正常成年Wistar大鼠短聲及短純音聽性腦干反應波形分析△

張超李鳳嬌，＃王敏姣趙艷黃國威楊駒于寧房琳郭維維薛希均縱亮關靜王秋菊

·實驗研究·

正常成年Wistar大鼠短聲及短純音聽性腦干反應波形分析△

張超1李鳳嬌1，2＃王敏姣1趙艷1黃國威1楊駒1于寧1房琳1郭維維1薛希均2縱亮1關靜1王秋菊1

目的 分析正常Wistar大鼠短聲（click）及短純音（tone burst，TB）誘發聽性腦干反應（c ABR、tb-ABR）結果，標準化Wistar大鼠ABR測試方法，為大鼠聽覺研究提供參考。方法 正常成年雄性Wistar大鼠15只，分別進行c ABR和tb ABR（4、8、12、16、24、32 k Hz）測試，觀察80、50、20 dB SPL強度下各波的引出率，以引出率最高的波來判斷閾值，同時量取該波的潛伏期和幅值，檢測ABR波Ⅱ、Ⅳ振幅I／O曲線。結果 ①20 dB SPL強度下c ABR和tb ABR波Ⅱ和波Ⅳ最晚消失的比例幾乎相同；②c ABR閾值為21.83±4.45 dB SPL，4～32 k Hz頻率tb ABR閾值分別為24.33±5.37、14.17±4.37、14.33±4.68、16.67±4.22、23.00±5.81、31.00±7.36 dB SPL；③80 dB SPL c ABR波Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ潛伏期分別為1.76±0.12、2.13±0.11、2.67±0.16、3.49±0.28、4.39±0.29、5.45±0.41 ms，tb ABR 4 k Hz波Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ潛伏期分別為2.02±0.09、2.88±0.16、3.77± 0.25、4.69±0.29、5.78±0.41 ms，8 k Hz分別為1.76±0.07、2.28±0.10、2.63±0.16、3.49±0.21、4.44±0.28、5.48±0.43 ms，12 k Hz分別為1.76±0.08、2.24±0.12、2.61±0.25、3.53±0.25、4.46±0.32、5.52±0.45 ms，16 k Hz分別為1.79±0.10、2.25±0.12、2.70±0.18、3.62±0.27、4.52±0.37、5.61±0.49 ms，24 k Hz分別為1.75± 0.09、2.27±0.11、2.67±0.16、3.60±0.27、4.52±0.38、5.60±0.51 ms，32 k Hz分別為1.77±0.10、2.24±0.12、2.64±0.20、3.59±0.34、4.52±0.40、5.61±0.52 ms；④I／O曲線示在高強度時波Ⅱ振幅明顯高于波Ⅳ，但在低強度時，波Ⅱ振幅與波Ⅳ基本相同，甚至波Ⅳ振幅高于波Ⅱ。結論 正常成年大鼠短聲及短純音誘發ABR波Ⅳ出現率最高，低強度聲刺激時，波Ⅱ、Ⅳ振幅基本相同，甚至波Ⅳ振幅高于波Ⅱ，可以波Ⅳ最后消失的強度為閾值。

大鼠； 短聲； 短純音； 聽性腦干反應

聽性腦干反應（ABR）是臨床上常用的聽覺功能測試方法，在各種不同的聽覺相關實驗中廣泛應用。ABR能夠在一定程度上評估聽覺傳導通路是否正常，易于操作，受清醒和非清醒狀態的影響較小。近年來常用Wistar大鼠進行各種聽覺損傷的造模，研究其機理和轉歸，對于Wistar大鼠的ABR正常值也有較多報道，但是國內外實驗數據相比較，存在一定的差異［1～7］。為此，本研究擬通過Wistar大鼠ABR測試中的信號采集及給聲參數設置、聲音校準等，對其ABR反應閾、潛伏期和波形分化進行分析，以標準化Wistar大鼠ABR測試方法，為今后Wistar大鼠動物模型的聽覺研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取聽力正常雄性Wistar大鼠15只（30耳），8周齡，體重200～300 g，由解放軍總醫院動物實驗中心提供。

1.2 ABR測試聲 測試聲生成使用美國TDT公司SigGen RP軟件，短聲（click）為0.1 ms時程的電脈沖方波沖擊耳機產生，無上升下降時間，采用Blackman非線性開窗，交替波；短純音（tome burst，TB）4、8、12、16、24、32 k Hz設置為1 ms時程，0.4 ms上升和下降時間，0.2 ms平臺，采用Blackman非線性開窗。

1.3 儀器校準 采用丹麥Brüel＆Kj?r公司數據采集硬件模塊（Type3052-A-3／0）和測試探頭（2669 C 001）與電腦連接，使用丹麥Brüel＆Kj?r公司軟件PULSE對click聲進行進行等效峰值聲壓級（peSPL）校準，對TB聲進行峰值聲壓級（SPL）校準。文中對于click聲和TB聲統一用聲壓級（SPL）表示。給聲喇叭口連接3 cm傳聲管，探頭距離傳聲管出聲口1 mm。

1.4 ABR測試方法 大鼠以1%戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉，用暖水袋保持體溫。動物完全麻醉后，記錄電極置于兩耳耳輪腳連線顱頂中央皮下，參考電極沿耳后溝中部向前扎入，置于測試耳耳甲艇皮下，接地電極置于非測試耳耳甲艇皮下，極間電阻小于1 kΩ。用美國TDT公司的聽覺電生理系統和其配套的BioSigRP系統軟件進行給聲和記錄。刺激聲音為之前生成和校準好的click和TB聲音，強度80 d B SPL到0 dB SPL，衰減間隔為10 dB，接近閾值時，衰減間隔為5 dB，帶通濾波300～3 000 Hz，開啟50 Hz陷波防止交流電干擾，信號放大50 000倍，觀察窗為10 ms，刺激速率為21次／秒，疊加1 024次。MF1－S磁性揚聲器（頻響1～70 k Hz）整體用密孔黃銅網包裹并接地，喇叭出聲管口置于距動物外耳道口1 mm校準距離處，開放聲場給聲。觀察80 d B SPL強度下各波的潛伏期；80、50、20 dB SPL時各波出現的頻率，依據出現率最高的波，得出各個頻率的閾值，量取出現率最高波的潛伏期和振幅。潛伏期的量取從聲音刺激開始到所測波峰值的時間差，振幅量取波峰和波谷的差值［8］。

2 結果

2.1 100 d B SPL強度下click聲及各頻率TB聲聲學波形圖 如圖1所示，實測click聲的聲學波形圖，量取峰值聲壓的強度，等效1 000 Hz純音在100 dB SPL時聲壓強度，換算成dB（允許誤差±1 dB）。此時得到的click聲即為100 dB peSPL聲強，click聲實測時程1 ms左右。TB聲校準則只需直接測試聲壓級，得到校準強度，圖1中可見各頻率TB聲實測得到的完整給聲聲波圖形。

2.2 不同給聲條件下各波潛伏期正常值 80 dB SPL強度下click聲和各頻率TB聲Wistar大鼠ABR各波潛伏期見表1，不同強度click聲Wistar大鼠ABR波形見圖2。

4 k Hz tb ABR各波潛伏期因聲音頻率低，在一個完整給聲時程中，平臺短，能量相對低，同時大鼠的4 k Hz聽力較差，相較于其他給聲頻率，4 k Hz tb ABR各波潛伏期相對較長，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 100 d B SPL強度下click和TB聲聲學波形圖 （x軸為時間ms，y軸為壓力pa）

表1 80 d B SPL強度下c ABR和tb ABR各波潛伏期（ms，±s）（n＝30耳）

表1 80 d B SPL強度下c ABR和tb ABR各波潛伏期（ms，±s）（n＝30耳）

注：因為大鼠4 k Hz聽力較差，而Ⅰb又極易融合或消失，故未能引出Ⅰb

ABR波c ABR tb ABR 4 k Hz 8 k Hz 12 k Hz 16 k Hz 24 k Hz 32 k HzⅠa 1.76±0.12 2.02±0.09 1.76±0.07 1.76±0.08 1.1±0.49 5.60±0.51 5.61±0.52 79±0.10 1.75±0.09 1.77±0.10Ⅰb 2.13±0.11—2.28±0.11 2.24±0.12 2.25±0.12 2.27±0.11 2.24±0.12Ⅱ2.67±0.16 2.88±0.16 2.63±0.16 2.61±0.25 2.70±0.18 2.67±0.16 2.64±0.20Ⅲ3.49±0.28 3.77±0.25 3.49±0.21 3.53±0.25 3.62±0.27 3.60±0.27 3.59±0.34Ⅳ4.39±0.29 4.69±0.29 4.44±0.28 4.46±0.32 4.52±0.37 4.52±0.38 4.52±0.40Ⅴ5.45±0.41 5.78±0.41 5.48±0.43 5.52±0.45 5.6

2.3 80、50、20 dB SPL強度下c ABR和tb ABR各波引出率 從表2、3、4可以看出，在高強度和中等強度聲刺激時，正常成年的Wistar大鼠c ABR和tb ABR各波基本都可以引出，在低強度聲刺激時，Ⅱ波和Ⅳ波最晚消失，引出率幾乎相同。而Ⅰb因為出現率較低，且只在較高強度聲刺激時出現，故未納入統計。

在click聲和不同頻率TB聲閾值強度刺激時，Ⅱ波最晚消失率為17.14%，Ⅳ波最晚消失率為18.57%，Ⅱ波和Ⅳ波同時消失率為64.29%；但波Ⅳ能反應的聽覺通路層級更高，因此在判斷正常成年Wistar大鼠ABR反應閾時，應觀察波Ⅳ。

表3 50 dB SPL強度下c ABR和tb ABR各波引出率（%）（n＝30耳）

表4 20 dB SPL強度下c ABR和tb ABR各波引出率（%）（n＝30耳）

圖2 Wistar大鼠c ABR波形隨刺激聲強度變化圖

2.4 正常成年Wistar大鼠c ABR和tb ABR閾值click和4、8、12、16、24、32 k Hz TB聲刺激下正常成年Wistar大鼠ABR閾值分別為21.83±4.45、24.33±5.37、14.17±4.37、14.33±4.68、16.67± 4.22、23.00±5.81、31.00±7.36 dB SPL?？梢?，8、12、16 k Hz tb ABR反應閾值最低，其聽覺最敏感的頻率為8、12和16 k Hz。

2.5 c ABR和tb ABR波Ⅱ和波Ⅳ振幅的輸入輸出函數曲線 從圖3可見，ABR振幅呈非線性變化，在高強度聲刺激時，波Ⅱ的振幅明顯高于波Ⅳ，但在低強度時，波Ⅱ和波Ⅳ的振幅基本相同，甚至波Ⅳ振幅高于波Ⅱ，32 k Hz聲刺激時，因聲音能量較低，波Ⅱ和波Ⅳ的振幅幾乎相同。這可能與波Ⅱ和波Ⅳ來自的聽覺核團有關，Wistar大鼠波Ⅳ可能來自下丘。

2.6 ABR波Ⅰb的分化 在高強度聲刺激時，在分化較好的ABR波Ⅰ和波Ⅱ之間出現了一個分化較差的波（圖4），暫定為波Ⅰb。80 dB SPL強度下波Ⅰb的引出率c ABR為26.67%，tb ABR 4、8、16、24、32 k Hz分別為0、16.67%、23.33%、20%、26.67%、26.67%。

3 討論

誘發ABR的刺激聲種類有click、tone burst、tone pip和chirp聲等，實驗中和臨床常用的是click聲，它瞬態特異性好，波形分化清晰，2007年國際標準化組織發布了《聲學校準測聽設備的基準零級第6部分短時程測試信號的基準聽閾》［9］，但到目前為止，TB聲的標準和設置還沒有統一。

本實驗中，click聲按照國際標準設置，采用等效峰值聲壓的方法校準。TB聲設置參照國際標準，同時結合國際上對于TB聲的流行設置［4，9～13］，1 ms時程，0.4 ms上升和下降時間，0.2 ms平臺，采用Blackman非線性開窗。因為4 k Hz以上的刺激聲，用1 ms的時程較3 ms和5 ms更短，瞬態特異性更好，且有足夠的聲音周期，誘發的ABR波形分化更好，閾值更低。為了區別tone burst與tone pip的平臺期，本實驗的刺激聲設置了0.2 ms的平臺，上升下降時間和平臺期的比值為2：1：2，因為4 k Hz聲音周期較長，在這個設置下只有一個波峰達到平臺強度。

目前國內各實驗室在對動物進行ABR測試時，對聲音的校準方法、強度、聲音的形態描述都比較模糊，都是用廠家提供的設備和設置，但是耳機里出來的聲音的頻率、強度、波形關注較少。不同廠家的設置多有不同，因此相互間的可比性較??；同時，儀器設備在使用一段時間后，聲音會產生畸變，從揚聲器出來的聲音和設置的聲音不同，所以必須每隔一段時間到專業機構用專業的儀器校準，以保證實驗結果的準確性。

ABR測試時電壓越大電阻越小，得到的信號就越好，那么ABR的波形分化就越好。在動物實驗中，電極針之間的電勢差越大，電壓就越大，但在得到足夠大的電壓時，應避免電阻增大。電阻包括儀器上測得的電阻、機體產生的各種干擾以及外界產生的電或者磁的干擾。有實驗報道將記錄電極和接地電極置于大鼠的耳垂［3］，但大鼠的耳垂不明顯，無法固定電極。也有實驗將電極置于大鼠乳突部［1，14］，但大鼠的乳突部比較小，也不易于固定電極，即使將電極固定好，電極針也會扎入頸部肌肉，產生較大的干擾，影響基線和波形分化。本實驗將記錄電極置于兩耳輪腳連線顱頂中央皮下，參考電極沿耳后溝中部向前扎入，置于測試耳耳甲艇皮下，接地電極置于非測試耳耳甲艇皮下，這樣既可以保證良好的電勢差，又可以避免肌電干擾，得到分化清晰的ABR波形和平穩的基線。

圖3 c ABR和tb ABRⅡ、Ⅳ波振幅輸入輸出曲線圖

本實驗用于判斷大鼠ABR閾值的波為波Ⅳ，與Lin［6］、Alvarado［10］、Ahmed［15］報道相同，與其他文獻［1，2，16］報道的以波Ⅲ判斷閾值不同。從實驗結果可以看出，本實驗中大鼠ABR的波形分化非常好，50 d B SPL強度下，各波的出現率還是很高，可能與實驗前的聲音設置、聲音校準和各項條件的把控有關，也可能與不同廠家儀器的設置相關。雖然在某些頻率波Ⅱ最晚消失，從圖3中也能發現，波Ⅱ平均振幅高于波Ⅳ，但是在接近閾值時，波Ⅳ和波Ⅱ的振幅幾乎相同，甚至波Ⅳ振幅要高于波Ⅱ。對于人類ABR各波的起源，目前普遍認為波Ⅰ來自第八對腦神經近蝸端，波Ⅱ來自耳蝸核，波Ⅲ來自橄欖核，波Ⅳ來自外側丘系，波Ⅴ來自下丘［17］；有文獻報道大鼠的波Ⅳ來自下丘［18，19］，但也有報道認為其不是來自下丘［20］，不過可以肯定的是波Ⅳ可以反應更高一級的神經中樞，能夠更準確地反應大鼠的聽功能，綜合考慮出現率、振幅、波形分化及波的起源，以波Ⅳ判斷大鼠ABR反應閾更佳。

圖4 ABRⅠb波形分化示意圖

本實驗中Wistar大鼠的click（dB SPL）聲和TB（dB SPL）聲誘發的ABR閾值與Tanaka等［4，5］的結果相似，與韓維舉等［16］、Kim［21］等結果存在一些差異，主要原因是各個實驗室使用的短純音的設置、實驗儀器及大鼠的品種不同。

本文結果所示Ⅰb在高強度聲刺激且波形分化較好時會出現，當刺激聲強度降低，Ⅰb迅速消失，或者說是與Ⅱ波融合。Ⅰb在4 k Hz聲刺激時不出現，但在其它各頻率聲刺激時均出現，Ⅰb與人的Ⅱ波類似，來源于聽神經近耳蝸核端和耳蝸核，因為大鼠的體積較小，波形分化不如人類的好，所以容易被Ⅱ波融合。依照這個假設，大鼠ABR的波形分化和閾值判斷和人類完全一樣，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波。

本研究結果中I／O曲線顯示，ABR波Ⅱ、Ⅲ振幅隨著強度的變化而變化，呈非線性，與Zhang等的大鼠行為學實驗結果相似［22］，其實驗中刺激聲是白噪聲，與本實驗中ABR振幅I／O曲線相似。后續可以根據這個現象，在行為學條件不允許時，通過量取大鼠ABR的波Ⅳ振幅I／O曲線，進行聽覺過敏和耳鳴［23］相關實驗設計。

（致謝：感謝中國人民解放軍總醫院解放軍耳鼻咽喉研究所李興啟教授、于黎明主任對本文的大力幫助?。?/p>

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（2015－11－25收稿）

（本文編輯 周濤）

The Wave Analysis of Auditory Brainstem Responses in Normal Adult Wistar Rat

Zhang Chao*，Li Fengjiao，Wang Minjiao，Zhao Yan，Huang Guowei，Yang Ju，Yu Ning，Fang Lin，Guo Weiwei，Xue Xijun，Zong Liang，Guan Jing，Wang Qiuju
（*Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，Chinese PLA lnstitute of Otolaryngology，Chinese PLA General Hospital，Beijing，100853，China）

Objective To investigate the click and tone burst evoked auditory brainstem responses（ABR）in normal Wistar rat，and to establish the standards of ABR testing method，and to provide a reference for studies rat audition.Methods Fifteen male Wistar rats（30 ears）were used in this sutdy.The latency and amplitude of ABR evoked by click and TB at 80，50 and 20 dB SPL were measured.Results The occurrence rate of waveⅡandⅣat lowlevels（20 dB SPL）was nearly the same according to the amplitude.The c ABR（dB peSPL）threshold was 21.83± 4.45 and tb ABR（dB SPL）thresholds were 2.02±0.09，2.88±0.16，3.77±0.25，4.69±0.29，and 5.78±0.41，respectively.80 dB stimulus evoked c ABR（peSPL）wave I，I b，II，III，IV and V latency（ms）were 1.76±0.12，2.13±0.11，2.67±0.16，3.49±0.28，4.39±0.29，and 5.45±0.41，respectively.tb ABR（SPL）of wave I，Ib，II，III，IV and V latency（ms）at 4 k Hz were 2.02±0.09，2.88±0.16，3.77±0.25，4.69±0.29，and 5.78± 0.41，respectively.At 8 k Hz they were 1.76±0.07，2.28±0.10，2.63±0.16，3.49±0.21，4.44±0.28，and 5.48±0.43；while at 12 k Hz were1.76±0.08，2.24±0.12，2.61±0.25，3.53±0.25，4.46±0.32，and 5.52± 0.45；at 16 k Hz were 1.79±0.10，2.25±0.12，2.70±0.18，3.62±0.27，4.52±0.37，and 5.61±0.49；at 24 k Hz were 1.75±0.09，2.27±0.11，2.67±0.16，3.60±0.27，4.52±0.38，and 5.60±0.51；at 32 k Hz were 1.77±0.10，2.24±0.12，2.64±0.20，3.59±0.34，4.52±0.40，and 5.61±0.52，respectively.Conclusion WaveⅣwas the best wave to determine threshold of click and tone burst evoked auditory brainstem response in rat.

Rat； Click； Tone burst； Auditory brainstem response

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.010

時間：2016－6－29 16：11

R764.04

A

1006－7299（2016）04－0360－07

* 國家重大科學研究計劃項目（2014CB943001）、國家自然科學基金重點國際合作項目（81120108009）、國家自然科學基金重點項目（81530032）及全軍“十二五”重點項目（BWS11J026）聯合資助

1 中國人民解放軍總醫院 解放軍耳鼻咽喉研究所（北京 100853）； 2 昆明醫科大學昆明總醫院臨床醫院耳鼻咽喉科

張超，男，湖南人，技師，主要研究方向為聽覺電生理；李鳳嬌，女，山東人，碩士研究生，主要研究方向為耳聾及聽力學相關基礎與臨床。

王秋菊（Email：wqcr301＠sina.com；wqcr＠263.net）

＃ 共同第一作者

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.034.html