葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內參基因的穩定性分析

毛根林, 解　云, 趙俊龍, 陳　炎, 徐漢虹, 林　菲

(華南農業大學 農學院/天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510642)

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葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內參基因的穩定性分析

毛根林, 解云, 趙俊龍, 陳炎, 徐漢虹, 林菲

(華南農業大學 農學院/天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】篩選葡萄糖基氟蟲腈(GTF)及溶劑二甲基亞砜(DMSO)處理下蓖麻Ricinuscommunis穩定的內參基因，為研究GTF的韌皮部裝載機制提供參考?！痉椒ā窟x取Actin，ARC，ef1a，SamDC，TUA6為內參基因，通過實時熒光定量PCR分析基因表達量并利用geNorm，NormFinder，BestKeeper，Delta CT軟件及RefFinder在線分析工具綜合比較不同時間和不同濃度的GTF與DMSO處理后，5個候選內參基因在蓖麻幼苗子葉中表達的穩定性?！窘Y果】各軟件分析得出的內參基因穩定性排名依次為geNorm：Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6；NormFinder：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6;BestKeeper：Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6；Delta CT：SamDC>Actin>ARC>ef1a>TUA6; RefFinder：Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6，而單獨分析DMSO處理時，穩定性排名則為：ef1a>SamDC>Actin>TUA6>ARC?！窘Y論】綜合分析GTF和DMSO處理，Actin的表達最穩定；在DMSO處理下，則ef1a最為穩定。

關鍵詞：蓖麻； 葡萄糖基氟蟲腈； 二甲基亞砜； 實時熒光定量PCR； 內參基因； 穩定性

農藥施用減量增效要求在減少農藥施用量的同時提高農藥的使用效率，降低農藥殘留，保證食品安全，這也是當前農藥研究者共同努力的方向。徐漢虹等[1]提出的“導向農藥”理念完美契合農藥減量增效的目的，對保障食品安全具有非常重要的意義。導向農藥能夠在植物內源轉運蛋白的作用下定向積累至病蟲為害部位，它的作用方式可以分為2種：一是當植物受到危害時，導向農藥分子能夠被植物應激反應產生的酶消解并釋放出農藥母體分子作用于靶標；二是具有農藥活性的導向分子直接作用于靶標從而達到防治病蟲害的目的。植物內源糖從源葉合成，在糖轉運蛋白介導下源源不斷地通過韌皮部轉運至植物庫組織[2]；基于導向農藥的理念，Yang等[3]合成了葡萄糖基氟蟲腈耦合物，并發現其有可能是通過蓖麻糖轉運蛋白介導進入蓖麻韌皮部[4]。充分利用植物對內外源化合物的吸收與轉運機制對于提高農作物產量，探索病蟲害防治新策略具有非常重要的意義。

利用植物對內外源糖物質的吸收轉運規律，對關鍵基因進行修飾從而提高作物產量；合成能夠被植物轉運載體介導的新型農藥分子，實現農藥分子在植物體內的主動運輸和定向積累，對于病蟲害防治能起到事半功倍的效果。研究發現草甘膦、百草枯、葡萄糖基氟蟲腈、部分農藥分子與氨基酸的耦合物L-lysine-2,4-D等雖然能被磷酸轉運蛋白、聚胺轉運蛋白、糖轉運蛋白、氨基酸轉運蛋白所介導[4-7]，但卻無法明確具體的轉運子，無法明確化合物與轉運載體之間的構效關系，大大降低了這類農藥的開發效率。

蓖麻Ricinuscommunis是用來研究內外源化合物韌皮部輸導性的模式植物，隨著其基因組數據庫的釋放，蓖麻中的各類轉運蛋白家族將會被鑒定，利用RT-qPCR技術分析并克隆能被載體介導的化合物處理前后差異表達的基因，是鑒定參與化合物韌皮部裝載的相關載體蛋白的重要手段。RT-qPCR自1995年由美國PE公司成功開發以來，便以其操作簡便、檢測靈敏度高、重復性好、檢測速度快等優點，被廣泛應用于生命科學、分子診斷學、農學與醫學、食品微生物學等領域[8]。在基因表達分析過程中，RNA的質量和產量、不同組織或細胞間反轉錄效率的差異等因素均有可能影響到目的基因表達分析結果的準確性[9]。為了獲取準確的結果，除了提高RNA質量，選擇合適的內參基因來校正和標準化mRNA是最首要的方式[10]。理想的內參基因的表達不受試驗因素的影響而恒定表達在各種類型的組織或細胞中[11]。常用的內參基因是構成細胞器骨架的基本組分或是參與生物體的基本生化代謝過程的基因[12-14]。同一個內參基因在不同的試驗條件下表達的穩定性是不一樣的，如玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaLeconte在不同的試驗條件下β-Actin在其整個生命周期內表達穩定，RPS9則在dsRNA處理后的玉米根螢葉甲中表達穩定性最好，而BT處理后，EF-1在不同的組織中表達最為穩定[15]；在荔枝果實不同發育階段用外源生長調節劑處理后β-Actin比GAPDH、18SrRNA、UBQ、eEF和25S rRNA的穩定性更好[16-17]，由此可見篩選出化合物處理前后都能穩定表達的內參基因是RT-qPCR技術分析并克隆能被載體介導的化合物處理后差異表達的基因的基礎。

本研究以蓖麻幼苗子葉為材料，選取常用的內參基因Actin、ARC、SamDC、ef1a、TUA6作為候選基因，用RT-qPCR方法檢測上述常用內參基因在不同濃度及不同時間的GTF及其溶劑DMSO處理下的表達量，分別采用常用的內參基因穩定性評價軟件geNorm[10]、NormFinder[18]、BestKeeper[19]、Delta CT[20]進行數據分析，最后用RefFinder[21]在線工具對上述4種軟件的計算結果進行綜合評價，為研究GTF相關的轉運載體基因的表達分析研究篩選出最為穩定的內參基因。

1材料與方法

1.1材料

蓖麻種子由淄博市農業科學院提供。成熟蓖麻種子在濕脫脂棉上于27 ℃下催芽48 h后，選出發芽的種子，播入蛭石中，置于人工氣候箱內進行培養。培養條件為：溫度為27 ℃，相對濕度為75%～85%，光照度260～350 lx，每天光照14 h,連續培養6 d的蓖麻幼苗作為供試材料。

1.2方法

1.2.1蓖麻幼苗的藥物處理將蓖麻幼苗小心剝去胚乳，用手輕輕擦洗子葉表面，切勿折疊或弄破子葉。用子葉培養緩沖液(20 mmol·L-1MES, 0.25 mmol·L-1MgCl2, 0.5 mmol·L-1CaCl2, 2 mmol·L-1EDTA, pH 5.0)配制相應濃度的GTF或者DMSO后，將蓖麻子葉浸泡于相應含藥緩沖液中，同時將蓖麻根部置于根部培養緩沖液(0.5 mmol·L-1CaCl2, 1 mmol·L-1MES)中。濃度梯度試驗設定7個GTF和DMSO濃度梯度，分別為10、25、50、100、200、500、1 000 μmol·L-1，于人工氣候箱內培養6 h后收集樣品；時間梯度試驗設置為以100 μmol·L-1的GTF或DMSO處理蓖麻幼苗，分別于0、3、6、9、12 h后收集子葉。每個處理設3個重復，以不含GTF及DMSO的緩沖液為對照組，完成相應的處理后在蓖麻幼苗胚柄處剪斷，將子葉裝入錫紙袋，用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2蓖麻子葉總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成使用Omega植物RNA提取試劑盒提取經過處理的蓖麻子葉總RNA，并用核酸蛋白定量儀(ND1000，Eppendorf)檢測RNA樣品的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm值，確定RNA的濃度和純度，同時用含甲醛(w=12.5%)的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。隨后RNA用RQ1 RNase-free DNase處理，并用反轉錄試劑盒(Bio-Rad)進行第一鏈cDNA的反轉錄。轉錄完成后以合成的cDNA為模板克隆內參基因片段以進行RT-qPCR試驗。

1.2.3候選內參基因的處理根據水稻內參基因的氨基酸序列[20], 在NCBI上獲得對應的蓖麻內參基因登錄號和基因序列，并通過Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成。選取的內參基因引物序列見表1。

表1　RT-qPCR候選內參基因的引物序列

以含候選基因片段的質粒為模板構建其對應的標準曲線。利用cDNA為模板獲得候選內參基因片段。通過20 g·L-1凝膠電泳檢測并用 DNA凝膠純化試劑盒回收目的片段，將回收產物連接pMD20-T載體上，藍白斑篩選陽性克隆并測序。經驗證正確的陽性克隆擴大培養后，用質粒小提試劑盒(Omega)提取質粒。取500 ng質粒用Dilution Buffer(Takara)稀釋, 每個梯度稀釋10倍，依次稀釋5～8個梯度，則濃度分別為50、 5、 1/2、1/20、 1/200和1/2 000、1/20 000、1/200 000 ng·μL-1。以稀釋后的質粒為模板進行RT-qPCR反應，PCR儀自帶的計算軟件CFX Manager TM Software自動計算獲得熔解曲線，并根據所得Ct值繪制標準曲線，得到斜率(k)和線性相關系數(R)。根據公式E= 5-1/k-1，計算得出擴增效率(E)。候選內參基因引物特異性則通過RT-qPCR的熔解曲線的峰形圖來評價。

1.2.4RT-qPCR 分析RT-qPCR反應用Bio-Rad CFX-96 Real-Time PCR System完成。反應體系按照IQTMSYBR? Green Supermix說明書進行配制，反應總體積為20 μL；反應條件如下：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 40 s，40個循環后進行65～95 ℃熔解曲線分析。每個樣品設定3個重復。

1.3數據分析

根據Bio-Rad CFX-96 Real-Time PCR System獲得的各樣品的Ct值，采用geNorm，NormFinder，BestKeeper,Delta CT 4種算法對各候選內參基因的穩定性進行比較，同時參考RefFinder的計算結果，篩選出在GTF及DMSO處理下穩定性最好的內參基因。

2結果與分析

2.1候選內參基因引物特異性及擴增效率

以反轉獲得的cDNA為模板擴增候選內參基因片段，電泳檢測結果顯示所得目的條帶大小與理論值一致, 且沒有發現其他條帶，擴增特異性好(圖1)。

M: DNA Marker DL 2 000；1:Actin；2:ARC；3:ef1a; 4:SamDC; 5:TUA6。

圖1候選內參基因PCR擴增產物檢測

Fig.1Detection of PCR amplification products of five candidate reference genes

RT-PCR的結果表明，各候選內參基因的相關系數(R)≥ 0.996, 引物的擴增效率為95.0%～107.7%，均符合RT-qPCR對擴增效率的要求(表2)；進一步分析熔解曲線，發現各候選內參基因都只產生單一的熔解峰。上述結果說明所設計的引物特異性良好，RT-qPCR反應的專一性高，準確性好。

表2　5個候選內參基因的標準曲線參數

2.2候選內參基因的表達譜分析

在RT-qPCR試驗中，Ct值與基因的表達量成反比。本研究結果表明同一個擴增反應的3個重復的標準差很小，Ct值非常接近，說明擴增反應重復性好，能準確反映基因的轉錄水平；5個候選內參基因的Ct值均位于17～24，同時都處于相應候選內參基因標準曲線的Ct跨距之內；同一個基因，濃度處理對其表達量影響較大；其中對ef1a的表達量最大(17～21)，SamDC及ARC的表達量相對較小(18～24)；在所有的樣品中，ef1a的Ct值變化范圍最小，△Ct為2.77，其次是Actin，SamDC的Ct值變化最大，△Ct為4.23。同一個基因在不同的樣品中表達量的差異說明有必要對這些常用內參基因進行篩選，以選擇合適的內參基因或組合來進行接下來的定量試驗。

2.3不同處理候選內參基因穩定性分析

2.3.14種軟件分析內參基因穩定性將RT-qPCR試驗所獲得的Ct值處理后導入geNorm(V3.5)計算出各候選內參基因的穩定值(M值)，M值越大，表示穩定性越差。計算結果(圖2a)表明，5個候選內參基因均相對較穩定(M<1.5)，Actin和ef1a的M值最低，穩定性最好；ARC的M值最高，穩定性最差；這5個候選內參基因的穩定性從高到低依次為：Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6，即在geNorm的算法中，Actin與ef1a的穩定性最好。

按NormFinder軟件要求，將處理好的數據導入軟件進行計算，得出各候選內參基因的穩定值M，M值越大，說明基因的穩定性越差；反之則說明基因的表達穩定性越好。經計算獲得5個候選內參基因的M值，按穩定性由高到低依次為：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6(圖2b)，即在NormFinder算法中，SamDC的穩定性最好。

將RT-qPCR反應獲得的Ct值導入BestKeeper軟件，根據各候選基因標準偏差值(SD)來確定候選基因的相對穩定性，SD值越小，穩定性越好。在本次試驗中，所有基因的SD值均小于1，其SD大小順序依次為：Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6(圖2c)，即在BestKeeper軟件的算法中Actin的穩定性最好。

利用Delta CT軟件計算5個候選內參基因的Ct值平均標準偏差(SD),SD越小，表明基因穩定性越高。將計算結果按穩定性由高到低進行排序，依次為：SamDC>Actin>ARC>ef1a>TUA6(圖2d)，即在Delta CT軟件的算法中SamDC的穩定性最好。

圖2　不同軟件分析5種候選內參基因的穩定性

Fig.2Expression stability of five candidate reference genes calculated by geNorm，NormFinder software，BestKeeper software and Delta CT software

2.3.2RefFinder綜合分析由以上分析可知，geNorm，NormFinder，Delta CT和BestKeeper 4種軟件由于不同的算法分析出來的結果也存在差異。此時可以利用RefFinder在線分析工具來進行綜合分析從而選出表達相對最為穩定的內參基因。RefFinder可以根據各種算法所得的候選內參基因穩定表型排名的幾何平均數作為綜合排名，從而篩選出最穩定的內參基因?；蚓C合穩定參數與基因表達穩定性成反比。根據計算結果可知GTF及DMSO處理下，候選內參基因表達穩定性由高到低依次為：Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6(圖4)。

圖3　RefFinder綜合分析比較候選內參基因穩定性

Fig.3Expression stability of five candidate reference genes analyzed by RefFinder software

2.3.3DMSO處理下內參基因的穩定性分析DMSO在蓖麻體系中的韌皮部輸導性研究中常被用作溶劑，有必要對其處理的樣品單獨進行內參基因穩定性分析，以作參考。RefFinder分析結果(圖4)表明，在10～1 000 μmol·L-1的濃度梯度及0～12 h的時間梯度的DMSO處理下ef1a是最穩定的內參基因。

圖4DMSO在不同處理濃度及不同處理時間下的內參基因穩定性分析

Fig.4Expression stability of five candidate reference genes analyzed by RefFinder in all tested samples treated with different concentrations of DMSO and different times

3結論

本研究比較了Actin、ARC、SamDC、ef1a、TUA6 基因在不同濃度及不同時間的GTF及其溶劑DMSO處理前后的表達量，并分別采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT 4個軟件及RefFinder在線分析工具對各候選內參基因的穩定性進行計算分析，以期獲得相對穩定的用于校正和標準化RT-qPCR試驗的一個或是一組內參基因。geNorm軟件的計算結果中，Actin與ef1a為穩定性最好的組合；在NormFinder與Delta CT的算法中，SamDC是穩定性最好、最適合的內參基因；而通過BestKeeper獲得的結果表明，Actin是最穩定的內參基因。由于各軟件算法的不同導致計算結果不盡相同，難以取舍。而RefFinder在線工具可以根據以上4種算法所得的候選內參基因穩定性的幾何平均數綜合排名，篩選出表達最為穩定的基因，結果表明GTF、DMSO共同處理綜合分析時Actin的穩定性最好。單獨對DMSO處理后的內參基因穩定性分析時發現ef1a是最穩定的內參基因。本文分析了5個常用內參基因在GTF和 DMSO共同處理及DMSO單獨處理下內參基因的穩定性，可為相關研究提供參考。

參考文獻：

[1]徐漢虹，張志祥，程東美，等. 導向農藥[J].世界農藥，2004(5): 3-9.

[2]DOIDY J, GRACE E, KUHN C, et al. Sugar transporters in plants and in their interactions with fungi[J]. Trends Plant Sci， 2012, 17(7):413-422.

[3]YANG W, WU H, XU H, et al. Synthesis of glucose-fipronil conjugate and its phloem mobility[J]. J Agr Food Chem, 2011, 59(23):12534-12542.

[4]WU H, YANG W, ZHANG Z, et al. Uptake and phloem transport of glucose-fipronil conjugate inRicinuscommunisinvolve a carrier-mediated mechanism[J]. J Agr Food Chem, 2012, 60(24): 6088-6094.

[5]DENIS M, DELROT S. Carrier-mediated uptake of glyphosate in broad bean (Viciafaba) via a phosphate transporter[J]. Physiol Plantarum, 1993, 87(4):569-575.

[6]FUJITA M, SHINOZAKI K. Identification of polyamine transporters in plants: Paraquat transport provides crucial clues[J]. Plant Cell Physiol, 2014, 55(5): 855-861.

[7]CHOLLET J, DELETAGE C, FAUCHER M, et al. Synthesis and structure-activity relationships of some pesticides with an alpha-amino acid function[J]. Biochim Biophys Acta, 1997, 1336(2): 331-341.

[8]POSTOLLEC F, FALENTIN H, PAVAN S, et al. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiol[J]. Food Microbiol, 2011, 28(5): 848-861.

[9]袁偉，萬紅建，楊悅儉. 植物實時熒光定量PCR內參基因的特點及選擇[J]. 植物學報, 2012(4): 427-436.

[10]VANDESOMPELE J, DE PRETER K, PATTYN F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002, 3(7): H34.

[11]TONG Z, GAO Z, WANG F, et al. Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR[J]. BMC Mol Biol, 2009, 10(1): 71.

[12]HUGGETT J, DHEDA K, BUSTIN S, et al. Real-time RT-PCR normalisation, strategies and considerations[J]. Genes Immun, 2005, 6(4): 279-284.

[13]HONG S, SEO P J, YANG M, et al. Exploring valid reference genes for gene expression studies in Brachypodium distachyon by real-time PCR[J]. BMC Plant Biol, 2008, 8(1):112.

[14]SUZUKI T, HIGGINS P J, CRAWFORD D R. Control selection for RNA quantitation[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 332-337.

[15]BARROS R T, KHAJURIA C, WANG H, et al. Validation of reference housekeeping genes for gene expression studies in western corn rootworm (Diabroticavirgiferavirgifera)[J/OL]. PLoS One, 2014, 9(10): e109825.http://www.plosoneorg.sci-hub.org/article/fetchobject.action?uri=info:doi/10.1371/journal.pone.0109825&rep resentation=PDF.

[16]魏永贊，賴彪，胡福初，等. 用于荔枝qPCR分析的內參基因克隆及穩定性分析[J]. 華南農業大學學報, 2012,33(3): 301-306.

[17]GUTIERREZ L, MAURIAT M, GUENIN S, et al. The lack of a systematic validation of reference genes: A serious pitfall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis in plants[J]. Plant Biotechnol J, 2008, 6(6): 609-618.

[18]ANDERSEN C L, JENSEN J L, ORNTOFT T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5245-5250.

[19]PFAFFL M W, TICHOPAD A, PRGOMET C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper:Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnol Lett, 2004, 26(6): 509-515.

[20]SILVER N, BEST S, JIANG J, et al. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR[J]. BMC Mol Biol, 2006, 7(1):33.

[21]XIE F, SUN G, STILLER J W, et al. Genome-wide functional analysis of the cotton transcriptome by creating an integrated EST database[J/OL]. PLoS One, 2011, 6(11): e26980.http://www.plosone.org.sci-hub.org/article/fetchobject.action?uri=info:doi/10.1371/journal.pone.0026980&representation=PDF.

[22]JAIN M, NIJHAWAN A, TYAGI A K, et al. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345(2): 646-651.

【責任編輯霍歡】

Stability analysis of internal reference gene of Ricinus communis

treated by glucose-fipronil

MAO Genlin, XIE Yun, ZHAO Junlong, CHEN Yan, XU Hanhong, LIN Fei

(College of Agriculture, South China Agricultural University/Key Laboratory of Natural Pesticide and

Chemical Biology, Ministry of Education, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To screen reliable internal reference genes of castor，Ricinuscommunis，treated by glucose-fipronil (GTF) and the solvent dimethyl sulfoxide (DMSO)，and to provide a basis for studying the uptake mechanism of GTF. 【Method】Actin,ARC,ef1a,SamDCandTUA6 genes were selected as candidate reference genes. Specific primers for each gene were designed and real-time quantitative PCR was conducted. Five softwares，including geNorm, NormFinder, BestKeeper, Delta CT and RefFinder，were employed to analyze the gene expression stabilities in cotyledon of castor seedlings treated by GTF and DMSO with different concentration and time. 【Result】 The stabilities were variant according to different softwares. The rank orders of stability were geNorm:Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6；NormFinder：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6; BestKeeper:Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6；Delta CT:Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6;RefFinder:Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6. With a single analysis of DMSO treatment by RefFinder showed thatef1a>SamDC>Actin>TUA6>ARC.【Conclusion】Actinis the stablest reference gene under GTF and DMSO treatments, whileef1ais the stablest one under DMSO treatment.

Key words：Ricinuscommunis; GTF; DMSO; RT-qPCR; internal reference gene; stability

中圖分類號：S511；S502

文獻標志碼：A

文章編號：1001-411X(2016)01-0052-06

基金項目：國家自然科學基金(31171889)；高等學校博士學科點專項科研基金(20114404110020，20134404130003)

作者簡介：毛根林(1989—)，男，碩士研究生，E-mail：maogenlin@163.com；通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@scau.edu.cn；林菲(1977—)，女，副研究員，博士，E-mail：resistanc@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-02優先出版時間：2015-12-07

優先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1132.020.html

毛根林, 解云, 趙俊龍，等.葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內參基因的穩定性分析[J].華南農業大學學報，2016,37(1):52-57.