肺癌患者外周血T-淋巴細胞亞群NK細胞的基線數值及其與預后的關系*

李月雅張翠翠魏熙胤王心悅李凱

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肺癌患者外周血T-淋巴細胞亞群NK細胞的基線數值及其與預后的關系*

李月雅①張翠翠①魏熙胤②王心悅①李凱①

摘要目的：對比肺癌患者與健康者之間淋巴細胞亞群差異，評估肺癌患者外周血T淋巴細胞亞群及自然殺傷細胞（NK）之基線值與預后的關系。方法：收集2006年2月至2013年3月就診于天津醫科大學腫瘤醫院病例資料完整的肺癌患者105例，其中非小細胞肺癌（NSCLC）86例、小細胞肺癌（SCLC）19例，另選健康對照35例，對比接受治療前肺癌患者和健康對照者外周血中的CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及NK細胞所占百分比，并回顧性分析86例NSCLC患者初治時外周血淋巴細胞亞群與預后的關系。結果：肺癌患者外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞及CD4/CD8比值均明顯低于健康對照組（P=0.011，P=0.007，P＜0.001，P=0.025），而CD8+T細胞比例高于健康對照組（P=0.013）。當CD8+T≥31.8%及CD4/CD8＜1.28時NSCLC患者可以獲得一個更長的OS（中位OS分別為36.2 m vs.20.0 m，P=0.010；30.8 m vs.20.0 m，P=0.035）。而CD3+T細胞、CD4+T細胞及NK細胞百分比對NSCLC患者預后無顯著影響。結論：外周血CD8+T細胞基線水平較高的NSCLC患者生存較長，此基線水平可能對NSCLC患者預后有指示作用。

關鍵詞肺癌非小細胞肺癌淋巴細胞亞群NK細胞CD4+T細胞CD8+T細胞CD4/CD8比值

*本文課題受國家科技重大專項（編號：2013ZX09303001）、天津市科委抗癌重大專項攻關計劃（編號：12ZCDZSY15600）和CSCO研究基金項目（編號：Y-S2014-011）資助

Base amount of blood T-lymphocyte subsets and NK cells in patients with lung cancer and its value in predicting prognosis

Yueya LI1,Cuicui ZHANG1,Xiyin WEI2,Xinyue WANG1,Kai LI1
Correspondence to:Kai LI;E-mail:likai5@medmail.com.cn
1Departments of Thoracic Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Lung Cancer Diagnosis and Treatment Centre,Tianjin 300060,China;2Department of Public Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China
This study was supported by the National Science and Technology Major Project(No.2013ZX09303001),Tianjin Municipal Science and Technology Project(No.12ZCDZSY15600),and Chinese Society of Clinical Oncology(CSCO)Research Fund Project(No.Y-S2014-011)

Abstract Objective:To predict survival outcome,the lymphocyte subsets between lung cancer patients and healthy subjects was compared,and the significance of T-lymphocyte subgroups and NK cell base amount in the peripheral blood of lung cancer patients was evaluated.Methods:The percentage of CD3+T,CD4+T,CD8+T,and natural killer(NK)cells in the peripheral blood of 105 patients with lung cancer and 35 healthy subjects were analyzed by flow cytometry.Among the 105 patients,19 cases were small cell lung cancer(SCLC)and 86 cases were non-small cell lung cancer(NSCLC).The lymphocyte levels of the subgroups were recorded,and the relationship between lymphocyte subsets of 86 NSCLC patients and survival outcome was analyzed retrospectively.Results:The levels of CD3+,CD4+,NK cells and the ratio of CD4/CD8 in patients have respective P values of 0.011,0.007,＜0.001,0.025,which were significantly lower than that in normal subjects.However,the proportion of CD8+increased remarkably in patients(P=0.013).The overall survival(OS)was more longer when CD8+T were≥31.8% of NSCLC patients,and the ratio of CD4/CD8 were less than 1.28 of NSCLC patients(mean OS 36.2 m vs.20.0 m,P=0.010;30.8 m vs.20.0 m,P=0.035,respectively).However,the percentage of CD3+,CD4+,and NK cells had an insignificant effect in predicting the prognosis of NSCLC patients.Conclusion:High basal levels of CD8+T cells in peripheral blood could prolong the survival of patients with NSCLC.Furthermore,evaluating the basal levels of CD8+T cells by flow cytometry in peripheral blood might provide prognostic information.

Keywords:lung cancer,non-small cell lung cancer,lymphocyte subsets,NK cells,CD4-positive T-lymphocyte,CD8-positive T-lymphocyte,CD4-CD8 ratios

肺癌包括小細胞肺癌（SCLC）及非小細胞肺癌（NSCLC），以NSCLC為主（約85%）。近年研究表明，肺癌的發生、發展與免疫功能紊亂，尤其與T淋巴細胞亞群功能的紊亂息息相關［1］。T淋巴細胞主要包括CD4+T細胞及CD8+T細胞，在維持免疫系統平衡及發揮免疫功能中起重要作用。有報道證實肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與健康對照相比存在紊亂［2］，而關于肺癌患者淋巴細胞亞群分布基線水平與預后關系研究卻鮮有報道。本研究采用流式細胞術檢測首診肺癌患者外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK細胞百分比及CD4/CD8比值，并以健康成年人為對照，結合臨床病理及隨訪資料進行分析。旨在闡明淋巴細胞亞群分布基線水平及其與肺癌患者預后的關系。

1材料與方法

1.1材料

選取2006年2月至2013年3月就診于天津醫科大學腫瘤醫院病例資料完整的患者105例，均經病理學確診為肺癌。血液檢驗前均未行放療、化療或手術治療，并除外有嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病及近期大劑量使用免疫抑制劑者?；颊吣挲g41～81歲，中位年齡60歲；男性70例，女性35例；小細胞肺癌19例，非小細胞肺癌86例。非小細胞肺癌TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期10例，Ⅲ期22例，Ⅳ期40例。35例健康成年人作為對照組，均配對選自醫院體檢健康人群，年齡、性別分布與檢測組無差異。對全部患者電話隨訪，截止日期為2015年6月27日，總生存期（OS）定義為確診之日至患者死亡時間或最后一次隨訪時間。經醫院倫理委員會批準，受試者或（和）其家屬均知情本研究內容并簽署知情同意書。

1.2方法

采用EPIC-XL型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司），對肺癌患者及健康體檢者外周血中T細胞亞群及NK進行檢測。小鼠抗人CD3/FITC、CD16+56/PE雙標單克隆抗體和CD4/FITC、CD8/PE雙標單克隆抗體及同型對照均購自美國貝克曼庫爾特公司。

用EDTA-K2抗凝采血管采集受試者晨起空腹靜脈血2 mL，室溫放置。分別取100 μL抗凝外周血加入3個標記為1、2、3號的流式管內，于1號管內加入20 μL同型對照，2、3號管內均加入CD4/FITC、CD8/PE雙標抗體和CD3/FITC、CD16+56/PE雙標抗體各20 μL，室溫避光孵育20 min；隨后分別加入500 μL紅細胞裂解液（美國貝克曼庫爾特公司），室溫避光15 min后各管均加入PBS緩沖液清洗3遍，1 500 rpm/min、5 min離心。最后，各管分別加入500 μL PBS緩沖液重懸，用流式細胞儀檢測各部分細胞比例。CD3+T細胞定義為總T淋巴細胞，CD8+T細胞為CD3+CD8+T淋巴細胞，CD4+T細胞指CD3+、CD4+T淋巴細胞、CD3-、CD16+、CD56+T細胞定義為NK細胞。

所有入選患者后續均接受單純化療或化療+放療治療。Ⅰ期患者14例，其中7例術后接受輔助化療4個周期，其余7例為復發后進行化療，復發時間為19～45個月。Ⅱ～ⅢA期患者20例均接受了標準術后4個周期輔助化療，ⅢB～Ⅳ期患者52例均接受了標準化療?；煼桨妇鶠榉螻CCN指南標準的含鉑雙藥方案（包括紫杉醇+鉑類、吉西他濱+鉑類、長春瑞濱+鉑類、培美曲塞+鉑類等）；28例患者化療至腫瘤穩定后接受胸部立體定向放療，劑量為50 Gy/25次或60 Gy/30次。

1.3統計學方法

應用SPSS19.0軟件進行統計學分析，檢測數據用x±s表示。計數資料采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。單因素生存分析采用Kaplan-Meier法分析，并進行Log-rank顯著性檢驗。單因素生存分析結果采用Cox回歸模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1肺癌患者外周血淋巴細胞亞群分布比較

與健康對照組相比，肺癌患者外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞比例均較健康對照組下降，差異具有統計學意義（P=0.011，P=0.007，P＜0.001）；而CD8+T細胞百分比較對照組升高，差異具有統計學意義（P=0.013）；CD4/CD8較對照組亦有明顯下降（P=0.025）。分層分析發現，NSCLC患者CD4+T細胞比例及CD4/CD8比值與健康對照組比較差異具有統計學意義（P=0.021，P=0.047），SCLC僅CD4/CD8比值與對照給比較差異具有統計學意義（P=0.048，表1）。

2.2 NSCLC患者淋巴細胞亞群與臨床、病理特征間的關系

由表1提示NSCLC患者可能存在更明顯的免疫功能紊亂，因此對其基線淋巴細胞亞群及病理特征進一步分析，結果顯示男性患者CD3+T細胞比例高于女性（P=0.007），吸煙患者NK細胞比例高于不吸煙者（P=0.041）；而不同年齡、病理類型、TNM分期及有無淋巴結轉移或遠處轉移患者的淋巴細胞亞群間差異均無統計學意義（表2）。

表1　不同病理類型肺癌及對照組外周血淋巴細胞亞群分布情況Table 1 Distribution of peripheral blood lymphocyte subsets in different pathological types of lung cancer and control group

表2　NSCLC患者淋巴細胞亞群比例與臨床病理特征的關系Table 2 The relationship between the proportion of lymphocyte subsets and clinical pathological characteristics in NSCLC patients

2.3淋巴細胞亞群比例與NSCLC預后

2.3.1 NSCLC患者Kaplan-Meier單因素生存分析對各種因素進行Kaplan-Meier單因素生存分析，結果顯示確診時無淋巴結（48.1 m vs.20.4 m，P=0.001）及遠處轉移（38.9 m vs.17.1 m,P=0.001）、Ⅰ～ⅢA期(47.7 m vs.18.5m,P＜0.001)、接受手術、CD8+T細胞≥31.8%（36.2mvs.20.0 m，P=0.010，圖1）及CD4/CD8比值＜1.28（30.8 m vs.20.0 m，P=0.035，圖2）者可以獲得更長的OS，但CD3+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞比例，以及性別、年齡、是否吸煙、病理類型及除手術治療外的后續放、化療對患者OS的影響均無顯著意義（表3）。

圖1　CD8+T比例與NSCLC患者預后Figure 1　 Relationship between the percentage of CD8+T and the prognosis of NSCLC patients

圖2　CD4/CD8比值與NSCLC患者預后Figure 2 Relationship between the ratio of CD4/CD8 and the prognosis of NSCLC patients

表3　NSCLC患者的Kaplan-Meier單因素生存分析Table 3 The Kaplan-Meier univariate survival analysis of NSCLC patients

2.3.2 NSCLC患者Cox多因素生存分析將有無淋巴結轉移及遠處轉移、TNM分期、是否手術、CD8+T細胞比例及CD4/CD8比值等Kaplan-Meier單因素生存分析所得結果輸入Cox比例回歸風險模型進行多因素生存分析，結果顯示TNM分期及CD8+T細胞比例為影響NSCLC患者預后的獨立影響因素（HR=2.544、P＜0.001，HR=1.932、P=0.009）。

表3　NSCLC患者的Kaplan-Meier單因素生存分析（續表3）Table 3 The Kaplan-Meier univariate survival analysis of NSCLC patients

3　討論

隨著對免疫機制的深入研究，學者們發現肺癌的發生、發展與機體的免疫功能密切相關［3-5］。目前T淋巴細胞亞群及NK細胞已被廣泛用于監測腫瘤的發展以及判斷療效和預后［6-7］。本研究采用流式細胞術檢測尚未接受手術、化放療及靶向藥物治療等，肺癌患者治療前外周血淋巴細胞亞群分布之基線情況并與健康者對比，旨在闡明治療前肺癌患者外周血淋巴細胞亞群分布的差異情況，并分析其與預后的關系。

3.1肺癌患者淋巴細胞亞群分布紊亂

CD3+T細胞代表總T淋巴細胞、反應宿主的細胞免疫的整體狀態。CD4+T細胞主要為輔助性淋巴細胞，可分泌IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等免疫抑制因子，發揮抑制腫瘤生長及轉移的功能。本研究發現肺癌患者CD3+T細胞、CD4+T細胞比例均較對照組下降（P=0.011、0.007），與熊佳時等［8］報道一致。Gane?san等［9］認為肺癌患者在多重抑制因素的作用下機體處于免疫抑制狀態，這些抑制性因素可抑制CD4+T細胞的分化和成熟。因此，認為肺癌患者存在CD3+T細胞及CD4+T細胞枯竭的免疫功能低下狀態。

CD8+T細胞受MHC-I類分子限制，可主要分化為細胞毒性T細胞（CTL）、直接殺傷腫瘤細胞。本研究中患者CD8+T細胞比例明顯高于對照組、與熊佳時等［8］的報道一致，這可能意味著肺癌患者的免疫系統可能反應性地產生出更多的殺傷性淋巴細胞（CTL）。而羅君等［10］卻發現患者外周血CD8+T細胞比例下降，并認為可歸咎于肺癌患者CD8+T細胞表面特異性受體結構發生改變，使得效應T細胞無法正確識別并與靶點結合，反饋性造成CD8+T細胞比例下降，導致腫瘤細胞免疫逃逸?？傊?，CD8+T細胞比例變化情況較復雜，各家報道中尚無統一觀點，需待進一步深入研究。而CD4+T細胞比例降低、CD8+T比例升高導致了本研究中CD4/CD8比值降低。

NK細胞無MHC限制性，不需要抗原致敏和抗體參與，可直接殺死腫瘤細胞，其降低意味著機體的非特異性免疫功能減弱。本研究顯示肺癌患者NK細胞水平低于健康對照組，表明患者存在免疫功能受損，與魏熙胤等［2］的報道一致。

3.2 NSCLC患者淋巴細胞亞群與臨床病理特征

本組中不同年齡、是否淋巴結及遠處轉移、不同病理類型和TNM分期患者間CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞等淋巴細胞亞群均無顯著性差異，這與熊佳時等［8］報道不符。結果顯示Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者CD3+T細胞、CD4+T細胞及NK細胞比例明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，而CD8+T細胞的比例高于Ⅰ～Ⅱ期患者，可能與本研究的病例樣本量小、Ⅰ～Ⅱ期患者所占比例少有關。本研究中女性患者CD3+T細胞比例低于男性患者、吸煙患者NK細胞比例高于不吸煙患者，與魏熙胤等［2］的報道不符。結果顯示性別、是否吸煙與淋巴亞群分布無顯著性差異，可能與本研究納入病例均為初診患者，而其研究納入患者并非全部為初診有關，但原因尚待進一步深入研究。

3.3 T淋巴細胞變化可能與NSCLC患者預后相關

CD3抗原是成熟T淋巴細胞的特異性抗原，Ra?thore等［11］在多項研究基礎上總結發現，CD3+T細胞高表達的口咽癌患者預后佳，而CD3+T細胞低水平的結腸癌及宮頸癌患者預后差。本研究卻發現NSCLC患者外周血CD3+T細胞百分比與預后無關（25.9 m vs.27.0 m，P=0.428），可能是由于樣本量小、且標本為外周血，不能完全等同于組織標本。NK細胞屬于快速效應細胞、可以早期高效消滅腫瘤細胞，但本研究顯示NK細胞對預后無顯著影響（20.0 m vs.29.2 m，P= 0.229），這可能緣于本研究中患者的NK細胞比例更接近健康對照組產生的偏倚。

Hald等［12］發現，腫瘤組織基質內CD4/CD8下降是導致NSCLC患者不良預后的獨立影響因素，Zhang等［13］亦發現NSCLC患者的CD4/CD8比值越低、轉移復發率越高。本研究卻發現當CD4/CD8＜1.28時NSCLC患者OS得以延長（30.8 m vs.20.0 m，P= 0.035），這可能因為CD4/CD8的降低系因CD4+T細胞比例下降及CD8+T細胞比例升高的共同作用。那么上述OS延長到底因何造成，Rathore等［11］研究發現乳腺癌組織內高表達CD4+T細胞患者預后佳、低表達患者預后差；而燕翔等［14］Meta分析卻發現CD4+T細胞表達水平與NSCLC患者OS、DFS均無關。在本研究中亦發現NSCLC患者外周血CD4+T細胞表達水平應與預后無關（25.8 m vs.27.0 m，P=0.992）。因此，推測CD4+T細胞水平降低可能不是延長患者生存的主要因素。新近研究表明，CD8+T細胞并非均一細胞群，根據其細胞表面CD28抗原表達可再分為CD8+CD28-T細胞（抑制性T細胞，Ts）和CD8+CD28+T細胞（活化細胞毒性T細胞，CTL）。CD8+CD28-T細胞具有免疫抑制功能，可抑制CTL細胞毒活性、并抑制T細胞增殖［15］。CD8+CD28+T細胞是獲得性免疫的主要效應細胞之一，在抗腫瘤免疫中發揮著重要作用［16］。有研究發現CD8+T細胞顯著增高時，其識別和殺傷腫瘤細胞功能反被削弱，這是因為此時CD8+T細胞比例增加主要是Ts增加所致，而Ts長期升高進一步可使CTL消耗性減少，最終導致機體免疫系統對新出現的腫瘤細胞無應答［17］。Rathore等［11］卻發現基質內浸潤的CD8+T淋巴細胞可抑制腫瘤的生長，其高表達可以為乳腺癌患者帶來明顯的生存受益；Wahlin等［18］采用流式細胞術對淋巴結內CD8+T細胞進行檢測，也發現淋巴結內CD8+T細胞高表達時患者預后更好。同樣，本研究亦發現CD8+T細胞比例是NSCLC患者良好預后的獨立影響因素，CD8+T細胞≥31.8%的患者OS更長。這些提示CD8+T細胞可能對OS有更大影響、其升高可能提示延長的OS。本研究中NSCLC患者外周血中升高的CD8+T細胞可能反映出患者對腫瘤的免疫反應，且其升高部分可能主要為能夠抑制腫瘤增長的CD8+CD28+T細胞CTL亞群。故初診時應同時檢測NCSLC患者CD8+T細胞比例及其亞群分布情況，以幫助闡明CD8+T細胞及其亞群基線情況與預后的關系，為判斷患者預后提供幫助。

綜上所述，外周血CD8+T細胞基線水平升高可提示NSCLC患者的較長生存，這可能由于CD8+T細胞的抑癌亞群在其中占主導地位，利用流式細胞術檢測外周血CD8+T細胞基線水平及其亞群分布可能對NSCLC患者預后有提示作用。而本研究僅為小樣本量的回顧性分析，其結果值得以大樣本量的前瞻性臨床試驗驗證。另外，本研究提示除手術治療外的后續放、化療對患者OS的影響均無顯著性差異，可能與入組例數較少，且其中晚期患者達60.46%（52/86）有關。

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（2015-12-03收稿）

（2016-02-12修回）

（編輯：楊紅欣校對：張亻抿）

李月雅專業方向為肺部腫瘤的內科診治。E-mail：yueyalee@163.com

·讀者·作者·編者·

作者簡介

通信作者：李凱likai5@medmail.com.cn

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.05.360

作者單位：①天津醫科大學腫瘤醫院肺部腫瘤內科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市肺癌診治中心（天津市300060）；②腫瘤研究所公共實驗室