免疫系統與卵巢及卵巢生殖干細胞相關性的研究進展①

梁 夏 李小燕 毛 自 曹 璇 鄭月慧

(衢州職業技術學院，衢州324000)

免疫系統與卵巢及卵巢生殖干細胞相關性的研究進展①

梁 夏 李小燕②毛 自②曹 璇②鄭月慧②

(衢州職業技術學院，衢州324000)

免疫系統作為機體最重要的保衛系統，其功能的維持有賴于免疫細胞及免疫相關分子發揮相應的效能，這其中任何一個成分缺失或功能不全都可導致機體免疫功能障礙，并由此引發疾病?？茖W家已證實，生殖系統疾病與免疫系統相關細胞的功能異常存在著緊密聯系，如子宮內膜異位癥的發生與T細胞、自然殺傷細胞和單核/巨噬細胞介導的細胞免疫功能障礙具有相關性[1]?，F有觀點認為，機體各組織功能的建立和調控是依賴以免疫系統為主的組織控制系統(Tissue control system，TCS)來完成的[2]。TCS的功能在個體發育的早期即被建立[3-5]，大約在孕中期末發育完全，由免疫系統相關組分、血管內皮細胞和自主神經組成，其中單核細胞衍生細胞(Monocyte-derived cells，MDCs)、T細胞和B細胞等免疫細胞在調控組織功能中具有舉足輕重的地位[2]。該理論認為TCS發育完全后，作為其重要組成部分的MDCs能夠適時地發出“停止效應(stop effect)”，使組織細胞的分化停止并保存在某一合適的分化狀態，“停止效應”的實質就是避免組織細胞過度分化，機體功能的維持依賴于MDCs發出適當的“停止效應”。隨著年齡的增長，機體免疫系統發生退化，MDCs發出“停止效應”的功能隨之減退，從而引起機體各個組織(如卵巢)功能的下降[6]。

1 免疫系統與卵巢功能密切相關

1.1 免疫系統影響卵巢功能 二十世紀七十年代，關于免疫系統與卵巢功能的研究就已取得很大的進展：Nishizuka等[7]對2～4 d的新生小鼠行胸腺摘除術后發現，在后續培養中該類小鼠體內出現卵巢發育不全的現象；Russell等[8]利用正常雌鼠的胸腺細胞成功抑制了小鼠體內經環磷酰胺和X線誘導的超排卵現象；1979年，Bukovsky[9]首先提出免疫系統在調節卵巢功能中發揮重要作用。近年來隨著研究的進一步深入，新的成果不斷涌現：科學家給予新生裸鼠肌肉注射胸腺素，該類裸鼠發育到成年期，血清中的卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)可維持穩定水平，并且能夠有效抑制裸鼠卵巢發育不全地發生[10]；此外，研究者還發現，隨著年齡的增長，機體免疫系統不可避免地發生退化，這種退化首先表現為胸腺功能受損，其次就是卵巢功能的衰退[5]。眾多成果表明，機體免疫系統與卵巢功能之間存在著密切聯系。

1.2 免疫系統與卵巢內分泌系統的相互作用 眾所周知，下丘腦-垂體系統通過其與卵巢之間的相互作用調控著卵巢的功能。垂體在下丘腦所產生的激素控制下分泌FSH和LH，二者直接控制卵巢的周期性生理變化。而免疫系統相關細胞和分子存在于下丘腦-垂體-卵巢軸的各個水平，故推測免疫系統也可調控卵巢的發育和衰退。早在二十世紀八、九十年代，免疫系統與卵巢的關系就已被發現，免疫細胞及其產生的細胞因子與下丘腦-垂體-卵巢軸的激素水平相互作用，參與卵巢組織分化、發育的全過程。

研究發現，細胞因子是卵泡發育及排卵過程中必不可少的因素[11]。排卵前的卵泡中存在著較多具有雙相活性的腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)，即FSH刺激顆粒細胞產生TNF-α，從而起到抑制前列腺素F2α(Prostaglandin F2α,PGF2α)產生的作用，同時TNF-α又能在排卵前刺激PGF2α暫時性提高，從而有利于排卵發生[12]。通過對小鼠卵巢的研究發現，TNF-α對FSH誘導的芳香酶活性及其后的孕激素水平提高均有抑制作用，因而進一步促進排卵發生[12]。白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)，能夠減少顆粒細胞中LH受體的產生，從而降低孕激素分泌。此外，IL-1還參與排卵及卵母細胞發育過程[13]。對大鼠卵巢的體外研究發現，轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)能夠抑制卵泡的發育，同時TGF-β在維持原始卵泡的數量中發揮重要生理作用[14]。

月經周期中的黃體是哺乳動物體內壽命最短的組織，若卵子未受精，則黃體在兩周內就會萎縮成為白體。研究者已在多種實驗動物的黃體組織中發現了巨噬細胞，并提出巨噬細胞及其分泌的細胞因子如TNF等參與黃體的發育和退化[15]。在幼稚黃體和發育黃體中，TNF可刺激血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌，促進新生血管發生，從而有利于黃體的發育和成熟[15]。而在不斷探索黃體生理機制的過程中發現，TNF等細胞因子在退化黃體中存在更多，幼稚黃體中的TNF促進黃體的生長，而退化黃體中較高濃度的TNF卻參與細胞凋亡和黃體衰退，其中的機制尚不清楚[16]。

2 免疫系統參與卵巢生殖干細胞的增殖和分化

在成年哺乳動物的卵巢中，原始卵泡和卵母細胞的起源已經爭論了近百年。2004年，Johnson等[17]首次發現成年小鼠卵巢中存在具有有絲分裂活性的生殖細胞，并認為雌性小鼠卵巢從出生后到成年都存在卵母細胞的更新。這一觀點的提出打破了傳統的“固定卵泡池”理論。自此，卵巢生殖干細胞(Ovarian germline stem cells,OGSCs)的研究受到廣泛關注。

OGSCs是覆蓋在卵巢表面的上皮細胞?，F已在多種哺乳動物的卵巢表面上皮(Ovarian surface epithelium,OSE)內檢測到成體干細胞和減數分裂相關基因的特征性標志物，如Oct-4(生殖干細胞特異性的轉錄因子)、 vasa(生殖細胞特異性基因)、scp3(聯會復合體3，減數分裂標志基因)和端粒酶(僅在生殖干細胞中有表達，隨細胞分化后表達喪失)等[18-21]，因此OGSCs又有“生殖上皮”之稱。

隨著研究的進一步深入，2009年，Zou等[22]將綠色熒光蛋白(GFP)標記的小鼠OGSCs植入不孕小鼠體內，使不孕小鼠成功產下帶有GFP標記的子代。2012年，White等[23]從功能正常的成人卵巢中提取生殖干細胞，并將其分別植入到人類的卵巢組織和免疫衰竭的小鼠體內，均觀察到新的原始卵泡的形成。盡管有關OGSCs的研究取得了很大進展，在生殖醫學領域關于OGSCs存在與否仍然具有很大爭議：一些學者認為，我們所謂的OGSCs在小鼠卵巢內僅以少數存在，并且這些干細胞在體內不具有分裂增殖活性，因此無法補充原始卵泡池的耗竭[24,25]。此外，OGSCs的體外培養存在數量少、增殖緩慢等問題，因而探索OGSCs的增殖分化機制尤為重要和緊迫。本實驗室工作人員也已經成功分離培養了OGSCs，并致力于研究該細胞的體內外調控機制[26,27]。

2.1 免疫系統參與卵巢生殖干細胞巢(OGSCs Niche)的組成 OGSCs是來自于卵巢皮層的雙潛能干細胞，能夠分化為卵巢生殖細胞和原始顆粒細胞[26]，這一過程是通過卵巢生殖干細胞巢(OGSCs Niche)來調控的。Bukovsky[28]提出，OGSCs的周圍存在著調控其功能的Niche，而免疫系統相關細胞和分子是OGSCs Niche的重要組成部分。OGSCs Niche在胎兒發育的早期就已建立，在胎兒時期由卵巢定型的MDCs和T細胞、血管內皮細胞等組成，而在成人則由初級MDCs(CD14+MDCs)、活化的MDCs([HLA-DR]+ MDCs)及T細胞等組成，免疫系統作為其重要組成部分很可能參與調控OGSCs的增殖和分化。

Bukovsky等[6]研究發現，免疫系統相關細胞和分子通過OGSCs Niche參與OGSCs的不對稱分裂，促進生殖細胞的產生、分裂增殖和遷移，參與生成新的顆粒細胞及胎兒和成人的原始卵泡，并促進原始卵泡的生長以及優勢卵泡的形成，從而維持卵巢的正常功能。此結論基于以下現象：①在研究人類胚胎和胎兒OGSCs形成卵泡的機制時發現，卵泡的發育通常始于卵巢皮質的最內層，靠近卵巢網，卵巢網是卵泡發育所必需的[29,30]。而卵巢網通道中含有免疫系統相關的細胞如初級MDCs，它們能夠分化成大量活化的MDCs移行于網狀通道中，并與固有的MDCs相互作用。此外，抑制性T細胞(CD3+T細胞)和細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)也存在于網狀通道內。②OGSCs在轉化成生殖細胞時，需要接受來自于卵巢定型的骨髓細胞(Ovary-committed bone marrow cells，OCMT)，如MDCs和T細胞的刺激[31]。OGSCs通過不對稱分裂產生一個定向分化的生殖細胞和一個子代OGSC，該生殖細胞進一步分化為卵母細胞，并移行到鄰近的上皮層和皮層血管內。在隨血液循環的過程中，生殖細胞體積增大并與上皮顆粒細胞巢結合形成原始卵泡[32]。生殖細胞產生和移行的過程始終伴隨著免疫系統相關細胞的參與，如初級 MDCs參與OGSCs的不對稱分裂；CD8+T細胞伴隨生殖細胞的對稱分裂，這一過程也涉及初級MDCs的參與，除此之外初級MDCs還參與生殖細胞進入上皮層的過程；活化的MDCs則與生殖細胞的移行密切相關。

2.2 免疫系統建立的“卵巢記憶” Bukovsky[28]認為，OGSCs Niche中存在許多未定型的MDC和T細胞(Uncommitted MDC and T cells，UMT)，并且這些細胞具有識別和記憶OGSCs的功能。2012年，Bukovsky等[5]正式提出關于“卵巢記憶”的假設:當原始生殖細胞植入未分化的性腺后，卵巢網就會刺激次級生殖細胞分化成卵母細胞。在發育的免疫適應期內，卵巢網中存在許多UMT，一部分UMT能夠在卵巢網通道內分化成“面紗”細胞(veiled cells)，并將卵巢網內卵母細胞的信息傳遞給發育中的淋巴組織，此時這些“面紗”細胞就被稱為卵巢“記憶細胞(Ovarian memory cells，OMC)”，它們能夠將卵巢網通道內其余的UMT轉換成OCMT。這些OCMT移行到卵巢上皮層并產生細胞信號以觸發OGSCs的不對稱和對稱分裂，進而分化成次級生殖細胞。次級生殖細胞的產生也依賴于hCG和雌二醇等提供合適的激素環境。該假設認為，發育中的免疫系統會建立起“卵巢記憶”，以支持成人期內依賴OCMT而完成的卵泡更新[33]。在35到40歲之間，免疫系統表現出明顯的功能減退，卵泡更新也隨之停止(圖1)。

免疫適應期結束以后，隨之而來的是胎兒卵巢網退化、卵子發生停止，這可能歸咎于激素信號的減少(胎兒hCG屏障)[34]。此時，淋巴組織中OMC的數量也確定下來，形成卵巢記憶細胞池。在近月經初潮及最佳生殖期內，激素信號和OCMT通過刺激OGSCs重新參與周期性的卵子發生，持續的卵泡更新需要OCMT的循環供應，這一過程將最終導致記憶細胞池的耗竭。一旦可用的OMC被耗盡，即使激素信號仍然存在，卵子發生和卵泡的更新依然會終止。從這個觀點來看，隨著年齡增長而發生的免疫系統退行性變化可能是卵子發生和卵泡更新停止最根本的原因。該假設是科學家結合眾多實驗成果和理論依據提出的，揭示了哺乳動物免疫系統和生殖系統之間可能存在的內在聯系，是對免疫系統調控OGSCs增殖、分化的大膽推測。

圖1 免疫適應期內卵巢“記憶細胞”的產生Fig.1 Generation of ovarian memory cells during developmental immune adaptationNote: UMT.Uncommitted MDC and T cells；OCMT.Ovary-committed bone marrow cells；omc.Ovarian memory cells；OGSCs.Ovarian germline stem cells；LT.Lymphoid tissue；DIA.Developmental immune adaptation.

3 結語

OGSCs的提出打破了生殖醫學的傳統觀點，作為胎兒和成人卵巢內生殖細胞的補給細胞，OGSCs能夠維持卵巢的生殖功能，因此對其體內外調控機制的研究將給卵巢早衰以及卵巢不孕癥等的臨床治療提供更廣闊的前景，對提高女性受孕率和延緩女性衰老具有重要意義！近年來，從OGSCs的體外建系到植入OGSCs的不孕小鼠成功產下后代，科學家對OGSCs的探索取得了很大進展，但關于其調控機理的研究尚不充足。

在機體組織功能方面，免疫系統相關細胞和分子參與生殖細胞的對稱分裂和遷移、促進顆粒細胞及胎兒和成人原始卵泡的生成，從而維持卵巢的正常功能。而在哺乳動物OGSCs的增殖分化過程中，免疫系統同樣發揮著不可忽視的重要作用：OGSCs發生不對稱分裂產生新的生殖細胞的過程需要接受MDCs和T細胞的刺激；免疫系統通過OGSCs Niche調控OGSCs的增殖分化。眾多實驗結果證明，免疫系統與哺乳動物雌性生殖系統的種種聯系并非偶然，卵巢的功能甚至OGSCs的生理進程都很可能受到機體免疫系統的調控。然而，目前OGSCs存在與否仍然爭議不斷，OGSCs的分離純化尚處于體外研究階段，臨床應用上仍然存在很大困難，因此探索OGSCs的增殖、分化機制必將成為研究者們共同面臨的難題?？茖W家們在免疫和生殖領域所取得的研究成果，為我們探索OGSCs的體內外調控機制指引了新的方向，同時也將為女性不孕癥等的臨床治療提供新的思路！

[1] Ahn SH,Monsanto SP,Miller C,etal.Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis [J].Biomed Res Int,2015,2015:795-976.

[2] Bukovsky A.Immune maintenance of self in morphostasis of distinct tissues,tumour growth and regenerative medicine [J].Scand J Immunol,2011,73(3):159-189.

[3] Li Y,Zhao LD,Tong LS,etal.Aberrant CD200/CD200R1 expression and function in systemic lupus erythematosus contributes to abnormal T-cell responsiveness and dendritic cell activity [J].Arthritis Res Ther,2012,14(3):R123.

[4] Bukovsky A.From cellular to chemical approach for acute neural and alternative options for age-induced functional diseases [J].World J Stem Cells,2015,7(8):1109-1117.

[5] Bukovsky A,Caudle MR.Immunoregulation of follicular renewal,selection,POF,and menopause in vivo,vs.neo-oogenesis in vitro,POF and ovarian infertility treatment,and a clinical trial [J].Reprod Biol Endocrinol,2012,10:97.

[6] Bukovsky A.Cell commitment by asymmetric division and immune system involvement [J].Prog Mol Subcell Biol,2007,45:179-204.

[7] Sakakura T,Nishizuka Y.Thymic control mechanism in ovarian development:reconstitution of ovarian dysgenesis in thymectomized mice by replacement with thymic and other lymphoid tissues [J].Endocrinology,1972,90(2):431-437.

[8] Russell WR,Walpole AL,Labhsetwar AP.Cyclophosphamide:induction of superovulation in rats [J].Nature,1973,241(5385):129-130.

[9] Bukovsky A,Presl J.Ovarian function and the immune system [J].Med Hypotheses,1979,5(4):415-436.

[10] Reggiani PC,Barbeito CG,Zuccolilli GO,etal.Neonatal thymulin gene therapy prevents ovarian dysgenesis and attenuates reproductive derangements in nude female mice [J].Endocrinology,2012,153(8):3922-3928.

[11] Crespo D,Bonnet E,Roher N,etal.Cellular and molecular evidence for a role of tumor necrosis factor alpha in the ovulatory mechanism of trout [J].Reprod Biol Endocrinol,2010,8:34.

[12] Nakao K,Kishi H,Imai F,etal.TNF-alpha suppressed FSH-induced LH receptor expression through transcriptional regulation in rat granulosa cells [J].Endocrinology,2015,156(9):3192-3202.

[13] Uri-Belapolsky S,Shaish A,Eliyahu E,etal.Interleukin-1 deficiency prolongs ovarian lifespan in mice [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(34):12492-12497.

[14] Wang ZP,Mu XY,Guo M,etal.Transforming growth factor-beta signaling participates in the maintenance of the primordial follicle pool in the mouse ovary [J].J Biol Chem,2014,289(12):8299-8311.

[15] Galvao AM,Ferreira-Dias G，Skarzynski DJ.Cytokines and angiogenesis in the corpus luteum [J].Mediators Inflamm,2013,2013:420186.

[16] Galvao AM,Szostek AZ,Skarzynski DJ,etal.Role of tumor necrosis factor-alpha,interferon-gamma and Fas-ligand on in vitro nitric oxide activity in the corpus luteum [J].Cytokine,2013,64(1):18-21.

[17] Johnson J,Canning J,Kaneko T,etal.Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary [J].Nature,2004,428(6979):145-150.

[18] Virant-Klun I.Postnatal oogenesis in humans:a review of recent findings [J].Stem Cells Cloning,2015,8:49-60.

[19] Bhartiya D,Sriraman K,Parte S,etal.Ovarian stem cells:absence of evidence is not evidence of absence [J].J Ovarian Res,2013,6(1):65.

[20] Gheorghisan-Galateanu AA,Hinescu ME,Enciu AM.Ovarian adult stem cells:hope or pitfall? [J].J Ovarian Res,2014,7:71.

[21] Parvari S,Abbasi M,Abbasi N,etal.Stem cell isolation by a morphology-based selection method in postnatal mouse ovary [J].Arch Med Sci,2015,11(3):670-678.

[22] Zou K,Yuan Z,Yang Z,etal.Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries [J].Nat Cell Biol,2009,11(5):631-636.

[23] White YA,Woods DC,Takai Y,etal.Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women [J].Nat Med,2012,18(3):413-421.

[24] Zhang H,Liu L,Li X,etal.Life-long in vivo cell-lineage tracing shows that no oogenesis originates from putative germline stem cells in adult mice [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(50):17983-17988.

[25] Grive KJ,Freiman RN.The developmental origins of the mammalian ovarian reserve [J].Development,2015,142(15):2554-2563.

[26] Li J,Zhou F,Zheng T,etal.Ovarian germline stem cells (OGSCs) and the hippo signaling pathway association with physiological and pathological ovarian aging in mice [J].Cell Physiol Biochem,2015,36(5):1712-1724.

[27] Pan Z,Sun M,Li J,etal.The expression of markers related to ovarian germline stem cells in the mouse ovarian surface epithelium and the correlation with notch signaling pathway [J].Cell Physiol Biochem,2015,37(6):2311-2322.

[28] Bukovsky A.Ovarian stem cell niche and follicular renewal in mammals [J].Anat Rec (Hoboken),2011,294(8):1284-1306.

[29] Hummitzsch K,Anderson RA,Wilhelm D,etal.Stem cells,progenitor cells,and lineage decisions in the ovary [J].Endocr Rev,2015,36(1):65-91.

[30] Lee SH,Ichii O,Otsuka S,etal.Identifying a new locus that regulates the development of rete ovarian cysts in MRL/MpJ mice [J].Jpn J Vet Res,2011,59(2-3):79-88.

[31] Bukovsky A.Novel methods of treating ovarian infertility in older and POF women,testicular infertility,and other human functional diseases [J].Reprod Biol Endocrinol,2015,13:10.

[32] Kossowska-Tomaszczuk K,De Geyter C.Cells with stem cell characteristics in somatic compartments of the ovary [J].Biomed Res Int,2013,2013:310859.

[33] Bukovsky A,Copas P,Virant-Klun I.Potential new strategies for the treatment of ovarian infertility and degenerative diseases with autologous ovarian stem cells [J].Expert Opin Biol Ther,2006,6(4):341-365.

[34] Bukovsky A,Caudle MR,Svetlikova M,etal.Oogenesis in adult mammals,including humans:a review [J].Endocrine,2005,26(3):301-316.

[收稿2016-05-05 修回2016-08-22]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.033

①本文為國家自然科學基金(No.81160081，81360100)和衢州市科技計劃項目(2016Y016)。

梁 夏(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事哺乳動物雌性生殖干細胞的體內外調控機制方面的研究，E-mail：751052182@qq.com。

R392

A

1000-484X(2017)03-0468-04

及指導教師：鄭月慧(1964年-)，女，博士，教授,博士生導師，主要從事生殖內分泌和計劃生育研究工作，E-mail：yuehuizheng@163.com。

②南昌大學醫學院，江西省生殖生理與病理重點實驗室，南昌330031。