海洋頭足類墨汁中活性成分的研究進展

楊賢慶,楊麗芝,2,黃 卉,李來好,鄧建朝,吳燕燕,戚 勃

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

海洋頭足類墨汁中活性成分的研究進展

楊賢慶1,楊麗芝1,2,黃 卉1,李來好1,鄧建朝1,吳燕燕1,戚 勃1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

海洋頭足類如魷魚、烏賊等的加工副產物墨汁中具有黑色素、多糖、肽類物質等多種活性成分。本文主要簡述了海洋頭足類墨汁中各活性成分的提取方法及其功能活性等方面的研究進展,以期為海洋生物活性物質的開發利用提供參考。

頭足類,墨汁,活性成分,進展

我國幅員遼闊,海岸線延長,在海洋藥物開發和海洋資源利用方面具有悠久的歷史,頭足類生物作為生物醫藥的來源已得到廣泛應用[1-3]。頭足類屬軟體動物門,其中柔魚科、烏賊科、槍烏賊科和蛸科是其主要種類,烏賊、魷魚、章魚、船蛸、鸚鵡螺和墨魚均屬頭足類[4-5]，頭足類資源豐富，有資料顯示南海深海頭足類的潛在可捕撈量295.1×104t[6]。近年來,隨著海洋生物醫學的發展,對頭足類加工副產物墨汁的研究逐漸深入。墨汁是一種粘稠的混懸液,由肉眼看不見的黑色顆粒構成,其中含有豐富的黑色素、蛋白質、多糖、酶、多肽和萜類等活性物質,主要活性成分是黑色素和蛋白多糖復合體,具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化和增強機體免疫力等功能[1],對頭足類副產物的開發利用現已成為研究開發的熱點。本文主要論述了墨汁中的黑色素、多糖、肽類等物質的提取及活性研究進展,以為墨汁的開發利用及活性物質的研究提供理論依據。

1 頭足類墨汁中的主要活性物質

經國內外研究發現,頭足類墨汁中含有豐富的活性物質如黑色素[7]、多糖類[8]、肽類物質[9]、蛋白酶類和萜類物質[10],另外還有一些氨基酸、微量元素和維生素[11]等,而目前研究最多的活性物質是黑色素、多糖類和肽類物質。

1.1 黑色素

天然黑色素含有穩定的自由基,由吲哚單體聚合而成,能夠吸收由紫外和可見光引起的輻射,是一種天然的內源性生物聚合體,能夠保護生物體免受輻射傷害[12],并具有抗菌和抗病毒的生理功能[13]。另有研究發現,烏賊墨黑色素因其特有的結構穩定性還可用于化妝品眼影和睫毛膏中,并且優于一般合成的化妝品[14]。

1.1.1 結構 在海洋頭足類中墨汁的研究以烏賊、魚為主,其中對烏賊墨汁的研究最多。黑色素是吲哚醌的多聚物,化學性質極穩定。李興旺等[15]利用紅外和紫外光譜技術,證實魷魚墨黑色素是以吲哚結構為主體的異聚物,宋茹等[16]采用光譜分析法對魷魚墨黑色素的理化性質進行研究,得出魷魚墨黑色素具有典型的紅外吸收特點,在紫外區220 nm處有特征吸收,在1617.36 cm-1處有紅外光譜最強吸收峰,而后進一步研究得出魷魚墨黑色素在紅外光譜1617.35 cm-1和3384.54 cm-1處具有較強吲哚環結構歸屬的吸收峰[17]。陳士國[7]等人研究得到魷魚黑色素主要與一些蛋白組分及金屬離子如鈣、鎂、鈉、鉀等微量金屬元素結合,少有游離存在。

田麗[18]等應用原子力對中國槍烏賊和虎斑烏賊的墨汁進行掃描觀察,并且分析了墨汁的顆粒度,得出槍烏賊和虎斑烏賊墨汁顆粒均呈圓形或長方形,但顆粒大小與表面積因烏賊種類大小而稍有不同。李和生[19]等應用電鏡技術對烏賊墨黑色素超微結構進行研究,結果表明,墨色素是由黑色素單體堆積而成,其單體顆粒呈圓形,表面清晰光滑,平均直徑約118 nm。

1.1.2 活性 黑色素不僅能抗輻射、抗氧化、抗衰老,還可提高機體免疫、促進骨髓造血,具有多種生理功能[20]。雷敏等人[21]通過研究魷魚墨黑色素對小鼠免疫機能的調節作用,得到魷魚墨黑色素可顯著提高免疫低下模型小鼠的各種指標,如小鼠的脾及胸腺指數、血清溶血素水平(HC50)等,另外,還可促進小鼠NK細胞活性及巨噬細胞吞噬能力,因此魷魚墨黑色素可顯著調節機體特異性與非特異性免疫機能,從而促進機體更好的協同工作。

陳士國等[7]利用高速離心法提取黑色素,并測定自由基的清除能力,得出魷魚墨黑色素具有較強的自由基清除能力,而對黑色素鐵的清除能力稍弱。甄天元[13]等研究了魷魚墨黑色素對亞急性衰老模型小鼠抗氧化功能的影響,灌胃后測定鼠肝臟中總谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,以及皮膚中羥脯氨酸(HYP)和腦脂褐質(LIP)、丙二醛(MDA)含量,結果得出魷魚墨黑色素對抗氧化與抗衰老具有顯著作用。研究還得出黑色素可提高組織中膠原蛋白的含量,間接對皮膚細胞的增長與代謝具有一定的調節作用。

1.1.3 提取方法 黑色素的提取方法主要有酸法、高速離心法、酶法與微波輔助法等,其中酸法反應劇烈,對品質會有影響,而高速離心法則只能去除水溶性雜質,酶法較溫和,且能得到更多較純較完整的產物,且能有效去除與黑色素結合的蛋白質、脂類物質粘多糖。最新研究表明將酶法與微波輔助相結合不僅可保持酶法提取的優勢,還能顯著提高其提取率。李曉等[20]以金烏賊墨汁為材料采用單因素實驗研究黑色素提取的工藝條件,比較分析了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性和堿性蛋白酶的提取效果,最終得出堿性蛋白酶的提取效果較好。宋茹等[17]首先以水解度為指標測定了上述幾種酶對魷魚墨的水解效果,選出水解能力最強的胃蛋白酶為實驗用酶,在單因素實驗的基礎上采用正交實驗得到優化的酶解條件為:反應時間5 h、pH1.5、加酶量1.5%、酶解溫度37 ℃。

1.2 多糖類物質

多糖是由許多單分子糖通過糖苷鍵連接形成的一種大分子量的生命物質,具有較高的營養價值和生物活性。近年來,由于海洋藥物的發展,對海洋生物活性物質的提取逐漸引起人們的重視。經研究發現海洋生物頭足類墨汁具有多種活性,多糖是主要的活性物質。

1.2.1 結構 多糖是由許多單糖分子以苷鍵結合成的天然高分子化合物,大部分為無定形粉末,沒有甜味,無一定熔點,不易溶解于水,難溶于醇、醚、氯仿、苯等有機溶劑中。多糖所具有的生物活性與其結構密切相關。大量研究表明,向多糖分子上引入化學基團可增強其原有的活性[22-24]或產生新的活性[25-26],而多糖的硫酸化是多糖類藥物研究中常用的修飾方法之一。樂小炎[27]等分離純化重均分子量為37 ku左右的墨多糖,其中硫酸根含量為3%。

1.2.2 活性 墨汁中多糖類物質具有多種活性,如抗氧化[28]、抗菌、防腐保鮮、抑制腫瘤細胞的生長繁殖[8]。研究人員從烏賊墨中分離純化出墨多糖進行體外抗氧化實驗,以DPPH自由基、·OH的清除力和Fe3+還原能力為指標,測定墨汁多糖的抗氧化能力,最終得出烏賊墨多糖具有較高的抗氧化和還原能力,且與多糖的濃度呈正相關[29-30]。墨多糖還具有防腐保鮮作用,吳金龍[31]等研究了烏賊墨多糖對冷藏魷魚的防腐保鮮作用,從烏賊墨汁中提取多糖作用于低溫處理的魷魚,通過測定細菌總數、pH以及揮發性鹽基氮來探討其防腐效果,結果得出烏賊墨多糖具有很好的防腐抗菌作用。

從上世紀開始,國內外很多研究者對多糖的抗腫瘤機制進行了大量研究,研究結果表明,多糖抗腫瘤活性主要通過下調MMPs的活性[32]、干擾信號轉導途徑[33]、抑制HPA的活性及抑制腫瘤細胞點附和侵襲[34-35]、激活宿主免疫功能[36-37]及抑制血管生成[38]等方式達到抗腫瘤的效果。宗愛珍[39]通過對曼氏無針烏賊(Sepiella maindronni)墨多糖的研究,得出墨多糖的硫酸化衍生物SIP-S,在體內可顯著抵抗腫瘤的生長轉移,從而達到治療腫瘤的目的,進一步研究發現SIP-S是通過調節凋亡相關蛋白和細胞黏附分子的表達,同時抑制乙酰肝素酶的活性來抑制腫瘤細胞的生長和轉移。CHEN[40]從烏賊墨中提取多糖類物質,通過觀察細胞的增殖、癌細胞的遷移及體外血管的生成,最終得出多聚糖類物質具有抑制癌細胞入侵和血管生成的作用。曹露[41]研究發現,魷魚墨多糖對由環磷酰胺導致的小鼠腸道黏膜上皮細胞的損傷具有顯著的保護作用,其作用機制為墨多糖通過促進小鼠的腸粘膜SIgA的分泌而起作用,且呈劑量依賴關系[42]。烏賊墨多糖還可抑制由環磷酰胺引起的白細胞和血小板的減少[43],對環磷酰胺引的造血系統的損傷也具有保護作用[44]。樂小炎[27]等研究得出烏賊墨多糖對由環磷酰胺引起的睪丸的損傷具有明顯保護作用。同時,烏賊墨多糖也可緩解由環磷酰胺引起生育能力損傷和精子畸形[45]。

1.2.3 提取方法 多糖是具有很高營養價值和生物活性的天然混合物,傳統的提取方法很多,有水提醇沉法、酸堿法、薄膜濃縮法等,這些方法提取率低,操作流程復雜,且周期長。隨著科學技術的發展,一些新的技術應運而生,酶法微波輔助提取法、超聲提取法、超高壓提取法、膜分離技術逐漸代替傳統的提取方法[46],而在實際的操作過程中,會根據不同的原料選取不同的方法,往往采取多種技術的聯合使用。在墨多糖的分離純化過程中常采用酶法結合其他方法進行分離純化,然后在此基礎上根據原料特點優化最佳的料液比、溫度、加酶量、pH及底物濃度,從而提高多糖的提取率。

樂小炎[27]等采用超聲波結合酶法提取烏賊墨多糖,超聲波處理與木瓜蛋白酶水解結合,乙醇沉淀后得到粗多糖,進一步采用SephdexG-100柱分離純化得到一種含3%硫酸根的多糖,分子量約為37 ku。

1.3 肽類物質

1.3.1 結構 丁國芳[47]等先用胰蛋白酶酶解烏賊墨,然后將酶解液超濾、G-25分子篩凝膠層析分離純化,再用高效液相檢測純度,得出此寡肽的N端氨基酸序列是:Gln-Pro-Lys,得率為1.82%。鄭玉寅[48]等從烏賊墨中分離得到肽聚糖,并進一步分離純化得分子量約為130 ku灰白色粉末狀肽聚糖,并測得含16種氨基酸,其中Glu和Asp含量最多。

1.3.2 活性 墨汁中的活性物質通常不具單獨作用能力,而是通過與其他物質結合而產生活性。已有研究人員從烏賊墨中分離出一組具有抗腫瘤活性的肽聚糖:SIPG02-A,SIPG02-B,SIPG02-C[49]。肽聚糖是一種多糖和氨基酸的聚合物,研究發現烏賊墨肽聚糖氨基酸含量豐富,含有16種氨基酸且Glu和Asp含量達5.64%和3.85%[50]。烏賊墨汁中的肽聚糖還具有抗腫瘤、抗病毒、促凝血[51]等功能,王曦[52]等從烏賊墨中分離純化出肽聚糖,并采用淋巴細胞增殖實驗法(MTT法)測定了荷瘤小鼠巨噬細胞的吞噬率,吞噬指數和殺菌率,得出肽聚糖對小鼠S180肉瘤和H22肝癌具有明顯抑制作用,且與劑量呈良好的正相關,平均抑制率約為55.3%～62.6%。

鄭玉寅[48]在從烏賊墨中提取肽聚糖,并通過大量的體外實驗證實肽聚糖可通過基因誘導來抑制癌細胞的生長。黃芳芳[53-54]等對烏賊墨的寡肽進行分離純化,得到活性寡肽通過控制細胞周期(S和G2/M),進而抑制前列腺癌細胞LNCaP和DU-145的增殖,另外通過加強SubG1和G0/G1階段來調節PC-3細胞的生長,并與劑量呈正相關。

1.3.3 提取方法 王曦[52]等從烏賊墨中分離純化肽聚糖時,采用丙酮于-20 ℃脫脂,然后離心沉淀、冷凍干燥,再用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)在4 ℃作用72 h,離心后將上清液進行透析、濃縮、冷凍干燥,再采用DEAE-Sephacl離子交換柱純化得到肽聚糖。丁國芳[47]等先用胰蛋白酶酶解烏賊墨,然后將酶解液超濾、G-25分子篩凝膠層析分離純化,再用高效液相檢測純度,得出此寡肽的N端氨基酸序列是:Gln-Pro-Lys,且得率為1.82%。鄭玉寅[48]等采用水提醇沉法分離純化烏賊墨中肽聚糖時,首先進行丙酮脫脂,然后采用Tris-HCl緩沖液進行提取,再用無水乙醇進行沉淀,沉淀物 Sevag試劑除蛋白,再將粗提物超濾和離子交換柱分離純化,最后得到純度較高的肽聚糖。

1.4 酶類物質

2 墨汁中其他活性成分及營養成分

墨汁中除了含有上述的活性成分外,還含有多種營養成分,陳小娥等[11]對曼氏無針烏賊墨營養成分進行分析,得到烏賊墨中含有16種氨基酸、10.08%蛋白質和9種脂肪酸以及一些Mg、Ca、Zn、Fe等礦物質元素。鄭小東等[58]在原有方法基礎上采用液相色譜對烏賊墨維生素、礦物質元素、氨基酸等進行測定,結果得出烏賊墨汁中粗蛋白9.18%、脂肪0.97%,另外還含有豐富的Mg、Ca、K、Na等常量礦物元素及Fe、Sr、Al等微量元素,其中墨囊中高濃度的鍶在骨骼生長過程中同樣起著不可或缺的作用。除此之外,墨汁中還檢測到了17種氨基酸(其中包括7種必須氨基酸和2種半必須氨基酸)、1種脂溶性維生素(VA)和4種水溶性維生素(B1、B2、B5、B6)。

3 展望

頭足類生物墨汁中含有多種活性物質,更具有多種功能活性,隨著海洋生物醫學的發展,可從墨汁中提取活性物質應用于醫學藥物中,造福于人類。然而,目前對于墨汁的研究還局限于一定的水平,例如,研究比較籠統,不夠細致,對于墨汁活性研究較多而對于活性物質的種類結構研究較少,對活性成分構效關系沒有深入研究。研究的熱點主要集中于黑色素和多糖物質的研究,而其他活性物質涉及較少。與此同時,墨汁中活性物質的分離純化技術還不夠完善,物質分子結構還需進一步的解析,相信隨著對頭足類墨汁研究的深入,未來墨汁中的活性成分能廣泛應用于海洋生物醫學,造福于人類。

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Research process in the active ingredients in the ink of Marine cephalopod

YANG Xian-qing1,YANG Li-zhi1,2,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,DENG Jian-chao1,WU Yan-yan1,QI Bo1

(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing;South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science,Guangzhou 510300,China;2. College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The processing by-products,ink in marine cephalopods such as sleeve-fish,cuttlefish,etc,have melanin,polysaccharide,protein,peptides and other active ingredients.The research progress of active ingredients were reviewed in extracting methods and functional activities in the marine cephalopods ink,in order to provide a reference for the development and utilization of marine biological active substances.

cephalopods;ink;active ingredients;research progress

2015-01-13

楊賢慶(1963-),男,學士，研究員,研究方向:水產品加工與質量安全,E-mail:yxqgd@163.com。

農業部財政重大專項(NFZX2013)南海漁業資源調查與評估。

TS254.1

A

1002-0306(2015)21-0390-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.073