CD4+CD25+調節性T細胞對乳腺癌細胞上皮間質轉化和ALDH1+干樣細胞的影響*

孫立平劉軍金昊李慧③

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CD4+CD25+調節性T細胞對乳腺癌細胞上皮間質轉化和ALDH1+干樣細胞的影響*

孫立平①劉軍②金昊①李慧①③

摘要目的：研究CD4+CD25+調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）對乳腺癌細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）、細胞遷移侵襲能力，及ALDH1+干樣細胞比例的影響。方法：采用免疫磁珠法分離乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+Tregs，CD4+CD25+Tregs與乳腺癌BT474、MCF-7細胞系共培養（共培養組），BT474、MCF-7單獨培養（對照組）。檢測共培養組和對照組乳腺癌細胞EMT相關標志物表達的變化，及細胞遷移和侵襲能力的變化。此外，檢測BT474細胞中ALDH1+干樣細胞、微球形成能力和自我更新能力的變化。結果：CD4+CD25+Tregs誘導BT474和MCF-7細胞間質性標志物表達增高，誘導MCF-7細胞上皮性標志物E-cadherin表達降低。CD4+CD25+Tregs誘導BT474和MCF-7細胞遷移和侵襲能力上調。共培養組BT474細胞中ALDH1+干樣細胞比例、微球體形成能力、自我更新能力較對照組增強。結論：CD4+CD25+Tregs可誘導乳腺癌細胞發生EMT，增強細胞體外遷移和侵襲能力，同時促進ALDH1+干樣細胞增加。

關鍵詞調節性T細胞乳腺癌上皮間質轉化ALDH1+干樣細胞

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81171983）資助

CD4+CD25+regulatory T cells induce epithelial-mesenchymal transition and increase ALDH1+cancer stem cell-like cells in breast cancer

Liping SUN1,Jun LIU2,Hao JIN1,Hui LI1,3
Correspondence to:Hui LI;E-mail:lihui@tjmuch.com
1
Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,
Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin 300060,China;2Department of Chemotherapy,The Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226000,China;3Department of
Gastrointestinal Cancer Biology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171983)

Abstract Objective:To investigate the effects of CD4+CD25+regulatory T cells(Tregs)on the epithelial-mesenchymal transition(EMT),migratory and invasive capacities,and proportion of ALDH1+cancer stem cell(CSC)-like cells in breast cancer cells.Methods:CD4+CD25+Tregs were isolated from the peripheral blood of breast cancer patients through immunomagnetic sand method.In the co-culture groups,breast cancer cell lines BT474 and MCF-7 were co-cultured with CD4+CD25+Tregs.In the control groups,BT474 and MCF-7 cells were cultured alone.EMT-related markers of breast cancer cells were then assayed in the control and co-culture groups.The migratory and invasive capacities of breast cancer cells were also detected in both groups.Furthermore,the changes in ALDH1+CSC-like cells,mammosphere-forming ability,and self-renewal capacity of BT474 cells were assayed.Results:After co-culture with CD4+CD25+Tregs,the expression of mesenchymal biomarkers increased in BT474 and MCF-7 cells,whereas the expression of the epithelial biomarker E-cadherin decreased in MCF-7 cells.Additionally,the migratory and invasive capacities of BT474 and MCF-7 cells increased after co-culture.Overall,the subpopulation of ALDH1+CSC-like cells,the mammosphere-forming ability,and the self-renewal capacity of BT474 cells improved in the co-culture group compared with the control group.Conclusion:The EMT process,migratory and invasive capacities,and CSC-like properties of breast cancer cells can be enhanced by CD4+CD25+Tregs.

Keywords:regulatory T cells,breast cancer,epithelial-mesenchymal transition,ALDH1+cancer stem cell-like cells

乳腺癌是女性發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，患者死亡的首要原因是復發和轉移［1］。因此，探尋降低腫瘤復發、轉移的原因以提高治療效果極為重要。研究發現上皮間質轉化（epithelial-mesen?chymal transition，EMT）和腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用［2-3］。乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是催化細胞內乙醛氧化為乙酸的細胞溶質酶。ALDH1在乳腺癌CSCs中高表達，可作為CSCs的標記物［4］。免疫微環境與腫瘤細胞的相互作用和影響促進腫瘤細胞EMT和干性增加［5］。本實驗主要是探討CD4+CD25+調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）對乳腺癌細胞EMT和干性特征的影響，進一步闡述CD4+CD25+Tregs在腫瘤發生與發展過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料

人乳腺癌BT474和MCF-7細胞系分別購自中國科學院和美國ATCC細胞庫；RPMI 1640培養基和DMEM/F12培養基分別購自天津BIOROC和美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；CD4+CD25+Tregs分選試劑盒購自德國Miltenyi公司；CD3/CD28磁珠購自美國Invitrogen公司；IL-2購自美國Sigma公司；外周血淋巴細胞分離液（Ficoll）購自中國醫學科學院血液學研究所；Trizol購自美國Life Technology公司；逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司；RNA引物及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購于大連寶生物公司；E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin、Vimentin和β-actin一抗購自美國BD公司；ALDH1一抗購自武漢BOSTER公司；ALDEFLUOR?試劑盒購自加拿大STEMCELL公司；bFGF和胰島素購自美國Sigma公司；EGF購自美國Millipore公司；BSA購自美國Fisher Scientific公司。

1.2方法

1.2.1免疫磁珠法分選CD4+CD25+Tregs使用Ficoll密度梯度離心法分離乳腺癌患者外周血中單個核細胞，使用免疫磁珠方法按說明分離CD4+CD25+Tregs。

1.2.2細胞培養使用含10%FBS的RPMI 1640培養基在37°C、5%CO2條件下培養細胞。共培養組為CD4+CD25+Tregs和腫瘤細胞（1:1）共培養72 h，同時添加IL-2和CD3/CD28磁珠；對照組為腫瘤細胞常規培養。

1.2.3 RT-PCR檢測按照Trizol提取試劑盒，提取細胞總RNA并逆轉錄成cDNA，再按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-PCR。RT-PCR引物序列如表1所示。

1.2.4 Western blot檢測使用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗體稀釋液稀釋的E-cadherin（1:2 500）、N-cad?herin（1:2 000）、Fibronectin（1:10 000）、Vimentin（1:8 000）、β-actin（1:2 000）和ALDH1（1:200）一抗，4℃過夜。第2天取出膜，PBST漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h后PBST漂洗，ECL化學發光法顯影。

表1　RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-PCR

1.2.5 ALDH1流式細胞儀檢測將1.0 mL細胞懸液加入測試管，DEAB試劑加入對照管；ALDEFLUOR?試劑加入測試管后混合，立即吸取0.5 mL混合物至對照管。室溫孵育30 min，離心去上清，ALDEFLUOR?緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.2.6體外微球體培養細胞消化離心后采用微球培養基（DMEM/F12培養基中含10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、5 μg/mL胰島素和0.40% BSA）重懸，將細胞懸液接種于非黏附6孔板，計數10個視野（×100）的初始細胞數。10天后計數30個視野（×100）中直徑＞80 μm微球體數?；谧畛踅臃N量，計算微球體形成率。

1.2.7細胞劃痕實驗將2×105個/mL細胞接種于6孔板，細胞懸液體積為3 mL，待培養至90%融合度，用10 μL移液槍頭在細胞表面劃痕，PBS洗滌細胞，加入無血清培養基，并在倒置顯微鏡下觀察，記錄劃痕間初始距離。于37℃、5%CO2培養，每12h取樣，拍照。

1.2.8 Transwell侵襲實驗Matrigel于冰浴融化，使用PBS稀釋至1 mg/mL，鋪于Transwell小室濾膜上，37℃放置使Matrigel聚合成凝膠。在24孔板內加入含10%FBS培養基500 μL，在小室內加入細胞2×104個/孔，細胞懸液體積為200 μL。待培養48 h后，取出Transwell小室，擦去未穿過膜的細胞，95%乙醇固定10 min，結晶紫染色30 min，PBS洗滌，干燥后取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下觀察。隨機取每張濾膜中央和周圍各10個視野，計數每個視野內穿過膜的細胞數目，取平均值。

1.3統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。定量資料比較采用t檢驗，數據用x±s表示，重復測量資料均數比較采用一般線性模型進行分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1 CD4+CD25+Tregs誘導乳腺癌細胞EMT相關標志物表達改變

CD4+CD25+Tregs和乳腺癌細胞共培養72 h后，檢測乳腺癌細胞EMT相關標志物表達的改變。RT-PCR和Western blot結果顯示，與CD4+CD25+Tregs共培養后BT474細胞間質性標志物N-cadherin和Vi?mentin表達明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），上皮性標志物E-cadherin表達水平無顯著變化（圖1A、B）；而MCF-7細胞間質性標志物N-cad?herin和Fibronectin表達增高，上皮性標志物E-cad?herin表達降低，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖1C、D）。

2.2 CD4+CD25+Tregs誘導乳腺癌細胞遷移和侵襲能力變化

將BT474、MCF-7細胞和CD4+CD25+Tregs共培養后行細胞劃痕實驗以評價細胞的遷移能力。結果顯示BT474細胞在72 h（圖2A）、MCF-7細胞在48 h（圖2B），共培養組細胞遷移的距離明顯大于對照組。應用Transwell侵襲實驗比較CD4+CD25+Tregs對乳腺癌細胞侵襲能力的影響，48 h后共培養組的BT474和MCF-7細胞穿過微孔膜的數目多于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖3），結果顯示經CD4+CD25+Tregs處理后BT474和MCF-7細胞的侵襲能力增強。

?A.The mRNA expression in BT474 cells;B.The protein expression in BT474 cells;C.The mRNA expression in MCF-7 cells;D.The protein expression in MCF-7 cells圖1 CD4+CD25+Tregs誘導乳腺癌細胞EMT相關標志物基因和蛋白表達改變Figure 1　 mRNA and protein expression of EMT-related markers in breast cancer cells was detected after induction of CD4+CD25+Tregs

A.BT474 cells;B.MCF-7 cells圖2 CD4+CD25+Tregs對乳腺癌細胞遷移能力的影響Figure 2 Migratory ability of breast cancer cells was detected after induction of CD4+CD25+Tregs

2.3 CD4+CD25+Tregs誘導BT474細胞中ALDH1+干樣細胞比例改變

流式細胞儀檢測CD4+CD25+Tregs誘導后BT474細胞中ALDH1+干樣細胞比例。結果顯示，BT474細胞中ALDH1+干樣細胞比例在對照組和共培養組分別為45.37%±1.031%和73.73%±1.071%，共培養組ALDH1+干樣細胞比例高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖4A、B）。RT-PCR結果顯示，共培養后BT474細胞中ALDH1基因表達水平較對照組明顯上升，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖4C）。進一步采用Western blot檢測ALDH1蛋白水平的改變，結果同樣提示ALDH1蛋白表達上調（圖4D）。

A-C.BT474 cells;D-F.MCF-7 cells圖3 CD4+CD25+Tregs對乳腺癌細胞侵襲能力的影響Figure 3 Invasive ability of breast cancer cells was detected after induction of CD4+CD25+Tregs

A,B.Flow cytometry;C.RT-PCR;D.Western blot圖4 CD4+CD25+Tregs對BT474細胞中ALDH1+干樣細胞比例的影響Figure 4 Percentage of ALDH1+CSC-like cells in BT474 cells was detected after induction of CD4+CD25+Tregs.

2.4 CD4+CD25+Tregs誘導BT474細胞體外微球體形成能力變化

BT474細胞接種于低黏附培養板的DMEM/F12微球體培養基中，懸浮培養10天后計算微球體形成率。結果顯示對照組BT474細胞微球體形成率為1.17%±0.27%，共培養組微球形成率增加至2.04%± 0.18%，此為第一代（G1）。將懸浮培養體系中的BT474細胞收集，進一步觀察細胞的自我更新能力，胰酶消化為單細胞懸液，再次接種到低黏附孔板中進行連續傳代微球體培養，共計3代。共培養組微球體形成率高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖5）。

A.Representative images of tumor mammospheres;B.The self-renewal capacity of mammospheres圖5 BT474細胞體外微球形成率變化Figure 5　 Self-renewal capacity of mammospheres was detected in BT474 cells

3　討論

CD4+CD25+Tregs通過多種機制抑制機體的免疫反應，是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一［6］。研究發現乳腺癌組織中浸潤性Tregs數量高于癌旁組織［7］，Tregs在腫瘤聚集除了發揮免疫抑制作用外，是否對腫瘤細胞具有直接的作用目前尚缺乏研究。本研究主要探討了CD4+CD25+Tregs在免疫效應細胞和抗原遞呈細胞缺乏時誘導乳腺癌細胞EMT和ALDH1+干樣細胞增加。

EMT是指上皮細胞在形態學上發生向間質細胞表型轉變并獲得遷移能力的過程［8］。在EMT過程中伴隨著一系列分子標志物表達的改變，主要是上皮性蛋白表達下調和間質性細胞骨架結構的改變［9］。EMT按照其發生的特定生物學環境分為3種亞型，其中第3種亞型與上皮細胞性惡性腫瘤相關。原發性上皮性惡性腫瘤細胞通過EMT形成具有遷移能力的間質樣細胞，并隨血流遷移至不同部位，再通過EMT的逆向過程即間質上皮轉化，形成與原發腫瘤相似的上皮性轉移病灶［10］。發生EMT的腫瘤細胞并不完全喪失上皮性表型，在獲得間質表型的同時仍然保持一定的上皮細胞特性［11］。有研究發現，上皮細胞生長因子誘導人乳頭瘤病毒（HPV）陽性的頭頸鱗癌細胞高表達Vimentin，但不抑制E-cadherin的表達［12］。本研究顯示，Tregs誘導BT474細胞間質性標志物N-cadherin和Vimentin表達明顯上升，但上皮性標志物E-cadherin的表達無明顯變化，不完全喪失上皮性表型；而Tregs誘導MCF-7細胞間質性標志物N-cad?herin和Fibronectin高表達，上皮性標志物E-cadherin表達降低。另外，發生EMT的細胞同時伴隨著遷移和侵襲能力增強，本研究通過細胞劃痕、Transwell侵襲實驗證實了發生EMT的BT474和MCF-7細胞的遷移和侵襲能力均有提高。

CSCs是一群具有自我更新、多向分化潛能以及腫瘤形成能力的細胞。CSCs對常規放化療和免疫治療等不敏感，是腫瘤治療失敗和復發、轉移的根源［13］。EMT和CSCs是兩個緊密聯系的過程，EMT過程可以促進腫瘤細胞干性的產生。頭頸部鱗癌細胞過表達EMT相關轉錄因子Snail后發生EMT，并獲得間質性表型，同時ALDH1+干樣細胞比例增加，并具有化療抗性［14］。本研究中，Tregs可誘導BT474細胞獲得ALDH1+干樣細胞表型，另外在非黏附狀態下連續數代形成微球體的能力與干細胞的自我更新能力相關，與Tregs共培養后的BT474細胞的微球形成能力增強，與ALDH1+干樣細胞的流式細胞儀檢測結果相符，并且在連續3代的傳代培養中依然保持了較高的微球形成能力。以上結果說明Tregs可以直接作用于腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞獲得ALDH1+干樣細胞表型和特征。

免疫細胞分泌的細胞因子如轉化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）被認為是腫瘤侵襲和轉移中主要的EMT調控者之一［11］。Tregs是腫瘤微環境中TGF-β主要來源之一，TGF-β也是Tregs發揮作用的重要機制之一［15］。TGF-β信號通道的活化使永生化人乳腺上皮細胞發生EMT，同時獲得干細胞的表型和特征。本研究推測Tregs可能通過TGF-β信號通路誘導腫瘤細胞發生EMT及干樣細胞增加，而誘導后腫瘤干細胞的更多生物學特征以及Tregs誘導腫瘤細胞發生EMT及干樣細胞增加的分子機制尚有待研究。

綜上所述，本研究提示Tregs細胞除發揮免疫抑制作用外，還能直接促進腫瘤細胞發生EMT，同時促進腫瘤細胞獲得干樣細胞的表型和特征。腫瘤細胞一方面由于發生EMT更具有侵襲性，另一方面由于干細胞特性的增加使腫瘤細胞對免疫監視和放化療不敏感，同時干細胞的自我更新能力增加形成轉移病灶的概率，兩方面相輔相成促進腫瘤的進展和轉移。闡明Tregs誘導腫瘤細胞EMT和干樣特征的關鍵機制，有助于為臨床提供一個新的治療靶點。

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（2015-11-17收稿）

（2016-02-17修回）

（編輯：張亻抿校對：武斌）

孫立平專業方向為腫瘤免疫研究。E-mail：sunliping3344@163.com

·臨床研究與應用·

作者簡介

通信作者：李慧lihui@tjmuch.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.05.277

作者單位：①天津醫科大學腫瘤醫院免疫室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）；②南通大學附屬醫院腫瘤化療科；③天津醫科大學腫瘤醫院胃腸腫瘤生物學研究室