茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠的保護作用研究*

陳新宇姜　玲　張世鷹　蔡虎志　文　凱　文　江（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 40007；.湖南中醫藥大學，湖南 長沙4008）

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·研究報告·

茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠的保護作用研究*

陳新宇1△姜玲2張世鷹2蔡虎志1文凱2文江2
（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

目的 研究經方茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對大鼠急性心肌缺血的抗氧化保護作用。方法 將成年健康清潔級雄性SD大鼠50只按隨機數字表法隨機分為正常對照組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組及西藥（予單硝酸異山梨酯片）組，各組分別采取相應處理并采用異丙腎上腺素造模后，觀察茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對急性心肌缺血大鼠心電圖、血清中肌酸激酶同工酶 （CK-MB）、乳酸脫氫酶 （LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的含量影響。結果 茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯高、低劑量組均可改善急性心肌缺血大鼠心電圖J點及T波下移變化（P＜0.05），高低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）；中藥高、低劑量組可不同程度降低LDH、CK-MB、MDA的含量，提高SOD和GSH-PX的活性（P＜0.05），且中藥高、低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血模型具有明顯的保護作用，高劑量組明顯優于低劑量組。

心肌缺血茯苓杏仁甘草湯橘枳姜湯抗氧化異丙腎上腺素

【Abstract】Objective：To explore the antioxidant protection of combined Fuling Xingren Gancao Tang and Juzhijiang Tang on acute myocardial ischemia rats.Methods：50 health clean male adult SD rats were randomly divided into five groups by random number table：the normal control group，acute myocardial ischemia model group，low dose Chinese traditional medicine group，high dose Chinese traditional medicine group and isoprenaline （Xinkang）group.Each group was respectively taken corresponding processing and using isoprenaline（ISO）model.The influence of combined Fuling Xingren Gancao Tang and Juzhijiang Tang on acute myocardial ischemia rats was explored，focused on electrocardiogram（ECG），serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），lactate dehydrogenase（LDH），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-PX）. Results：J and T wave changes of the electrocardiogram of the rats with acute myocardial ischemia was improved in high dose group and low dose group（P＜0.05）with no statistically significant difference between the two（P＞0.05）；the content of LDH，CK-MB and MDA in high dose group and low dose group reduced in different level，and the activity of SOD and GSH-PX increased（P＜0.05），and between high dose group and low dose group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Combined Fuling Xingren Gancao Tang and Juzhijiang Tang has obvious antioxidant protection on ISO induced myocardial ischemia rat model.

【Key words】Myocardial ischemia；Fuling Xingren Gancao Tang；Juzhijiang Tang；Antioxidant；Isoprenaline

心肌缺血是指心臟的血液灌注量減少，心臟供氧不足，從而不能支持心臟正常工作的一種病理狀態［1］。近年來，隨著人民生活水平的提高，我國心肌缺血的患病率逐年上升，其中以中老年人最為多發，嚴重危害了人類健康［2-3］。茯苓杏仁甘草湯和橘枳姜湯均始載于東漢張仲景《金匱要略》［4］，具有宣肺化飲、散寒行水的功效，是中醫治療“胸痹，胸中氣塞、短氣”的常用方，臨床常被用來治療心絞痛及心肌梗死等“胸痹“之證［5-6］。本研究利用大鼠急性心肌缺血模型，考察了其心電圖和血清多項指標變化，系統、全面地研究了茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對于急性心肌缺血的保護作用，并初步探討了其抗氧化機制。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑酶標儀［芬蘭（Labsystems Multiskan MS，352）］，洗板機［芬蘭（Thermo Labsystems）AC8］，離心機（國產TG16W），培養箱（國產GNP-9080）。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號20141222）、肌酸磷酸激酶同工酶 （CK-MB）試劑盒 （批號20141222）、丙二醛（MDA）試劑盒 （批號20141221）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20141223），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒（批號20141223），以上試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。生理鹽水：湖南科倫制藥有限公司，批號H43020289，規格500 mL/瓶。水合氯醛：天津市科密歐化學試劑有限公司，批號Q/ 12HB 4220-2014，臨用時用生理鹽水配制成10%水合氯醛溶液。

1.2藥物單硝酸異山梨酯分散片（欣康）：魯南貝特制藥有限公司生產，批號08131029，規格20 mg/片。鹽酸異丙腎上腺素注射液：上海禾豐制藥有限公司生產，批號140902，規格2 mL：1 mg/瓶。茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯：茯苓15 g，杏仁10 g，甘草10 g，大棗6枚，橘皮15 g，枳實10 g，干姜10 g（購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科），按照《金匱要略》所載方法制備成中藥湯劑，并以臨床等效濃度作為低劑量（生藥含量為0.067 g/mL），其濃縮兩倍劑量為高劑量（生藥含量為0.134 g/mL）。

1.3動物健康成年SPF級雄性SD大鼠50只，體質量180～220 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。動物在屏障系統環境下，用專用的飼料（購自湖南中醫藥大學實驗動物中心）和滅菌水分籠飼養，每籠5只。保持動物房清潔，通風和適宜溫度，每天定時清潔鼠籠，飼養1周使大鼠適應實驗環境。

1.4分組與給藥雄性SD大鼠50只，按隨機數字表法分成正常對照組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組及西藥組，每組10只。各組按10 mL/kg灌胃相應藥物，每天1次，連續7 d，各組中藥煎劑溶液高、低劑量及西藥灌胃劑量均按60 kg人與200 g鼠體表面積換算后確定，正常對照組和模型組則給予相同體積的生理鹽水。

1.5模型制備第5、6、7日灌胃給藥后15 min，除正常對照組給予生理鹽水外，其余各組均予以異丙腎上腺素（每次2 mg/kg）腹腔注射造成大鼠急性心肌缺血模型。

1.6標本采集與檢測于末次腹腔注射異丙腎上腺素后24 h，將大鼠麻醉固定，采集心電圖信息，每只大鼠腹主動脈采血3 mL，用以檢測血清心肌酶。觀察心電圖J點（QRS波群與T波交點）及T波的下降值。所有大鼠采血完畢后，以3000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存，待測。用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測LDH、CK-MB、MDA、SOD和GSH-PX的含量，操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.7統計學處理應用SPSS20.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對心肌缺血大鼠心電圖的影響見表1。結果示，腹腔注射異丙腎上腺素24 h后，與正常對照組比較，模型組心電圖J點、T波均明顯下降（P＜0.01），表明造模成功。與模型組比較，西藥組及中藥高、低劑量組J點及T波下降幅度均明顯減小，差異均具有統計學意義（P＜0.05），表明西藥組及中藥高、低劑量組均具能顯著減輕大鼠心肌缺血程度。而中藥高、低劑量組間心電圖J點、T波下降值差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯能夠在心肌缺血的狀態下，能顯著減輕大鼠心肌缺血程度，與西藥異丙腎上腺素作用無差別，且中藥高、低劑量作用相同。

表1　各組心肌缺血模型大鼠J點、T波下降值（mV，±s）

表1　各組心肌缺血模型大鼠J點、T波下降值（mV，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別　n　J點下降值　T波下降值正常對照組　10　0.02±0.01**　0.01±0.01**模型組　10　0.13±0.06　0.06±0.04西藥組　10　0.08±0.02*　0.04±0.03*中藥低劑量組　10　0.06±0.01*　0.03±0.02*中藥高劑量組　10　0.06±0.01*　0.03±0.01*

2.2茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對心肌缺血大鼠心肌酶學的影響見表2。結果示與正常對照組比較，模型組LDH、CK-MB活性明顯增高（P＜0.01），說明大劑量異丙腎上腺素致大鼠心肌細胞急性缺血損傷造模成功。與模型組比較，西藥組、中藥高劑量、中藥低劑量組的LDH、CK-MB活性均明顯降低（P＜0.01）。中藥高劑量組的LDH、CK-MB活性顯著優于西藥組（P＜0.01），中藥低劑量組LDH、CK-MB含量明顯低于西藥組（P＜0.05）。中藥高低劑量之間比較，中藥高劑量組LDH、CK-MB含量均明顯低于中藥低劑量組（P＜0.01）。結果表明，中藥復方茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯高劑量組能夠在心肌缺血的狀態下，顯著降低大鼠心肌酶活性，其作用優于西藥，中藥低劑量降低心肌酶作用較高劑量不明顯。

2.3茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對心肌缺血大鼠氧化防御系統的影響見表3。結果示，與正常對照組比較，模型組中大鼠血清MDA含量顯著升高，SOD、GSH-PX的活性明顯下降（P＜0.01），說明大劑量異丙腎上腺素可加速大鼠心肌氧化，造模成功。與模型組比較，西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組MDA含量顯著降低，SOD和GSH-PX含量顯著升高 （P＜0.01）。與西藥組比較，中藥高劑量組MDA、SOD含量降低（P＜0.01），GSH-PX活性明顯增高（P＜0.01）；中藥低劑量組MDA含量顯著高于西藥組，而SOD和GSH-PX低于西藥組 （P＜0.01）。且中藥高劑量組抗氧化指標MDA、SOD、GSH-PX均明顯優于中藥低劑量組 （P＜0.01）。結果表明，中藥高劑量組能夠在心肌缺血的狀態下，具有顯著抗氧化保護作用，其作用優于西藥異丙腎上腺素組和中藥低劑量組。

表2　各組心肌缺血模型大鼠心肌酶LDH、CK-MB水平比較（ng/mL，±s）

表2　各組心肌缺血模型大鼠心肌酶LDH、CK-MB水平比較（ng/mL，±s）

與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥低劑量組比較，#P＜0.01。下同。

組別　n　LDH　CK-MB正常對照組　10　24.47±0.72**　8.29±0.25**模型組　10　44.72±0.71　15.49±0.27西藥組　10　36.30±0.85**△　11.78±0.19**△中藥低劑量組　10　33.65±0.84**　11.54±0.21**中藥高劑量組　10　31.42±0.64**△△#　10.57±0.21**△△#

表3　各組心肌缺血模型大鼠MDA、SOD和GSH-PX水平比較（±s）

表3　各組心肌缺血模型大鼠MDA、SOD和GSH-PX水平比較（±s）

組　別　n　MDA（nmol/L）正常對照組　10　2.39±0.06**模型組　10　4.51±0.08西藥組　10　3.31±0.07**中藥低劑量組　10　3.80±0.07**△△中藥高劑量組　10　3.11±0.34**△△#SOD（ng/mL） GSH-PX（pg/mL）311.98±7.22**　675.18±12.90**176.59±5.14　373.00±7.66 245.04±5.96**　452.53±10.01**209.82±2.84**△△441.32±7.36**△244.45±5.40**△#515.03±12.62**△△#

3　討　論

近年來，冠心病發病率逐漸增高，是世界上死亡率最高的疾病之一。心肌缺血是發生冠心病的直接原因。目前研究多表明，心肌缺血損傷的發生與心肌組織氧化應激過程明顯相關［7-8］。MDA是由自由基與細胞膜上多不飽和脂肪酸相互反應而產生的一種代謝產物，可以反映體內脂質過氧化狀態［9-10］；SOD的主要功能是清除體內自由基，其含量與體內清除氧自由基的能力呈正相關。大量研究表明，注射異丙腎上腺素可模擬急性心肌缺血的改變，其心電圖、心肌酶學及組織病理學變化皆類似于類急性心肌梗死的病變特征［11-12］。大劑量異丙腎上腺素可過度加快大鼠心肌收縮，從而導致心肌損傷和壞死，心電圖表現為ST段的改變（T波下降和J點下移）；生物化學指標主要表現為心肌酶（CK-MB、LDH）增高，而氧化防御系統 （包括SOD、GSH-PX等）活性減弱，氧自由基及其終產物MDA大量蓄積［13-14］。

心肌缺血屬中醫“胸痹“范疇，多數醫家［15］認為本病病機為本虛標實，虛實相互夾雜，本虛多為心氣虧虛，標實以氣滯、血瘀、水停較為多見。茯苓杏仁甘草湯和橘枳姜湯均出自于張仲景 《金匱要略》［4-6］“胸痹，胸中氣塞，短氣，茯苓杏仁甘草湯方主之；橘枳姜湯亦主之。茯苓杏仁甘草湯方：茯苓三兩，杏仁五十個，甘草一兩。上三味，以水一斗，煮取五升，溫服一升，日三服。不差，更服；橘枳姜湯方：橘皮一斤，枳實三兩，生姜半斤。上三味，以水五升，煮取二升，分溫再服。其臨床常被用來治療胸痹，效果顯著”?！夺t宗金鑒》認為此時“水盛于氣者，主以茯苓杏仁甘草湯；氣盛于水者，主以橘皮枳實生姜湯。蓋前方著重利水，后方著重行氣”［6］。兩方合用珠聯璧合，針對其關鍵病機，使氣順水行，共奏行氣利水之功。

本實驗表明，中藥經方茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯能夠明顯降低急性心肌缺血大鼠心電圖J點及T波下降幅度，顯著降低血漿中心肌酶LDH、CK-MB活性，這提示復方茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯可抑制急性缺血大鼠心肌細胞的壞死，從而維持大鼠心肌組織的正常功能。綜上所述，在實驗性大鼠心肌缺血抗氧化保護方面，茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯的療效與目前廣泛應用于臨床的單硝酸異山梨酯沒有明顯差異性，說明茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯具有很大的開發利用價值。本研究以《中藥新藥研究指南》為依據，全面、系統地研究了茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯對大鼠急性心肌缺血的作用效果。結果顯示，茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯能夠降低急性心肌缺血大鼠心肌組織內MDA活性，并提高其SOD、GSH-PX活性，說明茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯能夠提高大鼠心肌組織抗氧化能力。其對大鼠急性心肌缺血的保護作用產生的機制，也在于它能在一定程度上抑制缺血心肌產生過度氧化應激反應。同時，以上結果也表明，高劑量的茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯明顯優于低劑量。但是關于茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯抗心肌缺血的具體成分及詳細量效關系尚待進一步研究。

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The Antioxidant Protection Research on Combined Fuling Xingren Gancao Tang and Juzhijiang Tang on Rats with Isoprenaline Leading Acute Myocardial Ischemia

CHEN Xinyu，JIANG Ling，ZHANG Shiying，et al.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China.

·醫籍研析·

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0753-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.001

國家自然科學基金資助項目（81173213/H2708）；湖南省科技廳科技計劃項目（2011FJ3042）；湖南省中醫藥管理局重點項目（201106）；湖南省研究生科研創新項目（CX2011B341）
△

（電子郵箱：chenxinyuchen@163.com）

2015-09-28）