培氟沙星毒性預測與實驗數據比較研究

■武英豪 程林麗沈建忠 胡 燁 劉瑩瑩

(中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

培氟沙星（Pefloxacin，結構式見圖1）為甲基-4-哌嗪喹諾酮類衍生物，屬于第三代喹諾酮類化合物[1]。它是一種高效、低毒、人獸通用的廣譜抗菌藥物，以吸收快、生物利用度好、組織藥物濃度高、體內分布廣、維持時間長為特點，臨床應用主要是其甲磺酸鹽。培氟沙星在動物體內對革蘭氏陰性菌的抗菌活性與第三代頭孢菌素及新氨基糖苷類相似，對衣原體、支原體、某些革蘭氏陽性菌也有一定的抗菌作用[2]。它通過干擾DNA的復制以及菌體蛋白的合成而發揮抑制或殺滅細菌的作用[3]。

毒性研究是對獸藥進行安全性評價的重要內容。傳統的毒理學評價方法一般包括三性（急性、亞慢性、慢性毒性）試驗和三致（致突變、致畸、致癌）試驗，以預測新獸藥的安全性。這些評價方法都采取傳統的毒理學試驗進行[4-5]。而近年來定量構效關系(QSAR)逐漸成為一項分析化合物的藥理和毒理性質非常有用的方法。它借助分子的理化性質參數或結構參數，以數學和統計學手段定量研究有機小分子與生物大分子相互作用，構建相關預測模型，測定類似結構化合物的藥理和毒理性質，在藥物設計研究中發揮重要的作用。而在對已有藥物的研究中目前還少見應用[6-8]。

圖1 培氟沙星結構式

因此，本研究的目的是利用計算機輔助藥物設計技術，對培氟沙星進行毒性預測，分析和討論各個毒性參數與文獻發表的傳統實驗數據的吻合度和差異，以期能為該藥的毒理學研究和食品安全性評價提供有力的參考和佐證。

1 材料與方法

試驗以量子力學、分子力學、分子動力學、定量構效關系、分子與結構生物學、化學生物信息學、計量化學等為理論基礎，在Windows XP操作系統(美國微軟公司）中安裝ADMET Predictor 6.5商業軟件進行毒性預測。

2 測定方法

2.1 急性毒性測定

進行LD50值預測和比較分析。大鼠的急性毒性模型建立在藥物對大鼠的LD50實驗值的基礎上，以mg/kg級計量口服給藥的化合物對大量的大鼠進行試驗，獲得7 510種具有獨特的毒性識別位點的化合物的LD50值，進行pLD50或以mol/kg單位的LD50的負對數值ANNE模型法二維和三維模式建模[9]。急性毒性參數TOX_Rat的預測值用半數致死濃度LD50表示，單位為mg/kg。對于大多數藥物分子，TOX_Rat的預測值應大于或等于300才能判定為無急性毒性。

2.2 皮膚過敏性測定

建模數據來自298個化合物的小鼠局部淋巴結試驗（LLNA）結果。在二維模型構建過程中抽取20%的化合物用作訓練集，而在三維模型構建中則抽取30%的化合物，2D模式和3D模式下實驗值與預測值的相關性依次為92.1%和87.6%。用致敏性或非致敏性來表示皮膚過敏性參數TOX_SKIN。EC3是LLNA的端點。通過與陰性對照組比較，將能使大鼠體內產生淋巴結細胞增殖刺激作用的化合物最低濃度的3倍劑量用來區分致敏作用和非致敏作用?；衔锞哂衅つw致敏性的標準是其EC3值≤10%，EC3值大于10%則被認為無皮膚致敏性。

2.3 致癌性測定

分別進行大鼠致癌性和小鼠致癌性測定。大鼠和小鼠ADMET Predictor致癌性定量構效關系模型建立在CPDB數據庫的基礎上，擁有較好的有效性。以半數致癌濃度TD50來表示致癌性大鼠模型參數TOX_BRM_Rat，單位為 mg/(kg·d)。在整個生命期間50%種群數量的大鼠產生腫瘤細胞時口服化合物的劑量稱之為TD50。大多數藥物分子的TOX_BRM_Rat預測值大于或等于4。以半數致癌濃度 TD50來表示致癌性小鼠模型參數TOX_BRM_Mouse，單位為 mg/(kg·d)。在整個生命期間50%種群數量的小鼠產生腫瘤細胞時口服化合物的劑量稱之為TD50。大多數藥物分子的TOX_BRM_Mouse預測值大于或等于25。

2.4 對染色體變異的影響測定

進行是否誘導產生染色體變異的預測和比較分析。預測模型來自于1 407種化合物的染色體變異毒性分析值構建的神經網絡集成模型。訓練集數據毒性結果的得出采用的是傳統的染色體突變試驗。致染色體變異可能性參數為TOX_CABR，其預測結果為“是”和“否”兩種。

2.5 生殖毒性測定

進行生殖毒性的預測和比較分析。軟件的建模數據來自116種被認為具有生殖毒性的化合物數據。建立的分類模型先對254種訓練集/毒性集化合物進行分析，之后再對38種實驗數據集分析，其結果均獲得了87%以上的相似度。生殖毒性參數TOX_REPR的預測結果為“是”和“否”兩種。

2.6 致突變性測定

進行致突變作用的預測和比較分析。共用10株不同沙門屬的Ames試驗進行致突變性參數TOX_MUT_***測定。10個TOX_MUT_***的模型均為定性測定，這種模型的測定結果有“陽性”和“陰性”兩種。致突變性風險評估參數TOX_MUT_Risk可以在通過對化合物的TOX_MUT_***預測結果進行綜合打分之后進一步獲得。該值對于大多數藥物分子而言，應小于或等于2。10株沙門氏菌見表1。

表1 致突變性使用的10株沙門氏菌

3 結果分析與討論

作為藥物研究中一個廣泛的課題，藥物的化學結構與生物活性(包括藥理和毒理)之間的關系一直備受關注。藥物小分子與生物大分子的物理化學性質和化學結構間相互適配，進而藥物在機體內與相應的部位發生作用，產生生物活性。藥物分子結構的改變，其活性發生強度和活性類型會相應改變。通過對構效關系的研究，建立二者之間變化的規律性，以此可以對類似化合物進行預測。將由此得到的預測結果與實驗數據進行比較，則能從藥物的化學結構的角度為該藥物的毒理學評價提供更多、更可靠的佐證。

3.1 培氟沙星的急性毒性比較分析

急性毒性是衡量化合物毒性的重要指標?；衔锏募毙远拘詳祿趧游镄栽囼炛幸话阒复笫蟮陌霐抵滤罎舛萀D50。聯合國世界衛生組織為方便對急性毒性進行評價，推薦了一個五級標準。在此分級標準的基礎上，一種與此基本相同但更具體的6級標準由我國提出。該標準規定LD50值（mg/kg）：＜1，6級，極毒；1～50，5級，劇毒；51～500，4級，中等毒；501～5 000，3級，低毒；5 001～15 000，2級，實際無毒；＞15 000，1級，無毒。判定化合物為無急性毒性在本研究使用的預測軟件的參數要求是TOX_Rat值應大于或等于300。軟件測得培氟沙星的大鼠急性毒性為331.58 mg/kg，按預測軟件的標準，培氟沙星TOX_Rat預測值≥300 mg/kg，沒有急性毒性。按我國的分級標準，其毒性值位于51～500的范圍，屬中等毒性。也就是說，通過化合物的結構、理化性質等參數建立起的該數學模型預測結果用我國傳統的毒性分級標準分類屬中等毒性。

Sridevi等（2002）[10]研究了培氟沙星對幼犬的毒性，結果表明，以10 mg/kg體重給藥時，給藥方式為一天兩次，連續30 d給藥，最后未發現明顯的毒性作用。Ashish等（2000）[11]研究了培氟沙星對肉用仔雞的毒性，測得的LD50為1 025 mg/kg。Af等（2015）[12]所做的實驗發現，新型氟喹諾酮類對BALB/C小鼠模型的急性毒性的LD50≥5 000 mg/kg。史曉麗等（1998）[13]以昆明種小鼠進行急性毒性試驗，20只小鼠飼養數日，禁食一夜，于翌晨稱重，隨機分為4組(雌、雄各半)，最大劑量為2 000 mg/kg體重，按等比級數遞減，經口一次給藥，在一周內觀察中毒癥狀，記錄各組的死亡率，用移動平均法計算LD50和95%的可信限。測得甲磺酸培氟沙星對小鼠的急性毒性經口LD50為1 690 mg/kg(1 326～2 148 mg/kg)。采用FDA頒布的動物與動物之間劑量換算方法，將小鼠的實驗結果換算成大鼠的LD50劑量為845 mg/kg,與預測值331.58 mg/kg有差距。造成差距的原因可能是，預測結果建立在化合物的化學結構和理化參數的基礎上，而化合物的脂溶性(logP)、水溶性(Sw)和滲透性(Peff)也是影響化合物毒性的重要因素[9,14]。在培氟沙星的實際應用過程中，后面這些因素極大地降低了藥物的毒性作用。

3.2 培氟沙星的皮膚過敏性比較分析

皮膚致敏性屬于急性毒性的一種。分析預測化合物是否會產生皮膚過敏反應，TOX_SKIN采用LLNA，其預測值用致敏性或非致敏性表示。采用軟件預測結果認為，培氟沙星無致敏性。毛永利等(2007)[15]進行了復方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑（每枚重10 mg，含原藥量1 mg）的豚鼠皮膚過敏性實驗。結果表明，緩釋牙栓組動物自給藥72 h內未出現紅斑及水腫，與空白對照組無差異；基質組無致敏現象；陽性對照組動物皮膚受試區自激發給藥6 h后，有明顯輕度紅斑出現，無水腫，致敏率100%。由此可見緩釋劑不產生致敏作用[16]。該報道的實驗值與軟件預測值一致，進一步佐證了培氟沙星不產生皮膚致敏性。

3.3 培氟沙星的致癌性比較分析

大鼠致癌性試驗和小鼠致癌試驗為目前致癌性的主要表征。大鼠和小鼠服用某些化學物質后可以誘導癌癥。同種化學物質對不同體型的鼠的致癌效果不同，部分化學物質，尤其是一些在大鼠模型中呈陰性的獸用化學品，在小鼠模型中則有誘導肝臟腫瘤的毒性。不用考慮化學物質的相關性和基礎機理，不管何種反應現象出現，只要化學物在任一測試中測出具有誘導癌癥的毒性，則被認為是致癌物，且即可橫向推得結論認為該化學物質對人類也存在致癌風險。

ADMET Predictor對兩種試驗結果均進行了相應的數學預測。結果表明：培氟沙星大鼠模型的半數致癌濃度為2.39 mg/(kg·d)，小于大鼠模型無致癌性的最低值，預測培氟沙星對大鼠有致癌性。培氟沙星小鼠模型半數致癌濃度為139 mg/(kg·d)，符合小鼠模型無致癌性的參數要求，預測培氟沙星對小鼠無致癌性。

3.4 培氟沙星對染色體變異的比較分析

通過預測獲得培氟沙星沒有致染色體變異的可能性。劉寧（2011）[17]采用健康成年昆明小鼠進行染色體突變實驗。按小鼠對藥物的最大耐受量10 g/kg為最高給藥劑量進行灌胃，依次為5、2.5 g/kg以及1.25 g/kg。單次給藥24 h后取胸骨骨髓擠壓制片，油鏡計數嗜多染紅細胞中的微核數，計算微核誘發率和幼紅細胞之比。結果認為，復方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑不引起小鼠骨髓微核增多，說明此藥對哺乳類動物細胞染色體無影響，不引起染色體損傷而導致遺傳毒性。該實驗結果與軟件預測結果相符。

3.5 培氟沙星的生殖毒性比較分析

軟件預測得出培氟沙星沒有生殖毒性，并且不產生雌雄激素受體結合毒性。董正謀等（2011）[18]對雌性大鼠根據體質量每天按1、4、8 g/kg的劑量灌服復方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑處理，發現雌性大鼠從交配前至胚胎著床期服用該藥對其一般情況、交配能力、受孕力、子宮和早期胚胎的黃體數、著床數、活胎數、死胎數、吸收胎數均無不良影響，而高劑量可引起卵巢質量減輕、系數減小和形態學改變，因此認為該藥對雌性大鼠無生殖毒性。對雄性大鼠的相關實驗則表明，藥劑處理對其一般情況、交配能力和生育能力無不良影響，而高劑量可引起大鼠體質量減輕，睪丸、附睪質量減輕系數減小，精子活動力降低、數目減少和畸形率升高，同時導致睪丸、附睪組織病理學改變[19-20]，即藥物對雄性大鼠亦無生殖毒性。

3.6 培氟沙星致突變性分析

Ames試驗是一個短期的細菌回復突變試驗，也是目前微生物檢測藥物致突變最常見的方法，它能檢測多種因化學誘導致遺傳損傷的可能使人類致癌的化合物。判斷受試藥物有無誘變性是依據加入被測藥物平皿中回變生長的菌落數并與自發對照平皿中的菌落數相比較得出的，即在本試驗中所選用的TA系列菌株是組氨酸合成缺陷型菌株，在組氨酸含量微小的培養基上，這種細菌僅能分裂幾次，只能形成背景，不能形成菌落。當這些菌株被誘變劑作用之后，在一定條件下，就可能發生回復突變而變成具有野生型生物學特征的原養型菌株，這些菌株就可在組氨酸缺乏的情況下，應用培養基中所含有的其他成分自我合成組氨酸，使得可以繼續生長分裂最終形成菌落[21]。

劉寧（2011）[17]做的致突變性的實驗結果表明：復方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑不存在致突變性。在有無代謝活化劑S9的情況下，其各劑量組與陰性對照組均無顯著性差異，而經陽性誘導劑誘導的回復突變的菌落數目均遠大于陰性對照組的2倍以上，呈明顯的陽性結果，且活化平板摻入試驗中菌落回變數并未比非活化平板摻入試驗有明顯增加，因而該藥物無致突變性。軟件預測培氟沙星的致突變性為3，即有少量的致突變性，與實驗的不致突變相矛盾?？赡苁怯捎趯嶒炈玫纳抽T菌的菌株特點與軟件所設定的不同，并且試驗中加入了活化系統。

4 結論

預測培氟沙星是否具有急性毒性，軟件的預測值為331.58 mg/kg,根據軟件的評估，只要預測值大于或等于300 mg/kg,即可說明測定的化合物無急性毒性。但是根據我國對急性毒性評價標準，331.58 mg/kg屬于51～500，四級，中等毒性。文獻查找的結果是培氟沙星的急性毒性的值為1 690 mg/kg，換算后的數據與真實值的差距造成的主要原因可能是大鼠和小鼠的差別。培氟沙星是否會導致皮膚過敏，軟件預測為nontoxic，即該化合物不會導致皮膚過敏，和文獻查找的數據一樣，因此可以說軟件對結果進行了正確的預測。

預測培氟沙星是否具有致癌性，根據實驗對象的不同，軟件預測大鼠的TD50為2.39 mg/(kg·d)，小于無致癌性的最低值4 mg/(kg·d)，所以預測培氟沙星對大鼠有致癌性。軟件預測小鼠的TD50為139 mg/(kg·d)，大于小鼠無致癌性的最低值25 mg/(kg·d)，所以預測培氟沙星對小鼠無致癌性。因為目前為止并未找到相關文獻的佐證，所以軟件對結果是否進行了正確的預測不得而知。

預測培氟沙星是否具有生殖毒性，軟件預測無生殖毒性。文獻記載的實驗結果為無生殖毒性，但是高劑量組會對一系列的生殖器官和相關系數造成不良影響。從很大程度上說可以認為軟件對結果進行了正確的預測。

預測培氟沙星是否具有致突變性，軟件預測該化合物具有小可能的致突變性，與文獻報道的無致突變性相矛盾。造成這種不一致的原因可能是由于實驗所用的沙門菌的菌株特點與軟件所設定的不同，并且試驗中加入了活化系統。所以針對致癌性軟件的預測不是很準確的。