外泌體傳輸microRNA在腫瘤研究中的進展*

劉銳　綜述　巴一　審校

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外泌體傳輸microRNA在腫瘤研究中的進展*

劉銳綜述巴一審校

摘要外泌體是一類可以在細胞間傳遞直徑為30～100 nm的內吞衍生囊泡，可包含與其來源和功能相關的蛋白質和RNA等物質。外泌體作為一種天然的載體，已被視為一種新型的藥物傳輸系統用于腫瘤的治療。microRNA（miRNA）是一類新型的RNA調控基因，不僅僅存在于細胞內，亦存在于細胞外，這些細胞外miRNA可作為分泌型信號分子影響受體細胞表型，并一定程度上反映出供體細胞內的分子改變，具有一定的診斷及潛在的治療用途。腫瘤患者血液中外泌體高于正常人，并能夠包裹腫瘤相關miRNA行使生物學功能，因此機體通過外泌體傳輸特異性miRNA可能在腫瘤的發病過程中扮演著重要的角色。本文將對外泌體作為miRNA的傳輸載體在腫瘤發生發展以及腫瘤治療等方面的研究進行綜述。

關鍵詞microRNA外泌體診斷標志物腫瘤

作者單位：天津醫科大學腫瘤醫院消化腫瘤內科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81201946）資助

外泌體是產生自人體自身直徑為30～100 nm的囊泡，大部分的細胞系均可釋放，幾乎存在于所有的體液中。其可以在相鄰細胞或遠端細胞間運載生物活性分子（如蛋白，脂類及核酸），且攜帶的分子能夠引起受體細胞的信號反應，介導細胞間的物質交換。因此，外泌體被認為是微環境的信號分子，能夠運輸功能性RNA，包括外源性的siRNA到受體細胞中，調節目的基因表達，從而治療某些疾病。目前外泌體對miRNA的傳輸及其在細胞間的通訊作用越來越受到研究者們的關注，且其在腫瘤的診斷和治療中具有一定臨床意義。本文將綜述外泌體傳輸miR?NA在腫瘤發生發展中的生物作用，并探討其作為腫瘤診斷標志物及用于臨床治療等方面的價值。

1　外泌體對細胞外miRNA的傳輸及其生物學意義

miRNA是長約22 nt的自然存在、不編碼的RNA。成熟的miRNA由前體miRNA轉錄形成，其一般為幾千個核苷酸組成。大量的細胞外miRNA存在于包括血清、血漿、尿液、乳汁等體液之中。后續研究發現，這些細胞外miRNA表達量的改變與包括腫瘤在內的很多疾病相關［1-2］。盡管細胞外存在高濃度的RNA酶，細胞外miRNA在體液中仍具有較高濃度和結構的完整性，這一現象表明細胞外miRNA可能被包裹在某種特殊的結構中從而防止被酶消化。加入血漿中的無包裹miRNA會立即被消化，而循環中的miRNA在相同條件下的數小時內是穩定且受保護的，可抵抗環境的改變如極端溫度、極端酸堿度及反復的凍融［3-4］。

2013年美國和德國科學家發現了細胞囊泡運輸調節機制，并由此榮獲諾貝爾獎。外泌體（exosomes）作為人體內一類重要的囊泡，其生物學功能受到越來越多的關注，有研究報道細胞釋放的miRNA主要包裹于小囊泡中（如外泌體、脫落的囊泡和凋亡小體）作為分泌分子影響受體細胞表型［5-6］，或通過結合到特定細胞的表面受體從而對靶細胞進行調控［7-8］。功能性的miRNA也通過該機制進行運輸調控。有研究發現健康受試者血漿中外泌體包裹的miRNA的表達水平與外周血單核細胞相比存在顯著性差異［9-10］，推測血漿外泌體中的miRNA可能是造血的重要調節因子。在體外研究中現從胚胎干細胞來源的外泌體可運輸miRNA到小鼠胚胎成纖維細胞中行使功能［11］。另一項研究中發現，人骨髓間充質干細胞釋放的外泌體包含的miRNA可通過與受體細胞的結合釋放到受體細胞中行使功能［12］。有研究觀察到外泌體包裹著miRNA釋放到細胞外通過與相應靶蛋白的作用可抑制脂肪細胞的沉積［8］。還有研究報道絨毛滋養細胞產生的胎盤相關miRNA通過外泌體分泌進入產婦的循環系統，并證明胎盤相關的miRNA可在母體的NK細胞中與靶基因相互作用，從而揭示一種新的母體與胎盤之間信息傳遞的方式［13］。同樣也有研究報道THP-1細胞來源的微囊泡包裹著大量的miR-150輸送到人微血管內皮細胞（human microvascular endo?thelial cells，HMEC-1），導致血管內皮細胞的miR-150水平升高，并觀察到了其與c-myb之間的靶向調控作用，促進了細胞的增殖［14］。該研究結果表明miRNA在單核細胞和血管內皮細胞之間通訊可能與心血管系統疾病發展相關。

以上研究結果所示，外泌體不僅特異性靶向于受體細胞改變其蛋白質、基因等表達，而且還通過運輸miRNA參與信號傳導。該過程主要是miRNA首先包裹在細胞內的外泌體中，然后進入循環系統，與細胞受體結合，作為內源miRNA行使生物學功能（圖1）。由于miRNA廣泛地靶向于mRNA，這種由外泌體介導的miRNA通訊在細胞間的生物信息傳遞中起著非常廣泛的作用。miRNA的外泌體轉移途徑有助于局部與系統間的細胞內信息轉移，但又有別于細胞接觸或細胞因子等方式。

2　外泌體miRNA在腫瘤中的關聯研究

腫瘤微環境在腫瘤發展過程中起著重要的作用，腫瘤細胞會影響正常細胞的穩態而出現腫瘤特性。腫瘤細胞和正常細胞在微環境中的動態交互過程是疾病進展的關鍵。這種交互作用可能通過分泌的小分子信號完成［15］，這類分泌型小分子已不再局限于細胞因子、趨化因子、生長因子或一些蛋白分子，外泌體包裹的分泌型miRNA亦在其中［16］。有研究證實外泌體小RNA參與了腫瘤發生、轉移、免疫逃逸以及微環境的形成，與腫瘤的發生發展息息相關，可以作為新的腫瘤生物標志物。腫瘤分泌的miR-214，通過外泌體運輸到受體細胞CD4+T細胞中，下調PTEN表達，最終影響調節性T細胞的功能，引起宿主免疫逃逸以及腫瘤的快速增長。近年來人們已經認識到腫瘤細胞能夠操控宿主的免疫功能，機體能夠通過外泌體將腫瘤特異性的miRNA運輸到免疫細胞，使腫瘤發生免疫逃逸，為腫瘤免疫檢查點治療［17］提供了新的思路。

圖1　外泌體在細胞間傳輸miRNA示意圖Figure 1 Schematic of exosomal transmission of miRNAs

有研究發現人膠質瘤細胞分泌的外泌體富集mRNA和miRNA，并可作用于HMEC-1行使功能［18］，說明腫瘤細胞產生的外泌體可以通過改變轉錄后表達從而影響周圍正常細胞的功能，同樣膠質瘤患者的腦脊液中可以檢測到膠質瘤特異性miR-21，且其表達水平與腦室轉移、腫瘤分級及預后相關［19］。另有研究發現黑色素瘤細胞通過外泌體的包裹方式釋放包括miR-214-3p、miR-199a-3p和miR-155-5p在內的小分子進入腫瘤微環境進行信息通訊，調控黑色素瘤的發展［20］。用間充質干細胞外泌體將antimiR-9分子導入膠質母細胞瘤細胞中，實現了逆轉其對替莫唑胺的耐藥性［21］。Ohno等［22］采用基因工程技術在外泌體包膜上表達表皮生長因子受體（epider?mal growth factor receptor，EGFR）結合片段GE11，從而將let-7a特異性導入EGFR表達乳腺癌細胞中，進一步的體內研究也證實包含let-7的GE11外泌體可在體內顯著抑制EGFR陽性乳腺癌細胞的生長。故腫瘤細胞能夠通過外泌體轉運miRNA到周圍的細胞，促進腫瘤的生長及發展。

3　外泌體傳輸miRNA在腫瘤診斷和治療中的應用

分泌型miRNA可在生物體液中被檢測出來，并能反映出生物體的生理病理狀態，因此具有潛在的診斷和預后標志物的特征。有研究證實其可用于疾病診斷和預后判斷，在患者血清中檢測病毒分泌的miRNA可判斷疾病預后［23］，具有膠質瘤、胰腺癌、胃癌等特征的miRNA能在相應患者的血清中檢出［24-26］，這些研究都證明了腫瘤分泌的miRNA能夠提供診斷信息，從而協助治療。有研究發現在肺癌患者中其總外泌體數量較對照組增多，且其中所包含的miR?NA與其相應的肺癌組織相似［27］。另有研究證實卵巢癌患者中的外泌體水平較良性疾病患者明顯升高，而且其水平與腫瘤分期相關，可用于卵巢癌的早期診斷［28］。M.D.安德森癌癥中心也在Nature雜志發表了外泌體作為胰腺癌生物標志物的研究成果，除DNA和全細胞之外，腫瘤細胞脫落的外泌體也可作為替代的癌癥生物標志物，其攜帶的DNA、RNA和蛋白質可以用來成功區分患者胰腺癌早期、晚期與良性胰腺疾病或健康受試者［29］。

近年來國外研究證實，原癌基因特性miRNA的反義寡聚核苷酸-抗miRNA寡聚核苷酸，可有效地滅活腫瘤中的“壞的”miRNA，控制腫瘤生長［30-31］從而實現一定的治療作用。2015年Nature雜志發表了耶魯大學的研究成果，通過靶向輸送anti-miR至淋巴瘤的腫瘤微環境中，特異性抑制miR-155表達，從而起到抗腫瘤的作用［32］。用于丙肝治療的miR-122拮抗劑已經進入了Ⅱ期臨床試驗，用于不能手術的原發性肝癌和肝臟受累的轉移性癌癥的miRNA療法也有Ⅰ期臨床試驗在研。目前關于分泌型miRNA轉化性的多項研究已陸續開展，分泌型miRNA用于胰腺癌診斷標志物的研究成果也已完成臨床實驗。外泌體在miRNA運輸中的作用和意義已得到證實，進一步為分泌型miRNA真正應用于臨床腫瘤的診斷及治療等方面提供了一條重要的運輸途徑。

4　外泌體傳輸miRNA的優勢與不足

外泌體作為體內小分子的傳輸載體相對于傳統的運輸方式有其獨特的優勢。首先，外泌體來源于內源性細胞，是一種天然的載體，具有良好的免疫原性，從而具有高效和良好的免疫耐受性，用于生物體而不易引起毒性與免疫反應。其次，外泌體直徑僅30～100 nm，是一種可以避免被巨噬細胞吞噬的理想的運輸miRNA方式，能夠將抑癌miRNA或原癌miRNA反義序列特異性運輸至靶位點從而調控蛋白表達起到治療的作用，這種作用方式被稱為“exo?cure”［33］。故外泌體作為miRNA的運輸載體，具有一定的實際應用前景，有助于推動miRNA的基礎研究向臨床應用轉化。但將外泌體作為miRNA載體應用于臨床治療仍存在一些亟待解決的問題。首先如何大批量生產外泌體是制約其進一步應用的關鍵，目前尚無能夠大量生產外泌體的細胞，雖然無限增殖的干細胞可生產用于治療的外泌體，但這一技術仍然涉及到慢病毒且尚無人源細胞系可用于外泌體的分離，而異源細胞產生的外泌體存在組織相容性問題，安全性不能保證，同時受技術的限制導致外泌體的提取成本非常昂貴。其次，如何能使外泌體特異高效地結合于病灶部位是其真正走向臨床應用的另一問題，目前主要通過對外泌體表面蛋白的改造與具有靶向能力的肽段結合使其具有特異性組織結合能力，故外泌體進入體內針對不同組織的的靶向傳輸miRNA特性仍有待研究。

5　展望

目前，細胞外miRNA已經在各種生理病理條件下被檢測到，大量的miRNA可被同時釋放，同時調控多個靶點，從而激活一個復雜的網絡傳導，這些細胞外miRNA來自于細胞自身并穩定存在于外泌體中，被分泌到微環境中并與相應的受體細胞結合后作用于靶點mRNA改變蛋白表達行使生物功能，同時在多種腫瘤患者中發現了一定的表達規律，使其成為近年來新興的一類腫瘤生物標志物及治療靶點。隨著研究不斷深入，外泌體miRNA生物學功能將會進一步得到充實，外泌體介導的小RNA運輸系統目前正在被開發并嘗試運用到腫瘤的診斷與治療中。

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（2016-03-25收稿）

（2016-04-28修回）

（編輯：武斌校對：楊紅欣）

劉銳專業方向為消化系統腫瘤表觀遺傳學相關研究。E-mail：liurui9003@163.com

·綜述·

Progress on exosomal transmission of microRNAs in cancer research

Rui LIU，Yi BA

Department of Digestive Oncology Internal Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81201946）

Correspondence to：Yi BA；E-mail：bayi@tjmuch.com

AbstractExosomes are cell-derived vesicles that contain protein and RNA from the same source and function.The vesicle has a diameter between 30 and 100 nm.Exosomes are the natural carriers and have been recently used as drug delivery system for cancer treatment.MicroRNAs（miRNAs）function in RNA silencing and regulation of gene expression.They can exist as intracellular and extracellular miRNAs.Extracellular miRNAs can function as secreted signaling molecules that affect receptor cell phenotype.They can also reflect molecular changes in donor cells.Therefore，extracellular miRNAs can be potentially used for diagnosis and therapeutics.Studies show that the volume of exosomes in cancer patients' blood is higher than that in normal controls.The ability to package cancer-related miRNAs is a biological function of exosomes.In conclusion，specific miRNAs transferred by exosomes may play an important role in the pathogenesis of tumor or cancer.This paper presents a summary of research on exosomes as the carrier of miRNAs in the development and treatment of cancer.

Keywords：microRNA，exosomes，diagnosis，markers，tumor

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.10.336

通信作者：巴一bayi@tjmuch.com

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