多重PCR技術在食源性致病菌檢測中應用的研究進展

李 凡,許恒毅,李福來

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

多重PCR技術在食源性致病菌檢測中應用的研究進展

李 凡,許恒毅*,李福來

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

食源性致病菌的多重PCR檢測技術是指能夠同時擴增得到同種或多種致病菌的不同基因片段的技術。因該技術特異、靈敏且分析效率高,現已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測工作中。本文介紹了多重PCR在食源性致病菌檢測中應用的研究近況,并對影響因素及存在的問題進行了闡述。

多重PCR,食源性致病菌,快速檢測,研究進展

近年來,國內外食品安全事件頻發,食源性疾病的爆發率一直居高不下,給人們帶來了巨大的損失和傷害,且引起了各國政府的廣泛關注。據報道,發達國家每年因不安全食品導致的患病人數比例高達30%,僅美國每年有7600萬人身患食源性疾病,約有5200人死亡[1]。而我國食源性疾病監測網地區在2001～2010年統計到全國各地食源性疾病暴發事件共5021起,累計發病140101人(含死亡1427人),死亡率為1.019%,其中由食源性致病菌引起的死亡占40.93%[2]。因此,快速檢測和鑒別食源性致病菌是有效預防和控制食源性疾病的關鍵環節。

目前,用于食源性致病菌檢測的方法主要有傳統培養法、免疫學方法和分子生物學方法三類[3],傳統培養法檢測過程繁瑣、耗時且工作量大,無法滿足快速檢測的需要;免疫學方法由于方法本身的局限性,易發生交叉反應且存在一定程度的漏檢;分子生物學方法因其操作簡單、耗時短、特異性強、靈敏度高等特點,已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測。其中,最常見用于食源性致病菌檢測的分子生物學方法是PCR技術,但常規PCR方法一次實驗只能檢測一種病原菌,而食品樣品中往往涉及不同種類和型別的細菌。多重PCR(mPCR)技術不僅兼具普通PCR技術的優勢,還可快速地一次性檢測多種食源性致病菌,提高檢測效率和準確性。本文對多重PCR技術在食源性致病菌檢測中應用的研究進展進行了綜述,旨在為基于多重PCR方法檢測食源性致病菌的研究和建立方法提供參考。

1 多重PCR的原理

多重PCR是指在同一反應體系中加入兩對或兩對以上特異性引物擴增出多個目的片段的方法。其原理如圖1所示,在模板DNA、dNTP、適當緩沖液以及特異性引物存在下,依賴于DNA聚合酶的催化,使多對特異性引物所界定的DNA片段進行擴增。由于多重PCR可在同一個反應體系中同時檢測多個基因,節約了檢測時間和成本,是一種既高效又經濟的食源性致病菌檢測技術。

圖1 多重PCR原理圖Fig.1 The schematic diagram of multiplex PCR

2 多重PCR在食源性致病菌檢測中應用的研究進展

在檢測食源性致病菌時,多重PCR擴增的靶基因主要為16S rRNA、菌株相關的特異性基因、毒力相關基因等三類。用于食源性致病菌屬間檢測的靶基因一般為較保守的16S rRNA,用于食源性致病菌屬內種間檢測的靶基因一般為種特異性基因。應用多重PCR檢測食源性致病菌的關鍵是根據靶基因合理地設計引物。

2.1 用于檢測單一食源性致病菌

對于具有復雜血清型的致病菌如大腸桿菌和沙門氏菌,采用傳統PCR方法檢測特異性差,易造成錯判。多重PCR方法相比普通PCR方法可以同時考察多個菌株特征,具有更高的特異性。O157∶H7是致病性大腸桿菌的主要血清型,Bai等[4]根據大腸桿菌O157∶H7的特異性基因fliC、stx1、stx2、eae、rfbE和hlyA建立多重PCR方法,對221株產志賀毒素大腸桿菌進行檢測,結果所有大腸桿菌O157均特異性地擴增出6條片段,經過6 h富集培養后檢測限達到10 CFU/g。Gordillo等[5]采用多重PCR方法同時檢測大腸桿菌O157∶H7中編碼O157抗原的rfbE和編碼H7鞭毛抗原的fliCh7,設計了2對引物,在供試的14株參考菌株中,僅2株為陽性結果,其余均為陰性,有效地防止了錯檢,提高了結果的準確性。Lim等[6]選擇鼠傷寒沙門氏菌中編碼O4抗原的rfbJ、編碼H:i抗原的fliC和編碼H:1,2抗原的fljB為目的基因,設計了3對引物,應用多重PCR進行檢測,在供試的32株已知菌株中,3株鼠傷寒沙門氏菌均擴增出663、183和526bp的3條片段,表現出較高的特異性。Trafny等[7]根據沙門氏菌的hilA、spvA和invA,腸炎沙門氏菌的sdf以及16S rRNA設計了5對引物,應用多重PCR對糞便進行檢測,可特異性地檢出腸炎沙門氏菌。

對于具有較多毒力基因的致病菌如金黃色葡萄球菌,采用多重PCR方法對致病菌中多個毒力相關基因進行同時檢測,不僅可以檢出致病菌,還可了解致病菌含毒力相關基因的數量及致病性的強弱。Nagaraj等[8]根據金黃色葡萄球菌的5種毒力相關基因(sea、seb、sec、seg和sei)、TSST-1編碼基因(tst)、甲氧西林耐藥性基因(mecA)、以及凝固酶相關基因(coa)設計合適的引物,建立多重PCR方法,并設置內標以排除假陰性結果。在供試的91株金黃色葡萄球菌中,內標均為陽性,擴增出sea、seb、sec、seg、sei、tst、mecA以及coa的比率分別為36.26%、28.57%、61.53%、59.34%、58.24%、3.29%、27.47%、95.60%,結果證明絕大部分金黃色葡萄球菌攜帶兩種或兩種以上的毒力相關基因。Ertas等[9]采用多重PCR方法對150份甜點和干酪樣品進行檢測,先根據生化實驗確定含有凝固酶陽性葡萄球菌(CPS)的樣品,再根據CPS的sea、seb、sec和sed四種腸毒素相關基因設計引物,進而了解CPS中的四種腸毒素相關基因存在狀況。

2.2 用于檢測屬內種間的食源性致病菌

對于同一屬內的食源性致病菌,應用多重PCR方法進行檢測不僅可提高結果的準確率,還可快速地一次性檢測屬內多種食源性致病菌,提高檢測效率。Wei等[10]根據弧菌屬的16S rRNA保守序列以及種特異性基因gyrB(溶藻弧菌)、collagenase(副溶血性弧菌)、vvhA(創傷弧菌)、ompW(霍亂弧菌)設計了五對引物,建立多重PCR方法,可同時檢出上述4種致病菌,縮短了檢測時間,大大地提高了檢測效率。同時利用弧菌屬16S rRNA序列極為保守穩定的特點將其作為內標進行屬的鑒別,保證了檢測結果的準確率。Ryu等[11]選擇李斯特菌屬的屬特異性基因prs以及lmo1030(單核細胞增生李斯特氏菌)、Oxidoreductase(格氏李斯特氏菌)、lin0464(無害李斯特菌)、namA(伊氏李斯特菌)、scrA(威氏李斯特菌)、lmo0333(斯氏李斯特菌)設計了七對引物,應用多重PCR對肉制品中分離出的93株李斯特菌進行檢測,結果發現有81株為單核細胞增生李斯特氏菌、10株為無害李斯特菌、2株為威氏李斯特菌。該方法利用李斯特菌屬的prs作為內標,以指示檢測中出現的假陰性,提高檢測的準確率。同時可檢測多種菌,與普通PCR方法相比,具有更高的檢測效率。

對于培養條件較為嚴格的致病菌如彎曲桿菌屬,多重PCR方法可彌補傳統培養法難于操作的不足。Amri等[12]選擇彎曲桿菌屬的cadF以及hipO(耶爾森彎曲桿菌)、asp(大腸彎曲桿菌)建立多重PCR方法,靈敏度都達到15～16 ng DNA/mL,各反應體系組分間未發生任何交叉反應。而對74株彎曲桿菌屬進行馬尿酸鹽水解驗證實驗,結果有17株菌表現為假陽性和7株菌表現為假陰性。

2.3 用于檢測不同屬的食源性致病菌

多重PCR可同時對不同屬的食源性致病菌進行檢測和分析,快速確定食品中是否存在某種致病菌,相對于上述兩種檢測,具有更高的檢測效率和實際應用價值。大多數食源性致病菌1～10 CFU劑量即可致病,對于含目的菌數量少或者存在復雜干擾性成分的常規食品,直接用PCR方法檢測靈敏度低且特異性差,一般前期需要對目的菌進行預增菌或高效分離富集。Chiang等[13]應用多重PCR方法同時檢測牛奶和肉制品中的單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7等多種致病菌,直接檢測其靈敏度為103～104CFU/mL,而在TSB中經過8 h富集培養后,其靈敏度可達1 CFU/mL。Lee等[14]報道了多重PCR方法在同一反應體系中檢測大腸桿菌O157∶H7、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌的方法,在對食品的模擬檢測中,細菌經過12 h的富集,靈敏度都達到1 CFU/mL,縮短了檢測時間并節省了成本,有效地提高了檢測效率。Guan等[15]根據invA(沙門氏菌)、nuc(金黃色葡萄球菌)、hlyA(單核細胞增生李斯特氏菌)、ail(小腸結腸炎耶爾森氏菌)和rfbE(大腸桿菌O157∶H7)設計了5對引物,建立多重PCR方法,在豬肉模擬檢測中,經過夜富集培養后,可同時檢測出上述5種菌,檢測限都達到103CFU/mL。Garrido等[16]采用多重熒光定量PCR方法檢測食品中的沙門氏菌和單增李斯特菌,用改良過的TA10選擇培養基進行富集培養,檢測限都達5 CFU/25g。為了縮短檢測時間,同時清除食品基質中的干擾物,Ma等[17]將多重熒光定量PCR方法與免疫磁分離技術結合,檢測鮮肉制品中的沙門氏菌、志賀氏桿菌及金黃色葡萄球菌,能將靈敏度降至沙門氏菌2.0 CFU/g、志賀氏桿菌6.8 CFU/g、金黃色葡萄球菌9.6 CFU/g,有效地避免了實際樣品中相關致病菌的漏檢。同時該方法簡化了樣品富集步驟,縮短了檢測時間(≤8 h),大大提高了檢測效率。

此外,將多重PCR與其他技術結合在同時檢測不同屬的食源性致病菌中也有不少應用。Chiang等[18]結合多重PCR方法和基因芯片技術,檢測牛奶和肉制品中的單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、無乳鏈球菌、副溶血性弧菌和熒光假單胞菌共8種致病菌,直接檢測靈敏度為103～104CFU/mL,在TSB中經過8 h富集,靈敏度達到1 CFU/mL。Morin等[19]根據rfbE和fliC(大腸桿菌O157∶H7)、rfbE(霍亂弧菌)及tyv(傷寒沙門氏菌)設計了四對引物,建立多重反轉錄PCR方法,提取致病菌的mRNA,將其反轉錄成cDNAs后再進行PCR擴增,可同時檢測上述三種致病菌。由于mRNA只存在于活細菌中,避免了死菌中DNA對PCR擴增的干擾。Yang等[20]對食品中的鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7和單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測時,用免疫磁珠捕獲目的菌后,采用疊氮溴化丙錠(PMA)對目的菌進行處理,由于PMA完全不能通透細胞膜,只能選擇性的修飾死菌“暴露”的DNA(細胞壁和細胞膜已破損的細菌),形成共價氮碳鍵,抑制死菌DNA在PCR時的擴增,提高了多重PCR檢測活菌的準確率。同時該方法不需要經過富集處理,整個檢測過程僅需4.5 h,且靈敏度高,有效地提高了檢測效率。

3 影響多重PCR的因素

多重PCR在同一反應體系中對多個DNA片段進行特異性擴增,反應體系較為復雜,影響擴增效果的因素較多,大體可分為反應體系和反應條件兩大類。其中,反應體系主要包括引物、TaqDNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反應條件主要包括退火溫度和循環數等[21]。引物設計則是實驗成敗的關鍵,直接影響多重PCR的特異性和靈敏度。引物設計不當各引物間極易形成引物二聚體或產生非特異性擴增產物[22],不僅消耗反應體系中的各組分,而且還影響退火與延伸的速率。引物設計時應特別注意目標序列的同源性引物、長度、GC含量、濃度等因素,還應注意各引物對間的最適退火溫度盡可能相同且無任何交互作用等。TaqDNA聚合酶用于催化反應,由于多重PCR中存在多個DNA片段的擴增反應,各反應間會不同程度地競爭TaqDNA聚合酶,若TaqDNA聚合酶使用量過低會抑制競爭效率低的DNA擴增,過多則會導致非特異性擴增[23]。dNTP和MgCl2二者具有相關性,在反應體系中兩者應保持平衡。退火溫度取決于引物的長度、堿基的組成和目的片段的長度,決定反應的特異性與產量。在實驗過程中,應綜合考慮各個解鏈溫度(Tm),在Tm值允許范圍內,選擇較高的退火溫度以減少引物和模板間的非特異性結合,確保PCR反應的特異性[24]。循環數取決于反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的速率,一般含105個拷貝的靶序列的反應體系在TaqDNA聚合酶的催化下進行30個循環就能夠有效地擴增目的片段。

4 結語

多重PCR具有高特異性、高靈敏度、高效率和低成本等優點,目前已廣泛應用于食源性致病菌的檢測。但在實際應用中還應特別注意以下問題:1)食品中存在的復雜抑制因子干擾PCR擴增;2)較易形成引物二聚體和非特異性擴增;3)較難區別活菌和死菌。因此,未來的研究主要集中在對樣品前處理技術進行改進,去除抑制因子的干擾,同時不斷優化多重PCR的反應體系和反應條件,并與其他技術結合如多重逆轉錄PCR[19,25]、多重熒光定量PCR[16,26]、多重PCR基因芯片技術[18,27]等,以及加入核酸交聯劑如疊氮溴化丙錠(PMA)、疊氮溴化乙錠(EMA)等抑制死菌DNA的擴增用于區別活菌和死菌[28],提高反應的靈敏度和特異性。隨著分子生物學檢測理論和技術的不斷發展與完善,多重PCR必將在檢測食源性致病菌方面具有更好的應用前景。

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Application of multiplex polymerase chain reaction in detection of foodborne pathogens

LI Fan,XU Heng-yi*,LI Fu-lai

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Multiplex polymerase chain reaction(mPCR)for detection of foodborne pathogens is a kind of detection technique which can simultaneously amplify multiple gene fragments of the one pathogen or different pathogens. Due to these advantages of high specificity,sensitivity and efficiency,mPCR is widely used for the detection of foodborne pathogens. In this article,the applications of mPCR in the detection of foodborne pathogens during the past 10 years are reviewed,and the influence factors or problems of mPCR are discussed.

multiplex polymerase chain reaction;foodborne pathogen;detection;research progress

2015-01-12

李凡(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測，E-mail：349465359@qq.com。

*通訊作者:許恒毅(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：食品生物技術，E-mail：kidyxu@163.com。

江西省青年科學家(井岡之星)培養對象項目(20142BCB23004)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAK10B06)。

TS207.4

A

1002-0306(2015)21-0372-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.069