酶解與離心分相結晶協同制備抗性淀粉工藝研究

馮軍偉 黃繼紅， 蘇雪鋒 游 倩 侯銀臣 王 文 楊銘乾

（河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450001）

（鄭州市中食農產品加工研究院2，鄭州 450001）

酶解與離心分相結晶協同制備抗性淀粉工藝研究

馮軍偉1黃繼紅1，2蘇雪鋒1游 倩1侯銀臣2王 文1楊銘乾1

（河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450001）

（鄭州市中食農產品加工研究院2，鄭州 450001）

以抗性淀粉含量和產品收率為評價指標，對耐高溫α－淀粉酶添加量單因素優化分析和離心因素對照分析，得到早秈米抗性淀粉的最佳制備工藝條件：耐高溫α－淀粉酶量為1.20 U／g，脫支液4 000 r／min離心15min，重相和輕相分別結晶，經洗糖、干燥后得重相抗性淀粉質量分數可達30.69%，收率20.35%，輕相抗性淀粉質量分數可達45.82%，收率67.75%。2種產品對原淀粉總收率88.10%。并分析抗性淀粉碘吸收曲線和聚合度，表明相近聚合度（一定范圍內）的直鏈淀粉分子越集中越利于結晶形成抗性淀粉。該工藝驗證并充實了抗性淀粉形成機理假說：本質是直鏈淀粉分子的結晶，基本滿足工業化生產高含量抗性淀粉產品的要求。

早秈米抗性淀粉 離心分相 RS含量與收率評價 聚合度

充分利用我國庫存的已不再適宜人們直接食用的低價值早秈稻提取高附加值的淀粉，解決庫存谷物嚴重浪費的問題，再對其進行深加工，得到不同類型和規格的變性淀粉，尤其是高效制備抗性淀粉，是目前迫切需要解決的問題?？剐缘矸郏╮esistant starch，RS）是近年來國際上新興的食品研究領域?？剐缘矸勰芙档鸵葝u素反應，對Ⅱ型糖尿病有緩解作用［1－3］，調節機體能量攝入，控制體重［4－5］，因此在人類鍵康飲食中具有廣闊前景。世界衛生組織等機構1998年聯合出版的《人類營養中的碳水化合物》一書中指出：“抗性淀粉的發現和研究進展，是近年來碳水化合物與鍵康關系研究中的一項重要成果”，高度評價了RS對人類鍵康的重要意義。

抗性淀粉制備方法有高溫壓熱法、酸法、酶法（單酶法或雙酶法）、擠壓法或多法相結合，但存在抗性淀粉含量偏低、周期長（反復凍融）、成本高、產品收率低等問題。如李俊偉［6］報道利用擠壓法制備大米抗性淀粉的質量分數為8.87%；劉一洋［7］利用酸酶（普魯蘭酶）法制備大米抗性淀粉，其RS質量分數為24.31%；Zhang等［8］報道利用耐高溫α－淀粉酶和普魯蘭酶雙酶協同法制備玉米抗性淀粉后，又用耐高溫α－淀粉酶提純得到RS質量分數為58.87%抗性淀粉產品。本試驗在淀粉經普魯蘭酶脫支之后，結晶之前，將脫支液離心得重相（離心沉淀）和輕相（離心懸浮液），并將其分別結晶。以抗性淀粉含量和抗性淀粉收率雙重指標，研究了基于脫支液離心分離再分相結晶的早秈米抗性淀粉制備新工藝，為實現工業化生產高含量的抗性淀粉產品積累了試驗依據。并結合抗性淀粉碘吸收曲線和聚合度分析抗性淀粉形成的適宜條件，驗證并充實了抗性淀粉形成機理假說。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

早秈米：信陽固始縣祖師精米廠；耐高溫α－淀粉酶（6 000 U／g）、普魯蘭酶（液體，1 000 U／mL）：河南財鑫集團有限責任公司；抗性淀粉試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 主要儀器和設備

TH－500梯度混合器：上海滬西分析儀器廠；SHA－C數顯水浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；TDZ5－WS多管架自動平衡離心機：河南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 早秈米全粉制備

將早秈米在水中浸泡，然后用錘式旋風磨將濕潤的早秈米磨粉，最后60℃鼓風干燥，粉碎待用。

1.3.2 早秈米淀粉制備

2000g早秈米粉溶于6700mL0.1mol／L NaOH溶液，室溫攪拌4 h，三足式離心機離心棄上清，將沉淀表層黃色物質刮去后，水洗3次，第3次調pH至中性后離心棄上清液，沉淀60℃鼓風干燥，粉碎待用。

1.3.3 早秈米抗性淀粉制備方法

稱取80 g早秈米淀粉于500mL三角瓶中，加255mL水勻漿，調pH 6.2～6.4，然后加入耐高溫α－淀粉酶，放入高壓蒸汽滅菌器中，121℃處理30min，取出后冷卻至55℃，調pH 4.5～5.0后加入普魯蘭酶，55℃水浴中脫支16 h，取出離心（4 000 r／min，10min），重相（底部沉淀為凝膠狀）和輕相（上部液相）分別低溫（4℃）放置16 h，蒸餾水洗滌后60℃鼓風干燥，粉碎待用。

1.3.4 耐高溫α－淀粉酶添加量單因素優化

固定制備工藝中其他條件不變，將壓熱時耐高溫 α－淀粉酶添加量設 0、0.12、0.66、1.20、1.74 U／g 5個水平進行單因素優化試驗，每個水平重復3次。

1.3.5 抗性淀粉含量的測定

采用試劑盒AOAO Official Method 2002.02方法測定抗性淀粉含量。

1.3.6 抗性淀粉收率的計算

原料與樣品均以干基計算。

抗性淀粉收率＝（抗性淀粉樣品干燥質量／淀粉原料質量）×100%

1.3.7 抗性淀粉總含量的計算

抗性淀粉總RS含量＝（W1×重相抗性淀粉RS含量＋W2×輕相抗性淀粉RS含量／樣品質量淀粉）×100%

式中：W1為重相抗性淀粉干燥后質量／g；W2為輕相抗性淀粉干燥后質量／g。

1.3.8 抗性淀粉吸收曲線［6，9］

稱取20 mg抗性淀粉，加入0.5mL 2mol／L的KOH溶液，使RS充分溶解。加入4mL去離子水，用1mol／L的HCI將pH調至6.0～7.0，加水定容至10mL，取2mL于100mL容量瓶，加入95mL去離子水和2mL I2－KI溶液（2 mg I2／mL和 20 mg KI／mL）。定容至100mL，立即混勻?？瞻字胁患拥矸?，其余步驟相同。用紫外分光光度計掃描，波長500～800 nm。記錄最大吸收波長。

1.3.9 抗性淀粉平均聚合度的測定

采用還原末端法［10－11］。稱取 0.500 g淀粉樣品，溶解于2mol／L的KOH溶液中，充分溶解，再用HCl溶液調pH值至中性，定容至50mL。取 1mL溶液用3，5－二硝基水楊酸法測還原末端的數量，得到數據G（以葡萄糖的含量／mg／mL表示），根據下式計算平均聚合度DP。

式中：m為淀粉樣品的質量／mg；1.1為淀粉換算成葡萄糖的系數。

2 結果與分析

2.1 耐高溫α－淀粉酶添加量對不同規格產品抗性淀粉含量和收率的影響

本試驗工藝可得到3種不同規格的抗性淀粉產品，即重相抗性淀粉、輕相抗性淀粉和混合抗性淀粉（將重相抗性淀粉和輕相抗性淀粉粉碎混合即得，此研究表達為抗性淀粉產品總含量和總收率）。每一規格的抗性淀粉產品都分別同時以含量和收率雙重指標進行綜合評價，研究了耐高溫α－淀粉酶添加量對它們的影響（圖1）。

圖1 耐高溫α－淀粉酶量對抗性淀粉收率和RS含量的影響

2.1.1 耐高溫α－淀粉酶添加量對重相和輕相抗性淀粉含量的影響

耐高溫α－淀粉酶能隨機水解淀粉及其降解物內部的α－1，4葡萄糖苷鍵，使得膠狀淀粉溶液的黏度下降，產生可溶性糊精和寡聚糖，過度的水解可產生少量葡萄糖和麥芽糖。由圖1可得：耐高溫α－淀粉酶添加量對重相和輕相抗性淀粉含量的影響有著規律的變化。在0～1.20 U／g范圍內，2種規格產品的抗性淀粉含量都隨著酶添加量的增大而升高，但酶用量大于1.20 U／g時，可能由于酶解過度，2種規格產品的抗性淀粉含量都隨著酶添加量的增加而降低。故本試驗得出0.12 U／g為耐高溫α－淀粉酶的最佳添加量。

Zhang等［8］報道的在0～4 U／g范圍內隨著耐高α－淀粉酶添加量的增加抗性淀粉含量逐漸增大，上述試驗結果與之不相符。原因除了底物原料不同外，還有可能是對脫支液進行離心使脫支酶解液中直鏈淀粉分子或支鏈淀粉分子按照分子大小分配，淀粉聚合度較大的淀粉（包括直鏈以及支鏈）在底部為沉淀，淀粉聚合度較小的短直鏈淀粉（更適宜結晶形成抗性淀粉）在上部為懸浮液，且其影響遠比耐高溫α－淀粉酶的影響顯著?？剐缘矸坌纬杀举|上是一定聚合度（30～200）的直鏈重結晶的過程，因此本試驗中輕相抗性淀粉質量分數比重相抗性淀粉的高15%～18%。

2.1.2 耐高溫α－淀粉酶添加量對重相和輕相抗性淀粉收率的影響

由圖1也可得：在0～1.74 U／g范圍內，隨著耐高溫α－淀粉酶量的增加，RS含量較低的重相抗性淀粉收率呈降低的趨勢；與此同時以0.12 U／g為界，RS含量較高的輕相抗性淀粉收率呈升高的趨勢，大于0.12 U／g輕相抗性淀粉收率開始降低。此結果可能是因為耐高溫α－淀粉酶切斷α－1，4葡萄糖苷鍵，使聚合度較高的長鏈淀粉更多地酶解成聚合度相對低的中短鏈淀粉，經過脫支液離心環節，淀粉鏈分子質量分布發生變化，重相相對減少，輕相相對增多。但耐高溫α－淀粉酶添加量為1.74 U／g時，淀粉被過度酶解產生少量寡聚糖，不但使淀粉整體被消耗導致重相和輕相抗性淀粉收率都下降，而且使抗性淀粉摻雜有糖成分，所以必須有洗糖環節（洗糖還可以使產品pH達到中性條件，以及洗去其他少量可溶性成分以提高抗性淀粉含量）。因此最佳工藝是耐高溫α－淀粉酶添加量為1.20 U／g，重相抗性淀粉質量分數可達30.69%，收率達20.35%，輕相抗性淀粉質量分數可達45.82%，收率達67.75%，產品對原淀粉總收率88.10%。為實現工業化生產高含量抗性淀粉提供了可行的工藝路線。

2.1.3 耐高溫α－淀粉酶添加量對抗性淀粉產品總含量和總收率的影響

根據1.3.7計算得到抗性淀粉總含量。同樣由圖1可得：在0～1.20 U／g范圍內，抗性淀粉總含量隨著耐高溫α－淀粉酶量的增大而升高，但酶用量大于1.20 U／g時，抗性淀粉總含量隨著耐高溫α－淀粉酶量的增大而降低。再次分析驗證了0.12 U／g為本試驗耐高溫α－淀粉酶的最佳添加量，當酶用量大于1.20 U／g時，會導致過度酶解；也可證明直鏈淀粉分子是由很多不同聚合度的直鏈淀粉分子組成，聚合度呈連續的分布［12］，離心作用使其呈現梯度分離，在試驗現象上表現為重相和輕相之分。

同時由圖1可得：在0～1.74 U／g范圍內，隨著耐高溫α－淀粉酶量的增加，抗性淀粉總收率（重相和輕相抗性淀粉收率之和）呈降低的趨勢。這是因為酶解產生可溶性糊精和寡聚糖，過度的水解可產生少量葡萄糖和麥芽糖，經洗糖流失，導致收率下降。

2.2 抗性淀粉碘吸收曲線

淀粉－碘復合物吸光值法是利用淀粉與碘形成各種有色復合物來研究淀粉中直支鏈淀粉比例、鏈長或分子大小，也是直鏈淀粉含量的一種定性方法。直鏈淀粉－碘絡合物在600～640 nm間呈現最大吸收，而支鏈淀粉－碘絡合物的則為520～560 nm［13］。這種復合物的最大吸收波長、吸收峰的范圍和吸光度的變化都與直支鏈淀粉的比例、直鏈淀粉的含量和分子量大小等有密切關系。由圖2可得知早秈米重相和輕相抗性淀粉的最大吸收波長分別為582和580 nm，且碘吸收曲線在565～630 nm之間呈一較寬的吸收峰，位于支鏈淀粉－碘絡合物、直鏈淀粉－碘絡合物吸收峰范圍的中間，但稍偏向直鏈淀粉吸收峰，表明其可能含有較多的直鏈淀粉。

圖2 抗性淀粉碘吸收曲線

2.3 重相和輕相抗性淀粉平均聚合度分析

淀粉的平均聚合度對抗性淀粉含量影響較大。聚合度太小，直鏈淀粉分子短，運動比較強烈，擴散速度也較大，因此較難聚集；而聚合度太大，直鏈淀粉過長，分子間的斥力較大，也難聚集，所以中等適宜的長度才最有利于聚集［14］。把紫外掃描光譜得早秈米重相和輕相抗性淀粉的最大吸收波長582 nm和580 nm代入 Banks公式：1／λmax＝0.001 558＋0.010 25／DP［15］，定性得到重相和輕相抗性淀粉的DP值分別為64.0和61.7；由還原末端法定量檢測得重相和輕相抗性淀粉的DP值分別為55.2和40.4。Eerlingen等［16］認為抗性淀粉中淀粉的鏈長DP值在22～65之間，并且為線狀；趙力超等［10－11］曾報道淀粉平均聚合度在20～200范圍內，RS含量隨淀粉平均聚合度的減小而增大，且DP值在22左右時RS質量分數為99%；上述報道的定性描述和定量分析均與本試驗的結果基本相符。2種方法得到的DP值雖有些偏差，但前后結果并不矛盾，結合2.4抗性淀粉碘吸收曲線分析，可初步定性地得出本試驗工藝（脫支液離心得重輕相分別結晶）的理論依據：相近DP值（一定范圍內）的直鏈淀粉分子越集中（離心作用）越利于結晶形成抗性淀粉，而之所以輕相抗性淀粉質量分數比重相抗性淀粉的要高15%～18%，還有部分原因可能是脫支液離心后重相（顏色較輕相暗，甚至出現黃色）中含有少量的蛋白質和脂質等雜質，它們的存在影響了重相中直鏈淀粉分子的結晶。這與目前公認的抗性淀粉形成本質是直鏈淀粉的結晶假說并不矛盾，而且從另一方面驗證并充實了此假說?？剐缘矸壑饕怯砷L度適宜的短直鏈淀粉相互之間通過氫鍵結合而老化形成的。作為線性高分子，直鏈淀粉結晶趨勢很強，在水溶液中直鏈淀粉分子快速凝聚并超過膠體尺寸，從而導致沉淀或形成凝膠。

3 結論

基于脫支液離心分離再分相結晶的早秈米抗性淀粉制備新工藝最佳條件為：耐高溫α－淀粉酶量為1.20 U／g，121℃壓熱30min，普魯蘭酶脫支 16 h，脫支液4 000 r／min離心15min，重相和輕相分別結晶，干燥后得重相和輕相2種規格的抗性淀粉產品，其中重相抗性淀粉質量分數可達30.69%，收率達20.35%，輕相抗性淀粉質量分數可達45.82%，收率達67.75%。產品對原淀粉總收率88.10%，該工藝基本上滿足實現工業化生產高含量抗性淀粉產品的要求。初步定性地得出本試驗工藝的理論依據：相近DP值（一定范圍內）的直鏈淀粉分子越集中越利于結晶形成抗性淀粉。驗證并充實了抗性淀粉形成機理假說：本質是直鏈淀粉分子的結晶。其中DP值范圍有待于利用更加準確的方法進行后續試驗研究。

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Resistant Starch Prepared by Enzymatic Hydrolysis Cooperated with Phase Separation by Centrifugation

Feng Junwei1Huang Jihong1，2Su Xuefeng1You Qian1Hou Yinchen2Wang Wen1Yang Mingqian1

（College of Biological Engineering，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450001）
（Zhongshi Research Institute of Agricultural Products Processing2，Zhengzhou 450001）

The efficient preparation of resistant starch（RS）from early indica rice was studied.α－Amylase amountswere evaluated and comparison of the resistant starch in heavy portion（HRS）and in light portion（LRS）was made by the content and yield of resistent starch.The optimalα－amylase amountwas1.20 U／g.The heavy and light portion were got by centrifuging at4 000 r／min for 15min.Then，the HRSand LRSwere obtained by crystallizing，dissolving and drying，respectively.The contentof resistant starch in heavy resistant starch was30.65% （m／m）with yield coefficient20.35%，while the content of resistant starch in light resistant starch was 45.82%with yield coefficient 67.75%.The total yield coefficient of the two productswas 88.10%.The analysis on iodine absorption curve and degree of polymerization（DP）of two products showed that the amylosemoleculeswith similar DP had a positive relationship with the formation of resistant starch.Basically，tomeet the requirements of industrial production for products rich in resistant starch，this preparation technique verified and developed a hypothesis of RS formation mechanism.

early indica rice resistant starch，separate phase by centrifugation，content and yield evaluation of resistant starch，degree of polymerization

Q814.9

A

1003－0174（2015）06－0049－05

河南工業大學橫向項目（151260），河南省產學研合作項目（12210700003）

2014－01－22

馮軍偉，男，1988年出生，碩士，發酵工程