酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長、免疫和抗氧化性能的影響

朱宇旌，李艷，于治姣，張勇?

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽110866；2.青島正大豬業有限公司，山東青島266000；3.沈陽艾德蒙種豬繁育有限公司，遼寧沈陽110171）

酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長、免疫和抗氧化性能的影響

朱宇旌1，李艷2，于治姣3，張勇1?

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽110866；2.青島正大豬業有限公司，山東青島266000；3.沈陽艾德蒙種豬繁育有限公司，遼寧沈陽110171）

本試驗以研究酸模葉蓼類黃酮的營養免疫功能為目的，選用36只清潔級昆明小鼠，分為4組，每組3個平行處理。分別進行對照組（0 mg/kg)、低劑量組（30 mg/kg)、中劑量組（100 mg/kg)和高劑量組（300 mg/kg）的酸模葉蓼類黃酮灌胃處理，進行生長性能、免疫性能和抗氧化性能指標測試。結果顯示，低劑量酸模葉蓼類黃酮處理可促進小鼠的生長，與對照組相比，試驗組T4水平呈顯著性增加（P＜0.05），中劑量酸模葉蓼類黃酮處理極顯著提高HGH分泌水平（P＜0.01）；低劑量酸模葉蓼類黃酮處理顯著提高脾臟指數（P＜0.05），高劑量酸模葉蓼類黃酮處理顯著提高巨噬細胞吞噬率（P＜0.05），中劑量與高劑量酸模葉蓼類黃酮處理分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）提高半數溶血值，中劑量組酸模葉蓼類黃酮處理對T淋巴細胞轉化率有顯著的提高作用（P＜0.05），各劑量酸模葉蓼類黃酮處理均極顯著提高小鼠遲發性變態反應右耳增厚值（P＜0.01）；低劑量與中劑量酸模葉蓼類黃酮處理顯著提高血清GSH-Px活性（P＜0.05）。中劑量酸模葉蓼類黃酮處理提高SOD值和降低MDA含量的效果最好，高劑量酸模葉蓼類黃酮處理提高T-AOC水平的作用最好。

酸模葉蓼；類黃酮；生長性能；免疫性能；抗氧化性能

生物類類黃酮（bioflavonoids）是一種廣泛存在于自然界中的酚類物質，又稱維生素P，常與維生素C伴隨存在，是植物光合作用產生的一類重要的天然有機化合物。類類黃酮是自然界藥用植物中主要的活性成分之一，具有調節血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤[1]、抗病毒、調節內分泌和增強免疫[2]等生理活性。

酸模葉蓼（Polygonum lapathifolium）別名旱苗蓼、大馬蓼、柳葉蓉等，為一年生雙子葉雜草。Keles O等[3]對酸模葉蓼的藥用價值進行了評估，結果表明酸模葉蓼提取物具有抗炎和解熱活性；Takasaki等[4]經過研究發現酸模葉蓼提取物對小鼠皮膚腫瘤具有顯著的預制作用；Smolarz等[5]從酸模葉蓼中提取出喬松酮——一種具有抗敗血作用的類黃酮。本試驗研究分析酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長性能指標：日采食量、日增重、三碘甲狀腺氨酸（liothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、生長激素（human growth hormone，HGH），免疫性能指標：免疫器官系數、巨噬細胞吞噬功能、血清溶血素、遲發型變態反應、T淋巴細胞轉化率和抗氧化性能指標：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的影響，以期為綠色飼料添加劑的開發和酸模葉蓼資源的合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料純度為71%的酸模葉蓼類黃酮提取物，由本實驗室從酸模葉蓼全草中經超聲波輔助乙醇提取法提取，大孔吸附樹脂分離純化得到。提取物溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成所需濃度的溶液。

1.2 試驗動物的分組及處理選用36只20±2 g SPF雄性小鼠，隨機分成4組，分別為對照組（0 mg/kg）、低劑量組（30 mg/kg)、中劑量組（100 mg/ kg）和高劑量組（300 mg/kg），每組3個平行。預飼期為7 d，試驗期21 d。將酸模葉蓼類黃酮提取物溶解于0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成一定濃度的溶液。每天定時灌胃，對照組灌胃0.2 mL 0.5%CMC-Na溶液，試驗組分別灌胃0.2 mL不同濃度的酸模葉蓼類黃酮CMC-Na溶液。整個試驗期所有小鼠飼喂同一飼料，自由采食和飲水。定期稱量小鼠體重和采食量，適時配制適宜濃度的溶液。每天觀察小鼠的情況，如精神狀態、活動情況和進食情況等。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 生長性能指標和免疫器官系數試驗前后分別稱量小鼠體重，計算日增重；每天稱量，記錄小鼠的采食量；飼喂試驗結束后對小鼠進行眼球后靜脈叢毛細血管采血，將血液3 000 r/min離心10 min，取血清備用。頸椎脫臼處死小鼠，立刻解剖取胸腺和脾臟，去除筋膜和脂肪，用濾紙吸去多余水分后稱重，計算其占體重末重的比例。

1.3.2 T3、T4和HGH水平的測定取小鼠離心后的血清，分別按照三碘甲狀腺原氨酸放免試劑盒、甲狀腺素放免試劑盒及血清生長激素放免測定盒（均購于北京華英生物技術研究所）說明進行操作，采用放射免疫分析方法測定生長類激素的水平。

1.3.3 巨噬細胞吞噬功能采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的方法。最后一次灌胃后，分別向所有的對照組和劑量組小鼠的腹腔注射0.5 mL 1%雞血紅細胞懸浮液，1～12 h后頸椎脫臼處死。腹腔注射2 mL生理鹽水并且不時揉動，10 min后取一定量腹腔液制片。油鏡下觀察腹腔巨噬細胞吞噬雞血紅細胞的現象，計數100個巨噬細胞中吞噬有雞紅細胞（chicken red blood cell，CRBC）的巨噬細胞個數，計算巨噬細胞吞噬率。

1.3.4 血清溶血素的測定采用半數溶血值法。試驗期第16天向小鼠腹腔注射雞紅細胞懸液，試驗結束后眼球采血取血清測定。

1.3.5 二硝基氯苯（DNCB）誘導小鼠遲發性變態反應（DTH）的測定采用耳腫脹法。試驗期第14天用20 μL的7%的二硝基氯苯丙酮溶液對小鼠頸背部致敏，第20天用20 μL 7%的二硝基氯苯丙酮溶液攻擊右耳兩側，16 h后測量兩耳厚度，計算比較差值。

1.3.6 T淋巴細胞轉化率的測定采用瑞氏染色法。試驗期第19天各組小鼠每只肌肉注射植物血凝素0.4 mg/d，連續2 d。試驗期最后1 d尾部靜脈取血推片，自然風干。瑞氏染色，油鏡下計數100～200個淋巴細胞，計算T淋巴細胞的轉化率。

1.3.7 抗氧化性能指標SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA的測定SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，T-AOC采用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法測定，GSH-Px采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，MDA采用硫代巴比妥酸法測定。取小鼠血清按照各試劑盒（均購于北京華英生物技術研究所）要求進行檢測。

1.4 數據統計分析采用SPSS statistics 17.0統計軟件處理數據，試驗數據通過方差分析法進行顯著性檢驗，差異顯著時按照duncan及新復極差法進行多重比較。檢測水準為α=0.05（顯著水平）或α=0.0（極顯著水平）。

2 結果與分析

2.1 酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長性能的影響

2.1.1 酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長指標的影響見表1。

由表1可知，與對照組相比，酸模葉蓼類黃酮的低、中、高3個劑量組對小鼠的日采食量均有提高作用，其中低劑量的作用最大，較其提高了11.18%，但差異未達到顯著水平（P＞0.05）；低劑量組的酸模葉蓼類黃酮對雄性小鼠的日增重有提高作用，而中劑量和高劑量與對照組相比反而有下降趨勢，但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 酸模葉蓼類黃酮對雄性小鼠生長指標的影響Table1 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on growth index in male mice

2.1.2 酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長激素分泌的影響見表2。

表2 酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長激素分泌的影響Table2 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on growth hormone in male mice

由表2可知，酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長激素的分泌有一定的影響。隨著添加量的增加，T3水平較對照組略有增加，但差異不顯著（P＞0.05）；各劑量組的T4水平均呈顯著性增加（P＜0.05）；與對照組相比各劑量組的HGH水平均有增加，中劑量組較其提高了33.84%，差異達到極顯著（P＜0.01），高劑量組次之，較其提高了27.19%，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫性能的影響

2.2.1 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫器官重的影響見表3。

表3 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫器官重的影響Table3 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on spleen index and hymus index in mice

由表3可知，各處理組的脾臟指數和胸腺指數均高于對照組，其中低劑量組脾臟系數最高，比對照組提高了7.85%，差異達到顯著水平（P＜0.05）；胸腺指數各劑量組與對照組差異均不顯著，其中低、中劑量組胸腺指數均高于對照組，低劑量組較對照組提高了5.02%，而高劑量組胸腺指數反而低于對照組?？梢娝崮Ｈ~蓼類黃酮對小鼠的脾臟、胸腺都有一定的刺激增生作用。

2.2.2 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫功能的影響為考察酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫功能的影響，分別測定了小鼠巨噬細胞吞噬率、半數溶血值、遲發型變態反應及T淋巴細胞轉化率。見表4。

表4 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫功能的影響Table4 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on immune function in mice

由表4可知，酸模葉蓼類黃酮對小鼠巨噬細胞吞噬功能有提高的作用，隨著類黃酮劑量的增加，巨噬細胞吞噬率呈增長趨勢，其中與對照組的差異達到了顯著水平（P＜0.05）。

小鼠的半數溶血值隨著類黃酮用量的增加而呈增長趨勢。其中中劑量組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），提高12.6%；高劑量組與對照組和低劑量組相比差異均達到極顯著（P＜0.01），分別提高21.8%和18.8%。

灌胃酸模葉蓼類黃酮后，各劑量組小鼠的右耳均明顯增厚。與對照組相比差異均達到極顯著水平（P＜0.01），其中以中劑量組效果最好。說明酸模葉蓼類黃酮對小鼠的遲發型變態反應有明顯促進作用。

灌喂酸模葉蓼類黃酮可以促進小鼠T淋巴細胞轉化率的提高，其中中劑量組最高，與對照組相比差異達到顯著水平（P＜0.05），較其提高了11%。

2.3 酸模葉蓼類黃酮對小鼠抗氧化性能的影響見表5。

由表5可知，低、中劑量組的血清GSH-Px活性顯著高于對照組（P＜0.05），而高劑量組與對照組相近。

與對照組比較，小鼠的血清SOD值呈現先升高后降低的趨勢，但各組與對照組的差異均不顯著（P＞0.05）。

各劑量組血清MDA的含量均低于對照組，其中中劑量組效果最為明顯，降低了16.44%，但各組與對照組的差異均未達到顯著水平（P＞0.05)。

小鼠血清中T-AOC水平均高于對照組，且表現為隨添加量的增加而增加的趨勢，但與對照組的差異均未達到顯著水平（P＞0.05）。

表5 酸模葉蓼類黃酮對小鼠抗氧化性能的影響Table5 Effect of Polygonum lapathifolium flavonoids on antioxidant properties in mice

3 討論

3.1 酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長性能的影響本試驗表明酸模葉蓼類黃酮對小鼠生長指標的影響與劑量有關，低劑量組30 mg/kg對小鼠生長指標的促進作用最大，但隨著劑量的增加作用效果反而降低。這可能與類黃酮的雙重作用相關[6]，每種功能發揮其最佳效果需要一定的劑量，這與趙春燕[7]對沙蔥類黃酮的研究結果相近。許蘭芝等[8]研究發現淫羊藿總黃酮可以促進大鼠T3、T4的分泌，本試驗中劑量組T3、T4含量隨著劑量的增加而呈增長趨勢，與其研究結果相符，說明酸模葉蓼類黃酮能促進生長激素的分泌。另外經過試驗發現，酸模葉蓼類黃酮能促進HGH的分泌，且分泌量與添加劑量相關。

3.2 酸模葉蓼類黃酮對小鼠免疫性能的影響T淋巴細胞是參與細胞免疫的主要細胞，其分化成熟的場所是胸腺；B淋巴細胞是參與體液免疫的主要細胞，是脾臟中主要的免疫細胞[9]。酸模葉蓼類黃酮可以提高小鼠的胸腺和脾臟指數，且增長率與劑量相關，說明其對免疫功能具有促進作用。

巨噬細胞可以迅速吞噬進入機體的異體顆粒，如病毒、異物等，也可以吞噬自身產生的抗原性物質，巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體免疫功能的標準之一。本試驗中，隨著酸模葉蓼類黃酮添加量的增加，小鼠巨噬細胞的吞噬率和半數溶血值不斷增加，且與濃度呈正相關作用。閻莉等[10]和高曉雯等[11]的試驗分別證明了廣西藤茶總黃酮和芫花根總黃酮對小鼠巨噬細胞的吞噬能力及半數溶血值有增強作用，印證了黃酮類物質可以提高機體免疫功能。

遲發型變態反應是公認的測定細胞免疫功能的一種較準確的方法。本試驗發現所有灌喂酸模葉蓼類黃酮小鼠的右耳都明顯增厚，且與對照組的差異均達到極顯著水平（P＜0.01），說明酸模葉蓼類黃酮對小鼠細胞免疫功能具有顯著增強作用。T淋巴細胞在機體早期抗感染和細胞內寄生菌感染的免疫功能中發揮著重要的作用，其功能狀態可以反映機體細胞免疫功能的水平。韋翠萍等[12]研究發現沙苑子黃酮對小鼠淋巴細胞轉化率有顯著提高作用，本試驗證明酸模葉蓼類黃酮可以提高小鼠淋巴細胞轉化率且效果與劑量相關，與其研究結果一致。因此，酸模葉蓼類黃酮可增強小鼠的特異性和非特異性免疫功能。

3.3 酸模葉蓼類黃酮對小鼠抗氧化性能的影響GSH-Px是機體內存在的一種催化H2O2分解的酶，能直接或間接地通過酶反應清除自由基，也可促進其他抗氧化劑的再生。它能特異性催化還原型谷胱甘肽對H2O2的還原反應，可以保護細胞膜結構和功能的完整。GSH-Px缺乏能導致線粒體的損傷，增加活性氧自由基的產生，同時提高由于自由基損傷造成的毒性影響。SOD可以消除機體新陳代謝中產生的有害自由基，是重要的抗氧化酶，在維持細胞膜結構完整性方面發揮著重要的作用。MDA可反映機體內脂質過氧化的程度，其含量與細胞損傷的程度呈正相關，因此，MDA被認為是反映機體脂質過氧化水平的一個間接指標。機體中存在各種抗氧化物，例如抗氧化大分子、小分子和酶等，這些抗氧化物可以清除機體產生的各種活性氧，以阻止氧化應激的產生[13]。T-AOC是對一個體系內各種抗氧化大分子、小分子和酶總體水平的反映。酸模葉蓼類黃酮能提高血清中的SOD、TAOC、GSH-Px水平，降低血清中的MDA水平，說明酸模葉蓼類黃酮化合物在動物機體內有良好的抗氧化作用。

機體新陳代謝過程中會產生一系列的自由基。自由基性質活潑，氧化能力極強，可通過氧化反應破壞細胞膜、線粒體膜，并且與膜中的不飽和脂肪酸發生反應，生成脂質過氧化產物，分解產生更多的自由基，從而引起自由基連鎖反應[14]。酸模葉蓼類黃酮可以提高小鼠的抗氧化能力，其機制可能為終止自由基連鎖反應，途徑可能為類黃酮給H2O2提供氫原子形成類黃酮自由基[15]；還可能是酸模葉蓼類黃酮絡合有催化作用的金屬離子[16]，抑制自由基形成，減少自由基對不飽和脂肪酸的氧化作用；酸模葉蓼類黃酮還可能減少自由基對機體內蛋白質和總RNA等的損害[14]及對機體新陳代謝的干擾，通過抗氧化作用保護線粒體內過氧化氫酶的活性[17]。

4 結論

綜上所述，在機體生長方面，適宜劑量的酸模葉蓼類黃酮能提高小鼠的生長指標，促進HGH的分泌。隨著酸模葉蓼類黃酮劑量的增加。小鼠T3、T4的分泌量也呈增長趨勢。在機體免疫方面，添加酸模葉蓼類黃酮能夠提高小鼠的特異性和非特異性免疫功能。在抗氧化方面，酸模葉蓼類黃酮在提高血清中SOD、T-AOC、GSH-Px水平，降低血清中MDA水平方面都有積極作用。這為酸模葉蓼類黃酮作為飼料添加劑的開發提供了科學依據。

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（編輯：郭雪峰）

Effect of Polygonum Lapathifolium Flavonoids on Growth、Immunity Performance and Antioxidant Properties of Mice

Zhu Yujing1,Li Yan2,Yu Zhijiao1,Zhang Yong1*

（1.College of Animal Science and Veterinary Shenyang Agricultural University,LiaoningShenyang110866；2.Qingdao Chia Tai pig industry Company Limited,ShandongQingdao266000; 3.Shenyang Edmund swine breeding co.,LTD,LiaoningShenyang110171）

The present research studied the functions of flavonoids from Polygonum lapathifolium.The 36 SPF mice were divided into 4 groups and were given Polygonum lapathifolium flavonoids at dosages of 30,100,300 mg/kg,and the performance of growth,immune,oxidation were tested. The results showed that low doses of flavonoids of Polygonum lapathifolium can promote the growth of mice,especially T4 levels of each experimental group were significantly higher than that in the control group(P＜0.05);The middle doses group of Polygonum lapathifolium flavonoids can significantly increase serum HGH levels(P＜0.01);The low doses of Polygonum lapathifolium flavonoids improved the level of spleen index of mice,The macrophage phagocytosis rate of high dosesgroup were significantly higher than that in the control group(P＜0.05),Half hemolysin value of middle dose group and high dose group reached a significant level(P＜0.05)and a significant level(P＜0.01)separately to the control group,Middle dose group of Polygonum lapathifolium flavonoidsverysignificantlyimprovedthelymphocytetransformationrateofmice(P＜0.05),each treatmentgroupofPolygonumlapathifoliumflavonoidsverysignificantlyincreasedrightear thickness increasement(P＜0.01);The low and middle dose group of Polygonum lapathifolium flavonoids can significantly improve the activity of GSH-Px(P＜0.05).The middle dose group of Polygonum lapathifolium is the best to improve the value of SOD and reduce the content of MDA.The high doses group of Polygonum lapathifolium flavonoid play the best effect in improving the level of TAOC.

Polygonum lapathifolium;Flavonoids;Growth;Immunity performance;Antioxidant properties

R285.5文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)02-0001-07

2015-01-07

朱宇旌（1972-），女，博士，副教授，主要從事飼料資源開發利用的研究與教學工作。

張勇（1972-），男，博士，教授，從事豬的營養與飼料資源開發利用方面的教學和研究工作。

國家自然科學基金（31101253；30972112）