化學發光緊密內插法快速測定飼料中的微量鉻

■高向陽 王方方

（鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南鄭州 450064）

鉻是家畜及畜禽正常生長和代謝所必需的元素,能刺激糖原合成酶和增強胰島素的活性[1]，并參與機體內多種營養物質的新陳代謝，提高繁殖性能，降低膽固醇含量[2],改善肉與蛋品質[3]。動物飼料中添加鉻可以抗應激、調節免疫、提高瘦肉率和產仔性能[4-6]。若飼料中的鉻含量不足，會造成機體內糖原生物合成緩慢以及葡萄糖含量升高。因此，研究飼料中鉻的含量具有重要的現實意義。

飼料中測定鉻的方法有原子吸收法[7]、分光光度法[7-8]、原子發射光譜法[9-10]等，原子吸收法和原子發射光譜法儀器昂貴，分光光度法樣品灰化時間長,過程繁雜。流動注射化學發光(Chemiluminescence，CL)測定鉻的含量，具有儀器操作簡單、自動化程度高、分析速度快、試劑用量少、靈敏度高、精密度好、線性范圍寬、檢測限低等優點[11],但是若用標準曲線法定量，需配制5～7個標準系列溶液，耗時長，且存在一定的作圖誤差。由于標準曲線繪制時的溫度、濕度、大氣壓、儀器等工作條件，與樣品測定時常不相同，用之前繪制的標準曲線確定當前樣品的測定結果，會引入一定的誤差，需及時測定空白、校正或重新繪制標準曲線，麻煩、費時，給工作帶來不便。目前，尚未見化學發光緊密內插法快速測定飼料中的微量鉻的報道。緊密內插法也稱雙標準夾心法或雙標準比較法[11]，該法利用濃度大（ρ1）、?。é?）的兩個標準溶液，將待測試液（ρX）夾在其中，要求ρ1＞ρX＞ρ2。在相同條件下測定，濃度與測定信號有正比關系，依此完成定量分析。該法已在環境監測中有所闡述[12]，但用化學發光法測定食品中的鉻含量未見文獻報道。本文將流動注射、化學發光技術和緊密內插法結合，使各自的優點得到充分發揮，無需繪制標準曲線和測定空白溶液，工作效率大大提高，為飼料中鉻的測定提供了新的分析技術，具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

551乳豬配合飼料、JD830乳豬濃縮飼料、JD888仔豬濃縮飼料，由鄭州華測檢測技術股份有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

XT-9900A型智能微波消解儀/萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）、IFFM-E流動注射化學發光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限責任公司）、DL-1電子萬用電爐（北京市永光明醫療儀器有限公司）、雷磁PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

硝酸（洛陽市化學試劑廠），30%過氧化氫、EDTA（天津市致遠化學試劑有限公司），鹽酸（洛陽昊華試劑有限公司），氫氧化鈉（天津市德恩化學試劑有限公司），98%魯米諾（阿拉丁工業公司），氯化鉻（CrCl3·6H2O，AR，北京雙環化學試劑廠）。

1.25×10-2mol/l魯米諾儲備液：準確稱取0.276 9 g魯米諾于50 ml燒杯中，用0.1 mol/l NaOH溶液溶解并定容至250 ml的棕色容量瓶中，用時逐級稀釋。

0.250 0 mg/ml Cr3+標準溶液儲備液：準確稱取0.128 1g CrCl3·6H2O于50 ml的小燒杯中，加水溶解,用鹽酸調pH值至2.00，移至100 ml容量瓶,用pH值2.00的鹽酸定容，用時逐級稀釋。

0.1 mol/l EDTA：準確稱取EDTA 3.722 4 g于50 ml的小燒杯中，加熱溶解，移至100 ml容量瓶中定容。

0.04 mol/l H2O2：移取30%H2O20.40 ml于100 ml容量瓶中，加入1 ml 0.1 mol/l EDTA，用水定容至刻度。

以上試劑均為分析純(AR)，實驗所用水均為怡寶純凈水(電導率為2.86 μS/cm)，玻璃儀器用硝酸（1+5）浸泡6～8 h，用純凈水沖洗3遍后投入使用。

1.3 儀器工作條件

流動注射化學發光儀工作流程如圖1所示，按說明書安裝、預熱、清洗管道后，在負高壓450 V,增益1時，用Luminol-H2O2-Cr3+化學發光體系，按表1設定的參數運行。

圖1 流動注射化學發光流程

表1 IFFM-E流動注射化學發光分析儀的參數

1.4 測定方法

1.4.1 測定原理

根據三價鉻濃度與發光信號呈正比的關系，選取濃度大小不同的兩個標準溶液，將試液的濃度控制在兩個標準溶液之間，在完全相同的條件下進行測定，由測得的相對發光值和兩個標準溶液的濃度值，按（1）式求得被測試液中鉻的濃度：

式中：ρx——被測試液中鉻的濃度(mg/ml)；

ρ1——高濃度鉻標準溶液的濃度(mg/ml)；

ρ2——低濃度鉻標準溶液的濃度(mg/ml)；

I1——ρ1的相對發光值；

I2——ρ2的相對發光值；

Ix——被測鉻試液的相對發光值。

由（1）式可知，由于測定的是信號改變量所相當的濃度改變量，無需測定空白信號和繪制標準曲線，操作方便，結果計算簡單，測定快速，工作效率較高。

1.4.2 測定步驟

樣品于研缽中研至過60目尼龍篩，置于廣口瓶中保存。稱取樣品0.200 0 g（稱準至0.000 1 g）于消解罐中，加9 ml硝酸和1 ml 30%過氧化氫，按表2進行消解，冷卻后，將消化液移至燒杯中，用少量水洗滌消解罐2～3次，洗滌水并入燒杯，加熱趕酸至溶液近干后，加入45 ml水、5 ml亞硫酸微沸10 min[13]，冷卻后在酸度計上用2.4 mol/l鹽酸調節pH值至2.00，移至100 ml容量瓶中，用pH值2.00的鹽酸稀溶液定容，混勻備用。移取5.00 ml于50.00 ml容量瓶中，用pH值2.00的鹽酸稀溶液定容至刻度，混勻待測定。

表2 微波消解儀的參數設置

根據緊密內插法的測定原理，選取pH值2.00濃度為2.50×10-4mg/ml和2.50×10-6mg/ml的兩個Cr3+標準溶液，與待測定試液在相同的條件下測定其相對發光值。根據（1）式，求得試液中Cr3+的質量濃度ρX。按（2）式計算樣品中Cr3+的質量分數：

式中：W——樣品中Cr3+的質量分數(mg/g)；

ρx——被測定試液中Cr3+的濃度(mg/ml)；

V——樣品消解后定容的總體積(ml)；

m——稱取樣品的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 魯米諾溶液濃度的影響

分別移取1.25×10-2mol/l的魯米諾儲備液0.40、0.80、2.40、4.00、5.60、7.20、8.00 ml于100 ml的容量瓶中，用pH值12.45的NaOH溶液定容至刻度，搖勻后在其他條件固定不變時依次測定，結果見表3。

表3 魯米諾濃度的影響

由表3知，相對發光值隨魯米諾濃度不斷增大，當濃度大于5.0×10-4mol/l時，相對發光值增加緩慢，從節省試劑、降低成本方面考慮，選擇5.0×10-4mol/l的魯米諾溶液試驗。

2.2 魯米諾溶液酸度的影響

分別移取1.25×10-2mol/l的魯米諾儲備液2.00 ml于7個50 ml的容量瓶中，用pH值為11.00、11.30、11.60、11.90、12.20、12.50、12.80的NaOH溶液對應定容至刻度，搖勻后在其他條件不變時進行單因素試驗，結果見表4。

表4 pH值對反應體系的影響

由表4知，酸度對發光體系影響較大，魯米諾溶液pH值為11.90時，測定體系有最大的相對發光值。

2.3 待測溶液pH值的影響

分別移取0.250 0 mg/ml Cr3+標準溶液儲備液50 μl于8個100 ml的容量瓶中，用pH值為1.80、2.00、2.30、2.50、2.80、3.00、3.20、3.40的稀鹽酸溶液對應定容至刻度，搖勻后在其他條件不變時依次測定，結果見圖2。

圖2表明，Cr3+溶液pH值為2.00時有最大相對發光值。

圖2 Cr3+標準溶液pH值的影響

2.4 H2O2溶液濃度的影響

魯米諾溶液濃度為5.0×10-4mol/l（pH值11.90）時，依次用0.01 mol/l至0.14 mol/l的H2O2對1.25×10-4mg/ml Cr3+標準溶液（pH=2.00）進行測定，結果如表5。

由表5可知，H2O2溶液濃度為0.02 mol/l時，相對發光強度(即相對發光值)最大。

表5 H2O2溶液濃度的影響

2.5 檢出限和定量限

在負高壓820 V、增益為1，魯米諾溶液為5.0×10-4mol/l（pH值11.90），對1.25×10-2μg/ml的Cr3+標準溶液（pH值2.00）進行11次平行測定，結果見表6。

表6 檢出限、定量限的測定結果

由表6可知，按三倍標準偏差計算鉻的檢出限為0.83 ng/ml，按十倍標準偏差計算鉻的定量限為2.77 ng/ml。

2.6 標準曲線的繪制

準確移取 2.50 μg/ml的Cr3+標準溶液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、10.00 ml，分別置于9個100 ml容量瓶中，用pH值2.00的稀鹽酸溶液定容至刻度，分別配制成0.000、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100、0.125、0.150、0.250 μg/ml的系列標準溶液，在完全相同的條件下依次測定。以扣除空白后的相對發光值為縱坐標，以Cr3+標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果見圖3。

由圖3可知，線性回歸方程為y=1 177.2x-81.492，相關系數r=0.999 0，線性關系良好。

圖3 鉻的標準曲線

2.7 加標回收率

選擇乳豬濃縮飼料JD830為樣品，向樣品中分別加入0.50、2.00、10.00 ml的2.50×10-6mg/ml Cr3+標準溶液，按照測定方法進行回收率試驗，結果見表7。

表7 加標回收率

由表7結果表明，加標回收率在94.4%～104.0%之間。

2.8 對照測定結果及精密度

在優化條件下，分別用標準曲線法和緊密內插法對同一樣品各進行3次平行測定，檢驗無可疑值后取平均值報告，同時計算標準偏差S和相對標準偏差RSD,結果見表8。

根據表8所得數據，對兩種方法進行顯著性檢驗[14]可知，兩種方法的精密度無顯著性差異，也不存在顯著的系統誤差，結論的置信度為95%。

表8 兩種方法的比較

3 結論

將微波快速溶樣技術、流動注射化學發光技術與緊密內插分析方法結合，使他們的優點得到了充分發揮。采用該方法定量測定飼料等生物樣品中的鉻含量，無需繪制工作曲線和測定空白溶液，具有操作簡便、成本低廉、快速靈敏、結果計算簡單的顯著優點，方法的檢出限為0.83 ng/ml，定量限為2.77 ng/ml，加標回收率在94.4%～104.0%之間，相對標準偏差RSD≤1.30%。與標準曲線法對照測定，在置信度為95%時，通過F檢驗和T檢驗表明，兩種方法的測定結果間不存在顯著的偶然誤差和系統誤差，為飼料中的鉻提供了一種簡便、新穎、靈敏、準確的測定方法，有一定的推廣應用和科學參考價值。