IgG,IgM and complement C3,C4,telomerase,SOD and CAT,and reduce in content of MDA. Meanwhile,the use of oleuropein resulted in decrease of expression of TGF-β1 and Smad4 in diabetic rats. These results indicated that oleuropein had a protective effect on the STE-induced renal tissue injury in diabetic rats,due to enhancing renal antioxidant capacity,telomerase activity and immune function,as well as inhibiting expression of TGF-β1 and Smad4.

oleuropein;diabetic nephropathy;antioxidant enzyme;TGF-β1;Smad4

2015-02-12

王昱(1973-)，男，碩士，教授，研究方向：細胞與發育生物學,E-mail:gswangyu@126.com。

甘肅省自然科學基金項目(1107RJZK243); 甘肅省高等學?？蒲匈Y助項目(1128B-01)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0353-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.065