3種植物生長調節劑對壇紫菜自由絲狀體生長與光合色素含量的影響

鐘晨輝，林 琪，張 鵬，黃瑞芳，林向陽，劉燕飛

(1. 福建省水產研究所，廈門 361013； 2. 福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，廈門 361013； 3. 浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 4. 福建省水產技術推廣總站，福州 350003)

3種植物生長調節劑對壇紫菜自由絲狀體生長與光合色素含量的影響

鐘晨輝1，2，林 琪1，2，張 鵬3，黃瑞芳1，2，林向陽1，2，劉燕飛4

(1. 福建省水產研究所，廈門 361013； 2. 福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，廈門 361013； 3. 浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 4. 福建省水產技術推廣總站，福州 350003)

采用單因素分析法，比較研究了添加3種外源植物生長調節劑(吲哚乙酸IAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、激動素KT)對野生型壇紫菜(Pyropiahaitanensis)自由絲狀體生長及光合色素含量的影響。結果表明：與對照組相比，低濃度的IAA(0.5～4.0 mg·L-1)和KT(0.5～2.0 mg·L-1)對藻體的特定生長率有顯著影響，以2.0 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1KT對藻體的促生長效應最大，培養25 d時藻體鮮重增加最大，分別是對照組的1.90倍和1.52倍(P<0.05)。高濃度的IAA(6.0～10.0 mg·L-1)和KT(4.0～10.0 mg·L-1)卻會抑制藻體生長(P<0.05)。培養25 d時，與對照組相比，2.0 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1KT均有利于葉綠素a(Chla)和類胡蘿卜素(Car)的合成，Chla含量分別增加了23.7% 和23.8%；Car含量分別增加了31.0%和28.6%(P<0.05)。然而，高濃度的IAA和KT(6.0、10.0 mg·L-1)不利于Chla的合成，其處理濃度越高，Chla含量下降越多。與對照組相比，較低濃度的IAA(1.0～2.0 mg·L-1)明顯促進藻紅蛋白(PE)和藻藍蛋白(PC)合成，其中2.0 mg·L-1IAA處理組PE、PC含量最高，分別增加了59.1%和45.7%(P<0.05)。較低濃度的KT(0.5～2.0 mg·L-1)均有利于PE、PC合成，其中0.5 mg·L-1KT處理組的PE、PC含量增加最多，分別提高了48.4%和50.5%(P<0.05)。高濃度的IAA(6.0、10.0 mg·L-1)和KT(10.0 mg·L-1)則明顯降低了PE、PC合成(P<0.05)。2,4-D對藻體的特定生長率和光合色素合成無顯著影響(P>0.05)。

壇紫菜； 自由絲狀體； 植物生長調節劑； 生長； 光合色素

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是我國特有的一種亞熱帶大型經濟紅藻，主要養殖在浙江、福建和廣東等沿海地區，其年產量占到我國紫菜年產量的75%左右，其生活史包括微型的絲狀孢子體(2n)和大型的葉狀配子體(n)兩個時期[1]。壇紫菜絲狀體主要是由成熟葉狀體釋放的果孢子或單性葉狀體產生的[2]。在低溫弱光條件下，絲狀體可以長期保存，移入適宜的培養條件后，藻體可實現快速的營養增殖[3]，且粉碎后的藻絲可以鉆入貝殼基質長成貝殼絲狀體，能夠在紫菜人工育苗中充當“種子”的角色，該技術稱為自由絲狀體移植技術[4]?，F今，隨著我國壇紫菜新種質的不斷開發和推廣，自由絲狀體移植因具有種質純合、性狀穩定和育苗過程簡易等優勢，已被大部分生產單位采納和應用[5-6]。另外，壇紫菜富含藻膽蛋白等天然色素，被廣泛應用在食品工業、生物醫藥及高端化妝品等行業[7]。因此，通過優化培養條件，在有限時間內創制出大量優質健康的絲狀體將變得非常重要。

植物生長調節劑是一類與植物激素類似的化學物質，對植物具有多種生理效應，可以調控植物的生長發育[8]。外源添加植物生長調節劑可以促進藻類細胞組織分裂，促進藻體單個細胞生長，增加藻體細胞數量及促進藻體假根生長和頂端生長、脫分化和誘導愈傷組織形成等[9]。國內外學者主要研究了植物生長調節劑對海帶(Saccharinajaponica)配子體[10]、岡村枝管藻(CladosiphonokamuranusTokida)盤狀體[11]、海蘿(Gloiopeltisfurcata)盤狀體和直立體[12]、細基江蘺(Gracilariatenuistipitata)[13]、斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)[14]、枝鞘藻(Oedocladiumsp.)[15]、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)和鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[16]、條斑紫菜(Pyropiayezoensis)[17-18]和壇紫菜葉狀體[19]生長與發育的影響，并掌握了有利于藻體快速生長與代謝產物積累的使用濃度范圍。然而，植物生長調節劑對紫菜自由絲狀體是否存在促生長效應還不清楚，因此，本文以野生型壇紫菜自由絲狀體為實驗材料，比較研究了外源添加不同質量濃度的吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和激動素(KT)對壇紫菜自由絲狀體生長與光合色素含量的影響，以期篩選出較適宜的處理濃度，為豐富壇紫菜自由絲狀體的快速擴大培養模式提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為野生型壇紫菜絲狀體(WT-001)，該株系是采集于福建省平潭島的成熟野生壇紫菜葉狀體釋放的單個果孢子所萌發而成的雜合絲狀體克隆系。

1.2.1 壇紫菜自由絲狀體的同步化培養

取一定數量的自由絲狀體經打碎機粉碎后，置于單個20 L玻璃充氣瓶內充氣培養，培養條件設置為：溫度24±0.5 ℃，光周期12L∶12D，光照強度10 μmol·m-2·s-1。每周更換一半MES培養液，直至培養到實驗所需的生物量。

1.2.2 植物生長調節劑的濃度設計與藻體培養

3種植物生長調節劑IAA，2,4-D和KT的濃度梯度均為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mg·L-1，每個濃度均設3個平行組。將預先同步化培養的壇紫菜自由絲狀體按同等質量(0.30±0.05) g轉入裝有500 mL MES滅菌培養液的單管玻璃瓶內。室內培養條件設置為：溫度(24±0.5) ℃，光周期12L∶12D，光照強度20 μmol·m-2·s-1。每周更換一次MES培養液時，并補加相應劑量的植物生長調節劑。培養期間每隔1 d檢查一次培養情況，每天定時搖動培養瓶3次(6∶00，14∶00，22∶00)，保持藻體懸浮培養狀態，實驗周期為25 d。

1.2.3 生長指標測定

每次更換培養液時，稱量各個培養瓶內壇紫菜自由絲狀體的鮮重，測定方法：將自由絲狀體經200目篩絹靜置過濾10 min后，置于電子分析天平上稱重記錄。藻體的特定生長率(Specific Growth Rate，SGR)的計算按照公式(1) 。

SGR=100×(LnDt-LnD0)/5

(1)

式中,D0為前一次藻體鮮重，Dt為第t天的藻體鮮重。

雖然魚兒們如此頑皮，但對我這個“釣魚高手”來說，也只是雕蟲小技。我先將一撮沒有連著線的魚食拋進了魚群，那些魚兒們過去嗅了嗅，都走開了。他們好像在嘲笑我：“哼！我們才不中計呢！想把我們釣走，沒門兒！”可他們不知道，他們已經中計了！剛剛我把魚食拋得很近，本來就是給他們設的圈套。他們一下子躲到了后面，卻不料我的魚鉤上已經放了魚食在等他們，其中一個調皮的，上去咬了一口，沒有被釣起來，他的膽子就變大了，一口將魚食吞了下去，我熟練的將魚竿收回，哈！一條黑色的魚！我用同樣的方法，又釣了九條魚！

1.2.4 葉綠素a及類胡蘿卜素含量測定

培養至25 d時，從每個培養瓶內取出大約0.02 g新鮮藻體，置于加入3 mL甲醇的研磨器中充分研磨，后于4 ℃恒溫冰箱過夜處理，次日取出離心(5 000 r·min-1，4 ℃，5 min)，將上清液置于紫外分光光度計中，測量480、510、652、665、750 nm波長下各自的吸光值(OD)。葉綠素a(Chla)及類胡蘿卜素(Car)含量的計算分別按照公式(2)[20]和公式(3)[21]。

Chla(μg·g-1)=16.29×(OD665-OD750)-8.54×(OD652-OD750)

(2)

Car (μg·g-1)=7.6×[(OD480-OD750)-8.54×(OD510-OD750)]

(3)

1.2.5 藻紅蛋白和藻藍蛋白含量測定

培養至25 d時，從每個培養瓶內取鮮重約0.1 g的藻體，置于放有少許石英砂的研磨器中研磨充分，至勻漿后轉入8 mL的磷酸緩沖液(pH 6.8，0.1 mol·L-1)中，然后經離心機離心(10 000 r·min-1，4 ℃，10 min)后取上清液用紫外分光光度儀，檢測455、564、592、618、645 nm波長下的吸光值。藻紅蛋白(PE)和藻藍蛋白(PC)含量的計算按照公式(4)和(5)[22]。

(4)

(5)

式中，A表示吸光度，V表示抽提量，DW表示藻類干重(g)。

1.2.6 數據處理

采用Excel 2007計算實驗數據并統計作圖。SPSS Statistics 17.0軟件對各組數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)及Duncan多重比較分析，差異顯著水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 壇紫菜自由絲狀體的生長曲線與特定生長率比較

比較不同濃度的3種植物生長調節劑(IAA、2,4-D和KT)對壇紫菜自由絲狀體生長的效果。結果顯示，不同濃度的IAA和KT對自由絲狀體的生長影響較大，在5～15 d階段不同濃度處理組內的特定生長率(SGR)變化幅度較小，但16～25 d階段的SGR卻明顯減小(表1)。與對照組相比，適宜濃度的IAA(0.5～4.0 mg·L-1)和KT(0.5～2.0 mg·L-1)皆可以促進絲狀體生長，其藻體鮮重都處于明顯的增長趨勢，其中2.0 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1KT處理組的SGR最大，至25 d時的藻體鮮重最大，分別是對照組的1.90倍和1.52倍(P<0.05) (圖1-A、C，表1)。但高濃度的IAA(6.0～10.0 mg·L-1)和KT(4.0～10.0 mg·L-1)抑制藻體生長，藻體鮮重增加量極少，其SGR明顯小于對照組(P<0.05) (圖1-A、C，表1)。在整個培養階段，不同濃度2,4-D處理組的藻體生長曲線基本保持趨同態勢，SGR不存在明顯差異(P>0.05) (圖1-B，表1)。

圖1 不同濃度IAA(A)、2,4-D (B)和KT (C)處理下壇紫菜自由絲狀體的生長曲線Fig.1 Growth curves of free-living filaments of P.haitanensis treated with different concentrations of IAA(A), 2,4-D (B) and KT (C)

表1 不同濃度的3種植物生長調節劑處理下壇紫菜自由絲狀體的特定生長率Tab.1 Specific growth rates of free living filaments of P.haitanensis treated with different concentrations of plant growth regulators

注：同一行數據中，上標字符不同表示同一時段內在不同濃度植物生長調節劑處理下壇紫菜自由絲狀體特定生長率之間有顯著差異(P<0.05)

Notes：In the same line, data with different superscript letters show the significant differences between the specific growth rates of free-living filaments ofP.haitanensistreated by the same palnt growth regulators of different concentrions in the same time period(P<0.05)

2.2 壇紫菜自由絲狀體的葉綠素a與類胡蘿卜素含量比較

外源添加不同濃度的3種植物生長調節劑培養壇紫菜自由絲狀體25 d后，比較分析了各處理組絲狀體的Chla和Car含量。結果表明，不同濃度的IAA和KT對自由絲狀體Chla和Car含量存在影響(圖2-A、C)，而不同濃度的2,4-D對藻體的Chla和Car含量影響極小(圖2-B)。與對照組相比，2.0 mg·L-1IAA處理組的Chla和Car含量最高，分別提高了23.7%和31.0%(P<0.05)；然而，高濃度IAA(6.0、10.0 mg·L-1)都不利于藻體Chla的合成，其含量分別下降了20.0%和35.3%(P<0.05)。類似地，與對照組相比，1.0 mg·L-1KT處理組的Chla和Car含量最高，分別提高了23.8%和28.6%(P<0.05)。但高濃度KT(6.0、10.0 mg·L-1)處理組的Chla和Car含量均顯著性降低，其中Chla含量分別下降了15.4%和53.6%，且Car含量分別下降了23.6%和67.3%(P<0.05)。不同濃度2,4-D處理組的藻體Chla和Car含量不存在顯著性差異(P>0.05)。

2.3 壇紫菜自由絲狀體的藻膽蛋白含量比較

如圖3-A、B所示，不同濃度的IAA和KT處理對壇紫菜自由絲狀體的PE和 PC含量影響較大，而不同濃度2,4-D處理下藻體PE和PC含量在各組間的差異不明顯。培養25 d后，與對照組相比，1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1IAA處理均顯著提高了藻體PE和PC的合成，其中PE含量分別增加了18.1%和59.1%，PC含量分別增加了13.3%和45.7%(P<0.05)。然而與對照組相比，高濃度IAA(6.0、10.0 mg·L-1)處理不利于藻體的PE和PC合成，其中PE含量分別降低了19.5%和33.8%，PC含量分別降低了28.8%和57.6%(P<0.05)。相類似地，與對照組相比，較低濃度KT(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)處理組的PE和PC含量增加，其PE含量分別提高了48.4%，32.2%和28.1%；PC含量分別提高了50.5%，33.7%和26.7%(P<0.05)。而高濃度KT(10.0 mg·L-1)處理明顯降低了藻體的PE和PC含量，分別降低了23.8%和58.7%(P<0.05)。

圖2 不同濃度IAA(A)、2,4-D(B)和KT(C)處理下壇紫菜自由絲狀體的葉綠素a和類胡蘿素含量 Fig.2 Contents of Chlorophyll α and Carotenoid of free-living filaments of P. haitanensis treated with different concentrations of IAA(A), 2,4-D(B) and KT(C)

圖3 不同濃度的3種植物生長調節劑處理下壇紫菜自由絲狀體的藻紅蛋白和藻藍蛋白含量Fig.3 Contents of PE(A) and PC(B) of free-living filameents of P.haitanensis treated with different concentrations of IAA，2,4-D and KT

3 討論

3.1 3種植物生長調節劑對壇紫菜自由絲狀體生長的影響

植物生長素的化學本質是IAA，在藻類中可以促進細胞生長與分裂[23]。特定生長率(SGR)是一個衡量生物體生長狀況的常用指標，SGR值越大，代表生物量增長越快。在本研究中，較低濃度的IAA(0.5～4.0 mg·L-1)對壇紫菜自由絲狀體的SGR影響顯著，以2.0 mg·L-1IAA的促生長作用最明顯，藻體鮮重增加量最大(P<0.05)。該結果類似于之前的研究發現1.0×10-5mol·L-1IAA對斜生柵藻[14]，1.0 mg·L-1IAA對枝鞘藻[15]及0.05 mg·L-1IAA對海帶配子體具有促生長效應[10]。同時，這種生理效應也類似于低濃度的生長素萘乙酸(NAA)，可以加快岡村枝管藻盤狀體與條斑紫菜原生質體的生長[11，17]。本研究中適宜濃度的IAA可以促進壇紫菜自由絲狀體生長，可能是IAA對細胞質膜上的ATP酶有活化作用，從而增強細胞可塑性，增進細胞RNA轉錄和蛋白質合成，加快了細胞增殖[24]，而高濃度IAA卻對藻體產生相反的生理作用，導致藻體生長受到抑制。KT和2,4-D屬于植物細胞分裂素物質，可以促進細胞的胞質分裂及多種組織的分化和生長[23]。RAPOSO等[16]研究發現低濃度的KT和2,4-D(0.5～2.0 mg·L-1)對雨生紅球藻和鹽生杜氏藻有生長促進作用。本研究中適宜濃度的KT(0.5～2.0 mg·L-1)均促進壇紫菜自由絲狀體的生長，以1.0 mg·L-1KT處理組的SGR最大，藻體鮮重增加量最大(P<0.05)。然而，不同濃度的2,4-D對藻體的SGR不存在影響，這說明壇紫菜自由絲狀體對2,4-D不敏感，2,4-D不存在促生長效應。這種KT和2,4-D對藻體生長影響的差異性，類同于YOKOYA等[13]發現1.0～100.0 mol·L-1KT對細基江蘺的中間部位藻體切段有促進作用，而2,4-D不存在促生長效應。這說明壇紫菜絲狀體對KT和2,4-D的響應機制不同，也提示植物生長調節劑的存在并不一定直接影響藻體生長，可能還間接地與培養體系中有無媒介物質、藻體自身有無相關信號受體或數量多少及生理調節機制能否發揮作用有關[25-26]。

3.2 3種植物生長調節劑對壇紫菜自由絲狀體光合色素含量的影響

光合色素是藻類進行光合作用的物質基礎，能夠吸收、傳遞和轉換光能。葉綠素a直接參與光合作用過程的光反應，而類胡蘿卜素和藻膽蛋白作為輔助色素將吸收的光能傳遞給葉綠素a，其含量與組成能影響藻體的光合速率[27]。植物生長調節劑可以調節藻體內RNA、DNA和蛋白質合成，并影響光合色素和脂類代謝物等的積累等[28]。本研究中，在同一試驗組內2.0 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1KT處理的壇紫菜自由絲狀體的SGR最大，其Chla含量最高。適宜濃度的IAA和KT處理組藻體的SGR與Chla含量呈現出關聯性，且2,4-D處理后不同組間藻體的SGR和Chla含量都無差異，這提示IAA和KT的促生長效應與藻體的Chla合成密切相關。本研究發現1.0、2.0 mg·L-1IAA處理均顯著提高了藻體的PE和PC含量，但0.5 mg·L-1IAA在顯著提高藻體的SGR時，并沒有明顯增加PE和PC含量。此外，0.5、1.0、2.0 mg·L-1KT都可以明顯加快藻體生長，其PE和PC含量也增加，卻以0.5 mg·L-1KT處理組的PE和PC合成量最高，而不是保持藻體最快生長的1.0 mg·L-1KT處理組。這說明自由絲狀體的SGR與藻膽蛋白的合成量并非完全正相關，可能是藻膽蛋白不是藻體光合作用中的主要參與者，而是以一種捕光色素蛋白輔助其光合反應，其光合效率主要由葉綠素所決定[29]。其次，植物生長調節劑的作用主要是促細胞分裂和生長，即主控數量或體積變化，但并不一定直接作用某些營養成分的生成，藻膽蛋白的合成也可能另由其它信號調節[27-28]。目前，紅藻和藍藻是從大型海藻中提取藻膽蛋白的主要原材料，壇紫菜作為目前我國主要的紅藻養殖品種之一，其自由絲狀體所含有的藻膽蛋白在食品色素、海洋藥物及高端化妝品添加劑等領域的應用潛力巨大[7]。因此在室內條件下外源添加適宜質量濃度的IAA(2.0 mg·L-1)和KT(0.5 mg·L-1)可以有效提高壇紫菜自由絲狀體的生長速率和生物量，也有利于提高藻體的藻膽蛋白含量及其利用價值。

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Effects of three plant growth regulators on the growth and photosynthetic pigment contents of free-living filaments ofPyropiahaitanensis

ZHONG Chen-hui1，2，LIN Qi1，2，ZHANG Peng3，HUANG Rui-fang1，LIN Xiang-yang1，LIU Yan-fei4

(1.FujianFisheriesResearchInstitute，Xiamen361013，China； 2.FujianKeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganisms，Xiamen361013，China；3.ZhejiangMaricultureResearchInstitute，Wenzhou325005，China； 4.FujianFisheriesTechnicalExtensionCenter，Fuzhou350003，China)

The effects of three plant growth regulators， indole-3-acetic acid(IAA)， 2，4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) and kinetin(KT)， with concentrations of 0.0, 0.5，1.0，2.0，4.0， 6.0 and 10.0 mg·L-1acting as the treatments in a single factorial comparative experiment， on the growth and photosynthetic pigment contents of free-living filaments inPyropiahaitanensiswas studied. The results showed that compared to the control group low concentrations of IAA (0.5～4.0 mg·L-1) and KT (0.5～2.0 mg·L-1) had apparent influences on the specific growth rate of filaments， and the most obvious effects were observed in 2.0 mg·L-1IAA and 1.0 mg·L-1KT group，whose algal biomass were 0.90 and 0.52 time higher than those of the control group after 25 d culture，respectively (P<0.05). However， the high concentrations of IAA and KT (6.0～10.0 mg·L-1) significantly inhibited the growth of filaments (P<0.05). After 25 d culture，compared to the control group，both 2.0 mg·L-1IAA and 1.0 mg·L-1KT significantly stimulated synthesis of Chlorophyll α (Chla) and Carotenoids (Car)，and the contents of Chlaincreased by 23.7% and 23.8%， respectively. While the contents of Car increased by 31.0% and 28.6%，respectively (P<0.05). Whereas，high concentrations of IAA and KT (6.0～10.0 mg·L-1) significantly reduced the contents of Chla，presenting as the treated concentration higher，the Chlasynthesis less. In additional， low concentrations of IAA (1.0～2.0 mg·L-1) treatmeat significantly increased the contents of Phycoerythrin (PE) and Phycocyanin (PC)，which were highest in 2.0 mg·L-1IAA group，and increased by 59.1% and 45.7%，respectively (P<0.05). Meanwhile，low concentrations of KT (0.5～2.0 mg·L-1) resulted in massive synthesis of the PE and PC，which were the highest in 0.5 mg·L-1KT group，and increased by 48.4% and 50.5%，respectively (P<0.05). While high concentrations of IAA and KT (6.0～10.0 mg·L-1) significantly reduced the contents of PE and PC (P<0.05). But 2,4-D treatments had no apparent influence on the growth and synthesis of photosynthetic pigments.

Pyropiahaitanensis; free living conchocelis; plant growth regulators; growth; photosynthetic pigment

1004-2490(2017)02-0216-09

2016-06-27

福建省種業創新與產業化工程項目(2014S1477-10)；福建省自然科學基金(2014J01095)；福建省海洋高新產業發展專項 (閩海洋高新2014-19)；福建省海洋與漁業結構調整專項；福建省海洋經濟創新發展區域示范項目(2014FJPT01)；廈門南方海洋研究中心資助項目(15GZY021NF04、14PZY017NF17)；浙江省科技計劃資助項目(2016F50033)

鐘晨輝(1984-)，男，助理研究員，博士研究生，主要從事藻類生理生態學與遺傳育種學研究。 E-mail：zhongchenhui@126.com

S 968.43

A