槲皮素作為飼料添加劑在體內和體外致突變性潛力的評價

■王盛楠 周 博 肖風林 王 密 姚佳穎 楊家新 李 垚* 尹文哲

（1.東北農業大學動物營養研究所，黑龍江哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫科大學第二附屬醫院，黑龍江哈爾濱 150086）

槲皮素（3,3',4',5,7-五羥基黃酮）是一種廣泛存在于植物中的物質[1-3]，在抗氧化、抗癌、抗炎和免疫調節等方面具有獨特的生物學和藥理學功能[4-9]。雖然其作用機制尚未明確，但大量研究表明，槲皮素的生理功能與其抗氧化的特性有關[10-12]。槲皮素作為一種天然黃酮類物質，其有望替代抗生素在畜禽飼料中使用，以提高畜產品安全，維持畜牧業可持續發展。然而，槲皮素作為飼料添加劑在動物生產中使用的安全性評價尚未明確。

本課題組前期研究表明，槲皮素可提高蛋雞產蛋率和蛋黃卵磷脂含量，降低蛋黃膽固醇含量[13]；前期的急性毒性和慢性毒性的試驗發現，槲皮素的半數致死量大于10 mg/(kg·BW)，表明槲皮素屬于無毒類物質。在飼糧中添加槲皮素對大鼠和蛋雞分別進行30 d和56 d的飼養試驗結果表明，槲皮素對大鼠和蛋雞均未引起慢性毒性[14]。因此，本試驗通過對鼠傷寒沙門氏菌突變株（TA97、TA98、TA100和TA102）和小鼠進行致突變性檢測（Ames）、骨髓微核以及精子畸形試驗，以進一步評估槲皮素作為飼料添加劑在體內體外的致突變性。

1 材料和方法

1.1 試驗受試物

槲皮素購自Sigma-Aldrich公司，純度為98%（HPLC）。

1.2 試驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，由黑龍江省疾病預防控制中心提供。

1.3 試驗動物

昆明種小鼠，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 Ames試驗

選取鼠傷寒沙門氏菌突變菌株TA97、TA98、TA100和TA102作為試驗菌株，試驗分為7組，分別是5個槲皮素試驗組以及陽性和陰性對照組。試驗組槲皮素的劑量為每皿8、40、200、1 000、5 000 μg，在肝微粒體多氯聯苯誘導劑（9 000×g Supernatant，S9）不干預的情況下，陽性對照組分別添加50.0、1.5、10.0 μg和50.0 μg的敵克松和疊氮鈉；在S9干預的情況下，陽性對照組分別添加50.0、1.5、10.0 μg和50.0 μg的2-乙酰氨基芴和1，8-二羥蒽醌。陰性對照組添加每皿0.1 ml蒸餾水。試驗分別在肝微粒體多氯聯苯誘導劑（9 000×g Supernatant，S9）干預和不干預的條件下進行，每個劑量設置3個平皿，每個試驗重復2次。記錄每皿回復突變菌落數。

1.4.2 骨髓微核試驗

將50只昆明種小鼠（6～8周齡，體重25～35 g，25只雄性和25只雌性）隨機分為5組，每組10個重復。槲皮素試驗組分別灌胃給藥500、5 000 mg/(kg·BW)和10 000 mg/(kg·BW)，陽性對照組腹腔注射40 mg/(kg·BW)環磷酰胺，陰性對照組灌胃給藥等體積0.5%羧甲基纖維素。試驗共給藥2次，間隔24 h，第2次給藥后6 h處死小鼠。取胸骨制片、鏡檢。計算小鼠嗜多染紅細胞（Poly?chromatic erythrocyte，PCE）、成熟紅細胞（Red blood cell，RBC）數量及PCE/RBC比值。每只小鼠計數1 000個PCE，骨髓微核率（‰）=微核細胞數/檢查細胞總數×1 000。

1.4.3 精子畸形試驗

將50只昆明種雄性小鼠（6～8周齡，體重25～35 g）隨機分為5組，每組10個重復。槲皮素試驗組分別灌胃給藥500、5 000 mg/(kg·BW)和10 000 mg/(kg·BW)，陽性對照組腹腔注射40 mg/(kg·BW)環磷酰胺，陰性對照組灌胃給藥0.5%羧甲基纖維素(槲皮素試驗組、陽性對照組和陰性對照組的給藥體積均相同)。試驗每日給藥1次，連續5 d，在第1次給藥后35 d處死小鼠。取精子經常規蘇木精-伊紅（Hematoxylinand Eeosinstaining，HE）染色法制成切片，每張切片在OLYMPUS CH20光學顯微鏡下鏡檢1 000個完整精子，計算精子畸形率。

1.5 數據的統計分析

采用SPSS18.0進行統計分析，結果以“平均數±標準差”表示；其中Ames和骨髓微核試驗結果采用卡方檢測方法分析；精子畸形試驗結果采用One-way ANOVA分析和Duncan's法進行多重比較。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 Ames試驗（見表1～表4）

表1 槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數的影響(第1次Ames試驗，不加S9，個/皿)

表2 槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數的影響(第1次Ames試驗，加S9，個/皿)

表3 槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數的影響(第2次Ames試驗，不加S9，個/皿)

表4 槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數的影響(第2次Ames試驗，加S9，個/皿)

由表1、2、3和表4可見，與陰性對照相比，在加S9和不加S9的情況下，槲皮素試驗組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數無顯著差異（P＞0.05），但陽性對照組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復突變菌落數極顯著增加（P＜0.01）。

2.2 骨髓微核試驗（見表5）

表5 槲皮素對昆明種小鼠PCE/RBC值和骨髓微核率的影響

由表5可見，與陰性對照組比，槲皮素試驗組小鼠PCE/RBC和骨髓微核率無顯著差異（P＞0.05）；但與各試驗組相比，陽性對照組小鼠PCE/RBC和骨髓微核率極顯著增加（P＜0.01）。

2.3 精子異常檢測（見表6）

由表6可見，與陰性對照相比，每組小鼠均存在一定數量的畸形精子，但槲皮素試驗組小鼠精子畸形率無顯著差異（P＞0.05）；陽性對照小鼠精子畸形率極顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

表6 槲皮素對昆明種小鼠精子畸形率的影響

槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于天然植物內[1-3]。已有試驗證明，槲皮素是一種強抗氧化劑[4-9]，且同其他黃酮類化合物相同，都具有清除自由基的功能[15-16]。有大量數據表明，槲皮素在體外具有致突變性，但對這一結果的安全評估系統尚未建立，因此，在這種情況下，建立槲皮素作為飼料添加劑而不是治療類藥物的安全性評價已成為一個重要的研究領域。

為了評估槲皮素的致突變能力，本試驗在體外和體內兩種試驗條件下，對槲皮素的致突變性進行測試。Ames試驗又稱沙門氏菌回復突變試驗，由于鼠傷寒沙門氏菌是一種組氨酸營養缺陷型菌株，其在正常培養的情況下，會產生極少數的自發回復突變，但在外界誘變劑作用后，會有大量細菌發生回復突變，故可用來檢測槲皮素的體外致突變性。本試驗結果表明，與陰性對照組相比，槲皮素試驗組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株（TA97、TA98、TA100和TA102）回復突變菌落數均無顯著影響。本試驗采用骨髓微核和精子畸形試驗檢測槲皮素的體內致突變性，兩試驗均選取環磷酰胺作為陽性對照，環磷酰胺是一種廣譜的抗腫瘤藥物，但臨床試驗表明，環磷酰胺具有致突變性。本試驗結果表明，與陰性對照組相比，槲皮素試驗組小鼠PCE/RBC、骨髓微核率以及精子畸形數均無顯著影響。在大多數對鼠傷寒沙門氏菌標準菌株的體外試驗中，在不存在代謝活化的情況下，槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌表現為致突變性[17-24]，同樣在對大腸桿菌的試驗中，在存在或不存在代謝活化的情況下，有研究表明槲皮素可以誘導補氧系統（Supplemental oxygen system，SOS）活性、反向突變以及DNA單鏈斷裂[18-19,23-25]。通過對這些細菌進行姐妹染色單體互換、染色體畸變、非常規DNA合成以及微核形成等試驗發現，槲皮素對包括酵母和哺乳動物細胞在內的真核細胞均具有致突變性和遺傳毒性[20,26-29]，與以上研究結果相反的是，本試驗在經過體外鼠傷寒沙門氏菌的鑒定后，用槲皮素對小鼠進行的體內試驗并沒有顯示出任何的致突變性。此外，在體內試驗，采用槲皮素對小鼠和大鼠進行單次和多次灌胃后，進行如姐妹染色單體互換、染色體畸變、非常規DNA合成以及微核形成等體外試驗測試的指標發現，所有的結果均一致表明，盡管槲皮素在體外試驗中變現為具有致突變的能力，但在體內槲皮素不產生任何突變物質或遺傳毒性[30-32]。包括由美國國家毒理學計劃（National Toxi?cology Program，NTP）進行的為期2年的嚙齒動物的致癌性生物測定在內的大量毒理學研究進一步證實了槲皮素在體內無致突變性和遺傳毒性，并且研究結果表明，槲皮素可作為人類口服藥物，其作用過程沒有出現任何與安全性相關的不利證據[20，23，33]。盡管NTP最初對雄性大鼠研究得出了一些與增加腎臟腫瘤發生率有關的致癌性證據[20]，但隨后進一步研究表明，雄性大鼠腎臟腫瘤率的提高是由慢性腎病惡化介導的，而不是槲皮素的直接作用[32]。

本試驗結果與以上體內試驗結果均相同，提示槲皮素在體內體外試驗中，均不表現出致突變性。此外，本課題組前期研究表明，槲皮素對小鼠、大鼠和蛋雞均沒有表現出急性毒性、慢性毒性或亞慢性毒性[14]。

4 結論

槲皮素在小鼠體內和體外均未顯示出致突變性。并且結合本課題組前期研究槲皮素的急性毒性和亞慢性毒性的試驗數據表明，在一定劑量范圍內，槲皮素可作為一種安全的飼料添加劑。