不同養殖鹽度對凡納濱對蝦血細胞的影響

■鄭佩華 錢 坤 張秀霞 魯耀鵬 王冬梅 李軍濤 王安利 冼健安*

（1.華南師范大學生命科學學院廣東省水產健康安全養殖重點實驗室，廣東廣州 510631；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南?？?571101）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是世界三大主要對蝦養殖品種之一，也是我國養殖面積最廣、產量最高的養殖蝦類。凡納濱對蝦是一種廣鹽性的甲殼動物，能夠存活于1‰～2‰的微咸水與40‰的海水之間[1]。一些報道認為其最適生長鹽度為18‰～20‰[2-5]。由于凡納濱對蝦鹽度適應性廣，其養殖范圍不斷向內陸擴展，目前甚至在完全淡水的條件下也能養殖成功。但近年來，在低鹽度養殖條件下，生長速度慢、蛻殼緩慢、易發病等問題逐漸突出，嚴重阻礙了凡納濱對蝦養殖業向內陸地區的發展。關于鹽度對蝦類的生長、酶活力、滲透壓影響以及鹽度耐受性的報道已較多[4-7]，血細胞在蝦類生理和免疫過程中發揮重要作用，但鹽度對蝦類血細胞影響的研究報道甚少。流式細胞術是臨床上應用已十分廣泛的細胞水平的先進分析技術，本研究通過應用流式細胞術分析凡納濱對蝦在不同養殖鹽度下的血細胞生理和免疫狀態的變化，以其探討低鹽度對蝦類血細胞的影響及其作用機制，為凡納濱對蝦在低鹽度環境下的健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）購自廣東省廣州市番禺區某養殖場，養殖水體鹽度為5‰。對蝦平均體長為（10.6±1.7）cm，在溫度（24±2）℃、pH值7.9～8.0、鹽度5‰的室內循環水系統中暫養一周后，選取附肢完整、健康狀況良好、處于蛻皮期間的對蝦進行試驗。

1.2 不同鹽度水平的處理

設置兩個養殖鹽度：5‰和20‰，每組設置三個平行。高鹽度水體用日曬海鹽進行調節，初始鹽度為5‰，每天進行2‰的鹽度提升，使對蝦逐漸適應，直至提升至20‰為止。每個桶放水約200 L，放養對蝦30尾，養殖水體一直保持曝氣。在高鹽度組馴化至鹽度20‰后，在實驗室條件下再養殖兩周以保證完全適應鹽度環境。試驗期間每天按3%體重的量投喂某品牌商業飼料（40%粗蛋白質、5%粗脂肪、16%灰分），每天及時吸除糞便和殘餌。

1.3 血細胞懸液制備

在相應的鹽度下養殖兩周后進行取樣。用2.5 ml一次性注射器吸取300 μl預冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/l、檸檬酸鈉8 g/l、氯化鈉4.2 g/l，pH值7.5），然后從蝦的圍心腔和腹血竇抽取等量的血淋巴，置于離心管中，取200 μl用于血細胞總數（Total haemocyte count,THC）的測定，余下部分加入4倍預冷的抗凝劑進行稀釋，用于其它指標的測定。每尾蝦的稀釋血淋巴作為單獨樣品進行檢測，每個指標均測定15尾蝦。

1.4 流式細胞儀

試驗中所用流式細胞儀是美國BD（Becton Dickin?son）公司生產的FACS Calibur，激發光波長為488 nm，通過CellQuest軟件（Becton Dickinson Immunocytome?try Systems,San Jose,CA）來獲取和分析試驗數據。

1.5 血細胞總數的測定

THC根據之前建立的FCM方法進行測定。取未經稀釋的血細胞懸液200 μl，加入10×SYBR Green I（Sigma），室溫避光孵育60 min，用200目篩網過濾后上機檢測。每個樣品上樣1 min，根據劃定的細胞區域，分析并記錄完整細胞的個數，每個樣品讀取3次。根據以下公式進行計算：THC(個/ml)=1 min上樣細胞數(個/min)/上樣速度(ml/min)×樣品稀釋倍數。

1.6 血細胞比例分析

取血細胞懸液200 μl，直接上機檢測，每個樣品的細胞獲得數為10 000個。前向角散射光(Forward light scatter,FSC)和側向角散射光(Side light scatter,SSC)分別反映細胞的大小和顆粒復雜程度，以FCS為橫坐標、SSC為縱坐標作散點圖，根據不同類型血細胞的大小和顆粒復雜度的不同，在散點圖上設門劃定不同的細胞亞群，分析其比例。

1.7 血細胞凋亡率的測定

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測血細胞的凋亡率。試驗操作參考說明書稍作修改。取600 μl血細胞懸液進行離心（800×g，4 ℃、5 min），血細胞重懸于200 μl 1×Annexin V結合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC 和20 μl PI工作液，室溫避光染色 15 min，再加入400 μl 1×Annexin V 結合緩沖液，200目篩網過濾后立即用流式細胞儀檢測。用FL1和第二熒光通道（FL2）分別獲取Annexin V-FITC和PI的熒光數據，在Cell Quest軟件上建立以Annex?in V-FITC熒光強度（FL1）為橫坐標，PI熒光強度（FL2）為縱坐標的散點圖，用十字門劃分各類細胞的區域。細胞總凋亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細胞所占的比例。

1.8 活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量的測定

以DCFH-DA（Sigma）為熒光標記探針檢測血細胞ROS含量的變化。取血細胞懸液200 μl，加入終濃度為10 μmol/l的DCFH-DA，混勻后室溫避光孵育30 min，用200目篩網過濾后上機檢測，每個樣品的細胞獲得數為10 000個。用第一熒光通道（FL1）獲取胞內DCF的熒光數據，在Cell Quest軟件上建立以DCF熒光量（FL1）為橫坐標，細胞數量為縱坐標的單參數直方圖，分析樣品的DCF平均熒光量，胞內的DCF平均熒光量與ROS含量成正比。

1.9 一氧化氮（NO）含量的測定

以DAF-FM DA（Sigma）為標記探針檢測NO含量的變化。取血細胞懸液200 μl，加入終濃度為10 μmol/l DAF-FM DA，混勻后室溫避光孵育60 min，用200目篩網過濾后上機檢測，每個樣品的細胞獲得數為10 000個。用FL1獲取胞內DAF的熒光數據，在Cell Quest軟件上建立以DAF熒光量（FL1）為橫坐標，細胞數量為縱坐標的單參數直方圖，分析樣品的DAF平均熒光量，胞內的DAF熒光量與NO含量成正比。

1.10 非特異性酯酶活力的測定

以二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate,FDA）為標記探針檢測非特異性酯酶活力的變化。取血細胞懸液200 μl，加入終濃度為 5 μmol/l FDA 避光孵育30 min，用200目篩網過濾后上機檢測，每個樣品的細胞獲得數為10 000個。用FL1獲取胞內FDA的熒光數據，在Cell Quest軟件上建立以FDA熒光量（FL1）為橫坐標，細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示，分析樣品的FDA平均熒光量，細胞的FDA平均熒光量與非特異性酯酶活力成正比。

1.11 游離Ca2+含量的測定

以Fluo3-AM（Sigma）為標記探針檢測胞漿游離Ca2+含量的變化。取血細胞懸液200 μl，加入5 μmol/l Fluo3-AM室溫避光孵育30 min，用200目篩網過濾后上機檢測，每個樣品的細胞獲得數為10 000個。用FL1獲取胞內Fluo3的熒光數據，在Cell Quest軟件上建立以Fluo3熒光量（FL1）為橫坐標，細胞數量為縱坐標的單參數直方圖，分析樣品的Fluo3平均熒光量，細胞的Fluo3熒光量與游離Ca2+含量成正比。

1.12 血清酚氧化酶（PO）活力的測定

按上述方法，每尾蝦抽取200 μl血淋巴，800×g、4℃離心10 min，上清為血清，用于PO活力的測定。PO活力依據Huang等[8]的方法進行測定。取20 μl血清，加到880 μl的L-dopa溶液（L-dopa溶于pH值6.6的磷酸鉀緩沖液中，終濃度為3 mg/ml）中，立即用分光光度計測定490 nm下的吸光值，每隔10 s讀取一次，一共讀取120 s。每分鐘OD490增加0.001定義為一個酶活力單位。

1.13 統計分析

結果用“平均值±標準差”（Mean±SD）表示，試驗數據通過SPSS 19.0對數據進行t檢驗分析，P＜0.05確認為顯著性差異，P＜0.01確認為極顯著性差異。

2 結果（見表1～表2）

表1 兩個養殖鹽度下凡納濱對蝦的血細胞狀態

表2 兩個養殖鹽度下凡納濱對蝦的不同類型血細胞比例(%)

如表1所示，在20‰鹽度下養殖的對蝦的THC、酯酶活力和游離Ca2+含量極顯著高于5‰鹽度下的對蝦（P＜0.01），分別是5‰鹽度下對蝦的1.35、1.90倍和1.26倍；兩個鹽度下養殖對蝦的血細胞凋亡率沒有顯著差異（P＞0.05）；在5‰鹽度下養殖的對蝦的ROS和NO含量極顯著高于20‰鹽度下的對蝦（P＜0.01），分別是20‰鹽度下對蝦的1.49倍和1.55倍；20‰鹽度下養殖的對蝦的血清PO活力顯著高于5‰鹽度下養殖的對蝦（P＜0.05）。

血細胞組成比例如表2所示，在5‰鹽度下，凡納濱對蝦的小顆粒細胞比例最高，占54.93%，大顆粒細胞次之，透明細胞最少；在20‰鹽度下，凡納濱對蝦的血細胞組成比例也表現為：小顆粒細胞＞大顆粒細胞＞透明細胞，與5‰鹽度下的對蝦相比，大顆粒細胞和小顆粒的比例分別提高了2.37個百分點（P＜0.01）和5.36%（P＜0.01），透明細胞的比例減少了7.55個百分點（P＜0.01）。

3 討論

3.1 鹽度對血細胞總數和凋亡率的影響

THC是衡量蝦類免疫狀態的重要指標，在正常狀態下，蝦類的血細胞數量會保持在一定的范圍內；而在遭受脅迫或病原體感染的狀態下，THC則往往呈現出下降的趨勢[9-13]。本研究結果發現，在20‰鹽度下，凡納濱對蝦的THC極顯著高于5‰鹽度，約為1.35倍。Gilles等[14]研究顯示圣保羅對蝦(Farfantepenaeus paulensis)血淋巴中血細胞數量隨著鹽度的降低而減少。沈麗瓊等[15]研究顯示15‰～25‰鹽度下養殖的凡納濱對蝦的THC高于5‰～10‰鹽度下養殖的對蝦。這些研究結果與本研究結果基本一致。雖然經過鹽度馴化后，凡納濱對蝦可以在較低鹽度下生存和生長，甚至可以進行全淡水的養殖，但一些研究發現鹽度對凡納濱對蝦的生長性能有顯著影響，認為其最適生長鹽度為20‰[1,4]。由于血細胞在免疫過程中發揮著重要作用，所以THC的下降被認為是免疫力下降的重要體現，導致機體對病原體易感性的增強。本研究結果顯示，5‰鹽度下，對蝦THC較低，表明低鹽度下對蝦的免疫力較差；而在被認為最適生長鹽度20‰的鹽度下，對蝦呈現出較高的血細胞數量，表明適宜的鹽度對蝦的免疫力有正面的調節作用。

研究已發現蝦類在正常生理狀態下，血細胞中存在一定比例的凋亡細胞，這被認為是機體為維持血細胞整體功能，進行新陳代謝的正常表現[16]。當蝦體受到環境急性脅迫或病原體感染時，血細胞的凋亡率會呈現顯著上升。在亞硝酸鹽脅迫下，斑節對蝦血細胞凋亡率上升，從而導致THC的下降[12]。斑節對蝦在受到白斑病毒感染后，血細胞凋亡率顯著上升，蝦體的免疫防御能力受到抑制，對蝦的生存受到威脅[17]。這些研究均表明血細胞凋亡率是體現蝦類免疫狀態的一個重要指標。在本研究中，雖然低鹽度下，對蝦的THC較低，但低鹽度并未顯著影響血細胞的凋亡率，可能是由于對蝦經過長期馴化后，在一定程度上適應低鹽度，使血細胞凋亡率處于正常范圍內。

3.2 鹽度對血細胞組成比例和PO活力的影響

根據大小和顆粒情況，蝦類的血細胞可分為三類：透明細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞[18-19]。不同類型的血細胞有不同的功能，就吞噬功能而言，一些研究認為透明細胞是承擔吞噬作用的主要血細胞類型[20]，但另一些研究則顯示小顆粒細胞和大顆粒細胞的吞噬能力較強[21-23]，目前仍沒用統一的定論；小顆粒細胞和大顆粒細胞負責儲存和釋放酚氧化酶原系統，并有較強的細胞毒活性[18]。筆者以往的研究表明大顆粒細胞擁有很強的ROS和NO產生能力，小顆粒細胞次之，透明細胞產生能力極弱[24-25]；大顆粒細胞的酯酶活力強于小顆粒細胞和透明細胞[24]。由于不同類型血細胞的功能不同，它們的比例或數量可能在一定程度上反映了蝦體的免疫狀態，因此一些研究將不同類型血細胞數量（Ddifferential haemocyte count,DHC）作為蝦類的免疫狀態指標[26]。研究表明環境脅迫或病原體感染均會對蝦類不同血細胞的比例或數量產生影響[26-28]。在本研究中，結果顯示養殖鹽度也對不同血細胞的比例產生影響，與低鹽度相比，在高鹽度下對蝦的小顆粒細胞和大顆粒細胞的比例極顯著提高，尤其是小顆粒細胞，提高了5.36百分點；透明細胞的比例則極顯著減少。根據以往的研究，小顆粒細胞和大顆粒細胞可能在蝦類免疫過程中發揮更為重要的作用[16，24-25，27]。20‰鹽度下，兩類顆粒細胞比例提高可能暗示在此養殖鹽度下蝦類的免疫狀態較好。

酚氧化酶原（proPO）系統是甲殼動物重要的免疫防御系統，儲存于兩類顆粒細胞的顆粒中。顆粒細胞經免疫刺激后，會進行脫顆粒釋放proPO系統相關免疫因子，其中包括了被激活的PO。PO可以將酚轉化為醌，醌再進一步形成黑色素而發揮抗菌殺菌、傷口愈合等作用[29]。本試驗結果顯示，在20‰鹽度下的對蝦的血清PO活力顯著高于5‰鹽度下的對蝦。李華等[7]也研究了三個鹽度對凡納濱對蝦血清PO活力的影響，結果顯示在不同鹽度下適應15 d以后，凡納濱對蝦在18‰鹽度時，血清PO活力最強，4‰鹽度時次之，32‰鹽度時最低，與本研究的結果一致。兩類顆粒細胞是儲存與釋放proPO系統的血細胞類型，在20‰鹽度下，兩類顆粒細胞比例的顯著提高可能是促使血清PO活力升高的原因。

3.3 鹽度對ROS和NO含量的影響

ROS，包括超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等，是一類具有強氧化性的物質，在殺滅和清除病原體的過程中發揮十分重要的作用，是機體起免疫和防御作用的重要物質之一。NO與ROS相似，在病原體等的刺激下，NOS通路會被激活，產生大量的NO，從而抑制或殺滅病原體[30-32]。然而，ROS具有兩面性，在正常狀態下，抗氧化系統的調控使體內ROS的產生和清除能夠很好地調節，達到穩定的動態平衡狀態；當受到機體脅迫作用時，ROS產物和抗氧化防御系統之間的平衡便會被破壞[33]，過量的ROS會對機體自身造成氧化損傷，誘導細胞發生凋亡[26，34]。大量產生的NO也會對機體自身造成損傷，是細胞凋亡的重要誘導因素之一[28]。

本研究結果顯示，5‰低鹽度下對蝦的血細胞ROS含量極顯著高于20‰鹽度，為20‰鹽度下的1.49倍。NO對養殖鹽度的響應與ROS相似，在低鹽度下NO含量較高。低鹽度下產生較多的ROS和NO，推測有兩種可能性：被動產生和主動產生。環境脅迫是誘導機體產生ROS和NO的重要原因[11-12]，低鹽度下較多的ROS和NO可能是由于長期的慢性低鹽度脅迫而被動產生的。雖然較高含量的ROS和NO在抗菌殺菌能力上可發揮更強的作用，在一定程度上彌補血細胞數量不足以及酯酶活性下降所造成的免疫力下降，但較高含量的ROS和NO需要機體調動更多的抗氧化活力，以維持氧化和抗氧化的動態平衡，免于對機體自身造成氧化損傷，因此在低鹽度下，對蝦對抗氧化活力相關的營養素，如VC、VE、銅、鋅、錳、硒等的需求量可能也較高。與適宜鹽度相比，機體需要消耗較多的營養素和能量用于提高抗氧化活力，可能是導致低鹽度下生長較緩慢的原因之一。

3.4 鹽度對酯酶活力的影響

酯酶是溶酶體酶的一種，在血細胞吞噬異物和病原體后的殺菌溶菌以及分解被吞噬物等過程中起重要的作用，是重要的免疫指標之一。另外，一些研究表明，酯酶活力對外界環境的變化較為敏感，因此酯酶活力也可用作分析環境脅迫和環境毒理的重要指標[35]。研究顯示，一些殺蟲劑會抑制牡蠣（Crassostrea gigas）的酯酶活力[36]。Cd2+脅迫會導致斑節對蝦（Penaeus monodon）血細胞酯酶活力下降[13]。本研究發現，與ROS和NO情況相反，對蝦在低鹽度下的血細胞酯酶活力較低，僅為20‰鹽度下的52.6%，表明與適宜鹽度相比，低鹽度下對蝦血細胞的免疫活力有所下降。李華等[7]比較了鹽度為4‰、18‰和32‰條件下凡納濱對蝦血漿多種免疫酶活力，結果顯示，鹽度18‰時免疫酶活力最強。雖然對蝦經過馴化后，能夠在低鹽度下生存和生長，但從上述指標來看，低鹽度可能產生了長期的慢性鹽度脅迫作用，對蝦體產生了一定的不良影響，尤其體現在免疫力上，因此低鹽度環境可能會增加對蝦對某些疾病的易敏感。

3.5 鹽度對胞內游離鈣離子含量的影響

鈣除了構成有機體的骨骼、甲殼等以外，少量Ca2+會存在于軟組織中，發揮各種生理功用，包括參與肌肉收縮、血液凝固、神經傳導、酶的激活、調控細胞凋亡以及膜的通透性等[37-38]。本研究結果顯示，外界鹽度的差異導致了蝦血細胞內游離Ca2+含量發生顯著的變化，高鹽度養殖對蝦的胞內游離Ca2+含量極顯著高于低鹽度養殖對蝦。胞內游離Ca2+含量是細胞凋亡的一個重要指標，在細胞凋亡前期，儲存在內質網內的Ca2+會被大量釋放到細胞質中，胞質內的游離Ca2+含量迅速持續升高，進一步促進凋亡的發生[11]。然而，結合THC、細胞凋亡率等指標來看，可以推測高鹽度下游離Ca2+含量的上升與細胞凋亡無直接關系。已有研究顯示，環境鹽度對水生動物血液的滲透壓會產生顯著影響[39-40]，高鹽度下較高的游離Ca2+含量可能是為了機體維持血細胞胞內滲透壓的平衡。

4 結論

本研究結果顯示，在兩個不同鹽度下（5‰和20‰）養殖的凡納濱對蝦，其血細胞指標存在顯著的差異性。20‰鹽度組的對蝦的血細胞總數（THC）、酯酶活力、小顆粒細胞和大顆粒細胞的比例以及血清酚氧化酶（PO）活力均較高，表明對蝦在20‰鹽度下血細胞免疫力較高。20‰鹽度組對蝦的血細胞胞內游離Ca2+含量較高，表明對蝦血細胞可以通過調節胞內游離Ca2+的含量來維持內外的滲透壓平衡。5‰鹽度組對蝦的血細胞活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）含量均較高，暗示對蝦可能長期遭受慢性低鹽度脅迫，但兩鹽度組對蝦的血細胞凋亡率沒有顯著差異，5‰鹽度下對蝦可能調動了更多的抗氧化活力，以清除過多的ROS和NO。綜上，本研究結果表明，養殖鹽度會顯著影響對蝦血細胞的生理和免疫狀態，在20‰適宜鹽度下，對蝦的血細胞免疫力較強；5‰低鹽度下，對蝦可能遭受慢性低鹽度脅迫，血細胞免疫力較低。