半滑舌鰨腎臟組織結構與細胞種類研究

孫 斌, 孫金生, 張麗娜, 肖 鵬

(1. 天津師范大學 生命科學學院, 天津 300387; 2. 海洋生態養殖國家地方聯合工程實驗室, 山東 青島266071; 3. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 4. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266071)

半滑舌鰨腎臟組織結構與細胞種類研究

孫 斌1, 孫金生1, 張麗娜2, 肖 鵬3,4

(1. 天津師范大學 生命科學學院, 天津 300387; 2. 海洋生態養殖國家地方聯合工程實驗室, 山東 青島266071; 3. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 4. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266071)

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是中國重要的海水養殖魚類品種, 目前對于其腎臟結構與細胞種類的研究較少。本研究以半滑舌鰨腎臟為研究對象, 通過切片技術、免疫組織化學與顯微鏡觀察, 描述半滑舌鰨腎臟結構與細胞分布情況。結果顯示, 半滑舌鰨的腎臟可以分為頭腎與體腎兩部分; 頭腎較小, 具有獨立的結構, 位于腎臟前部, 靠近腦, 形態上呈分叉狀; 頭腎由淋巴髓樣細胞構成, 無腎小球等分泌結構, 免疫細胞豐富, 包括淋巴細胞、單核細胞、顆粒細胞, 是半滑舌鰨免疫細胞的主要生發部位之一, 是免疫系統的重要組成; 半滑舌鰨的體腎與頭腎后部分叉處相連, 呈紡錘狀, 緊貼腹腔背部, 向后延伸; 體腎主要由腎單位組成, 有豐富的腎小囊、近曲小管、遠曲小管和集合管結構, 表明其具有排泄功能。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis); 腎臟; 組織結構; 石蠟切片; 超薄切片

腎臟是魚類重要的器官之一, 呈細長型, 位于體腔背部緊貼于脊椎的位置, 占據整個體腔背側壁的長度, 由一層腹腔膜與肝臟、胃等內臟器官分隔。魚類腎臟是一個結構復雜、功能多樣的器官, 擔負著排泄、調節滲透、造血和免疫應答等多重功能[1]。硬骨魚類的腎臟一般可以分為頭腎和體腎兩部分, 頭腎位于腎臟最前端。在形態上, 一些魚類頭腎與體腎形成一個整體[2], 有的魚可以明顯區分開頭腎與體腎[3]。頭腎是硬骨魚類重要的造血和免疫器官, 與高等脊椎動物的骨髓類似, 參與造血; 是免疫細胞如巨噬細胞、顆粒細胞、B 淋巴細胞發生、分化和增殖的重要場所, 也是捕獲抗原和產生抗體的主要器官[4], 在免疫應答過程中發揮作用。硬骨魚類的體腎是一個完整獨立的組織結構, 又可分為中腎和后腎, 主要由腎單位、腎小管和填充期間的間質淋巴樣組織(也稱為間組織)所構成[5], 是硬骨魚類重要的調節滲透和排泄器官。

目前, 對于魚類腎臟的研究主要有形態、發育、細胞組成及功能等方面。有研究利用組織學和組織化學方法分析草魚(Ctenopharyngodon idella)頭腎的組織發生[6]; 對大黃魚(Pseudosciaena crocea)頭腎印跡片、光鏡片進行觀察, 表明大黃魚頭腎是其免疫細胞的生發中心, 在免疫防御系統中具重要作用[4]; 在腎臟發育研究方面, 闡述了牙鲆(Paralichthys olivaceus)從孵化至13個月階段的腎臟發育過程和細胞組成變化[7]; 還有研究利用石蠟切片技術和透射電鏡技術, 闡述了駝背鱸(Cromileptes altivelis Valencienne)腎臟的顯微和超微結構[8]。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus), 俗稱牛舌、鰨目、鰨米等[9]。半滑舌鰨作為中國重要的海水魚類養殖品種, 隨著養殖規模的迅速擴大, 病害問題逐漸成為限制產業發展的重要瓶頸因素之一, 亟待解決。在半滑舌鰨的病害中,脾腎壞死癥可以引起患病魚的腎臟發生嚴重的病理變化[10], 最終導致死亡。由于對半滑舌鰨腎臟組織結構缺乏系統的認知, 在疾病病理方面研究不足, 難以建立有效的疾病診斷和治療方法。本研究通過組織化學和顯微觀察的手段, 研究半滑舌鰨腎臟結構,有助于準確認知半滑舌鰨腎臟結構, 為半滑舌鰨疾病預防診斷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康半滑舌鰨, 平均體長為28.4 cm±0.5 cm, 平均體質量為198.3 g±0.5g, 購自山東青島新大地食品有限公司。

1.2 頭腎組織涂片

解剖半滑舌鰨, 剪下頭腎, 用無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)沖洗表面, 將頭腎剪成塊狀, 露出內部組織, 用組織塊在干凈的載玻片上輕輕涂抹, 空氣中過夜干燥, 用蘇木精-伊紅和Giemsa染液進行染色, 分別使用高倍鏡和油鏡觀察細胞形態, 進行白細胞分類及計數。

1.3 組織石蠟切片

解剖半滑舌鰨, 完整取出腎臟, 分別取頭腎和體腎, 剪成小塊(0.5 cm3左右), Davison液固定, 常規石蠟包埋, 切片厚度6 μm, 蘇木精-伊紅染色, 中性樹膠封片, 顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 透射電鏡用超薄切片制備

頭腎樣品用2.5%戊二醛磷酸緩沖液過夜固定,然后用1%鋨酸固定, 乙醇梯度脫水, 樹脂包埋, 使用超薄切片機制備切片, 常規電鏡切片染色后, 在日立H-7000型透射電鏡觀察并拍照。

1.5 免疫組織化學

未染色的涂片滴加4%多聚甲醛固定10 min, PBS洗3次, 每次5 min。用濃度2% 的BSA封閉液在37℃封閉45 min。每張切片分別滴加50 μL小鼠源單克隆抗體(分別抗CD4、CD16、CD20、CD68) (RLM3070-CD4、RLM3090-CD16、RLM3048-CD20、RLM3161-CD68, 蘇州睿瀛生物技術有限公司), 37℃孵育2 h, PBS洗3次, 每次5 min。滴加HRP標記山羊抗小鼠IgG[11], 37℃孵育2 h, PBS洗3次, 每次5 min。DAB顯色5 min, 顯微鏡觀察是否出現顯色反應, 若出現則吸去DAB, PBS洗3次, 每次5 min。甘油封片, 常溫放置。

2 結果

2.1 半滑舌鰨腎臟形態結構

半滑舌鰨腎臟分為頭腎和體腎兩部分, 頭腎較小, 位于腎臟前部, 形態呈現分叉結構。體腎呈紡錘狀, 緊貼腹腔背部, 沿脊椎向后延伸。

2.2 頭腎印跡片免疫細胞的形態及分類計數

半滑舌鰨頭腎組織印跡片免疫細胞分類計數見表1, 頭腎中有較多的免疫相關細胞, 包括淋巴細胞、單核細胞和顆粒細胞(圖1), 其中顆粒細胞所占比例較高。顯微鏡下半滑舌鰨頭腎印跡片中細胞形態結果顯示:

表1 頭腎內免疫細胞的分類比例Tab. 1 Differential leucocyte counts (DLC) in the head kidney of Cynoglossus semilaevis

圖1 半滑舌鰨頭腎印跡片Fig. 1 Imprint preparation of the head kidneyL. 淋巴細胞, ×1 000; G. 粒細胞, ×1 000; Mn.單核細胞, ×1 000 L. lymphocytes, ×1 000; G. granulocytes, ×1 000; Mn. monocytes, ×1 000

淋巴細胞(Lymphocyte, L)胞體較圓, 細胞核所占比例較大, 多為圓形或橢圓形, 位于細胞中央; 核染色質豐富, 致密, 紫紅色; 細胞質在核周圍, 染成淺藍色。

單核細胞(Monocyte, Mn)胞體形狀多樣; 細胞核形態不規則, 一般偏位, 染色后呈紫紅色; 核染色質疏松呈網狀, 細胞質呈深淺不一的藍色, 有的有空泡, 所占比例要比淋巴細胞大。

顆粒細胞(Granulocyte, G)胞體為圓形或橢圓形;細胞核呈紫紅色, 圓形或橢圓形, 偏于細胞的一側;細胞質淡藍色或淡紅色, 細胞質豐富, 含較多的細小顆粒。

2.3 頭腎和體腎組織石蠟切片

石蠟切片結果顯示, 頭腎實質主要由淋巴髓樣細胞組成(圖2-1), 無腎單位結構。體腎中分布著大量的腎單位, 其中可見腎小囊(圖2-2) 、近曲小管(圖2-2、2-3)、遠曲小管(圖2-3)和集合管(圖2-3)。近曲小管上皮細胞游離面有發達的刷狀緣; 遠曲小管中沒有刷狀緣, 管腔較光滑, 遠曲小管最終匯集成集合小管, 集合小管的管腔較大。

圖2 半滑舌鰨腎臟組織學結構(HE染色)Fig. 2 Histological structure of half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis) kidney (hematoxylin and eosin)2-1. 頭腎組織石蠟切片, 示淋巴髓樣組織(L); 2-2. 體腎組織石蠟切片, 示腎小囊(BC), 近曲小管(PT); 2-3. 體腎組織石蠟切片, 示近曲小管(PT), 刷狀緣(BB), 遠曲小管(DT), 集合管(CD)2-1. Paraffin section of the head kidney, lymphocytes (L); 2-2. Paraffin section of the trunk kidney, Bowman’s capsule (BC), proximal tubule (PT); 2-3. Paraffin section of the trunk kidney, PT, brush border (BB), distal tubule (DT), and collecting duct (CD)

2.4 頭腎免疫細胞的超微結構

半滑舌鰨頭腎中有較多的免疫相關細胞, 包括單核細胞、淋巴細胞、顆粒細胞。在透射電鏡下觀察了這些細胞的超微結構。

2.4.1 單核細胞

半滑舌鰨頭腎中的單核細胞呈形狀不規則; 細胞核(N)一般不在細胞中央, 多為不規則形; 染色質呈網狀, 細胞質豐富, 線粒體(Mitochondria, M)豐富,有粗面內質網以及游離核糖體, 有的可觀察到小顆粒及空泡(圖3-1)。

2.4.2 淋巴細胞

半滑舌鰨頭腎中的淋巴細胞呈圓形或橢圓形;細胞核(N)大體上為圓形, 位于細胞中央, 核質比較大; 異染色質多沿核膜邊緣分布, 在核內呈網狀分布, 細胞質較均勻(圖3-2)。

2.4.3 顆粒細胞

半滑舌鰨頭腎中的顆粒細胞含有溶酶體顆粒,溶酶體大小不等, 呈小球狀。根據顆粒大小及形態特征可以分為3類: Ⅰ型顆粒細胞、Ⅱ型顆粒細胞與特殊顆粒細胞。

β1～β12的權重可由前面的AHP-熵值組合賦權法得到，分別為:0.12，0.06，0.05，0.18，0.11，0.09，0.04，0.06，0.07，0.1，0.03，0.09。

Ⅰ型顆粒細胞, 細胞核不在細胞中央, 異染色質較豐富。細胞質內有數量形態不同的顆粒: 第1種顆粒(G1)是電子密度中等的圓形或橢圓形顆粒;第2種顆粒(G2)有中央電子致密度較高或較低的芯,由單位膜包裹(圖3-3); 第3種顆粒(G3)為長橢圓形(圖3-4), 內含絲狀結晶樣結構, 似掃帚狀, 一側電子致密度較高。細胞質中還有線粒體、粗面內質網和游離核糖體。

Ⅱ型顆粒細胞呈圓形或長橢圓形, 細胞核一般不在中央, 異染色質較豐富。細胞質內有大小不一的顆粒: 電子密度較高的圓形或橢圓形顆粒居多(G1);還有一些長橢圓形顆粒(G4), 電子致密度較高(圖3-5)。細胞質內還有發達的高爾基體(Golgi apparatus, GA)、線粒體、粗面內質網和游離核糖體。

2.4.4 特殊顆粒細胞

細胞核極圓, 核膜清晰呈微波狀, 異染色質發達, 細胞質電子密度極低, 細胞質內有黑色顆粒和空泡, 有較多核糖體(圖3-6)。

2.5 頭腎組織涂片結果

抗體RLM3090-CD16結合內源CD16蛋白, 標記免疫球蛋白(圖4-1); 抗體RLM3161-CD68結合內源CD68蛋白, 顯示巨噬細胞黏蛋白(圖4-2); 抗體RLM3048-CD20結合內源CD20蛋白, 顯示標記B-淋巴細胞(圖4-3); 抗體RLM3070-CD4結合細胞內源CD4細胞上的糖蛋白, 與二抗結合標記T淋巴細胞(圖4-4)。

3 討論

腎臟是魚類重要的器官, 它不僅擔負魚類調節滲透和排泄的作用, 同時還有造血與免疫的功能。由于魚類生活環境差異較大, 形成了器官的形態與功能多樣性, 不同魚種腎臟的組織結構有明顯差異。半滑舌鰨作為中國重要的海水養殖品種, 其腎臟結構方面的研究較少見。為了客觀認知半滑舌鰨腎臟功能與特征, 本研究開展了半滑舌鰨腎臟組織結構與細胞種類的研究。

圖3 半滑舌鰨頭腎免疫細胞的超微結構Fig. 3 Ultrastructure of the immune cells in the head kidney of half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)3-1. 單核細胞, 示不規則的細胞核(N), 有少量線粒體(M)存在, ×30 000; 3-2. 淋巴細胞, 示大的細胞核(N)和較少的細胞質, ×40 000; 3-3.Ⅰ型顆粒細胞, 示顆粒G1、G2, ×20 000; 3-4. Ⅰ型顆粒細胞, 示顆粒G1、G2和G3, ×80 000; 3-5. Ⅱ型顆粒細胞, 示顆粒G1、G4, 細胞質中有發達的高爾基體(GA)存在, ×30 000; 3-6.特殊顆粒細胞, ×30 0003-1. Monocyte, showing irregular nucleus (N), mitochondria (M), ×30 000; 3-2. Lymphocyte, showing large nucleolus (N) and small cytoplasm, ×40 000; 3-3: Granulocyte Ⅰ, showing G1 and G2 granules, ×20 000; 3-4. Granulocyte Ⅰ, showing G1, G2, and G3 granules, ×20 000; 3-5. Granulocyte , showing G1Ⅱand G4 granules and Golgi apparatus (GA) ×20 000; 3-6. Special granulocyte, ×30 000

從形態上看, 半滑舌鰨的腎臟分為頭腎和體腎兩部分, 頭腎位于腎臟的前端, 分成兩叉; 體腎緊貼腹腔背部, 從鰓蓋處沿脊椎向后延伸, 直至腹腔尾部。這個結構與牙鲆[3]腎臟結構相似, 但并不完全相同, 牙鲆頭腎與體腎之間沒有明顯的界限, 半滑舌鰨頭腎與體腎連接部位較細。孟慶聞等[2]將硬骨魚的腎臟根據形態歸納為5類, 半滑舌鰨與牙鲆的腎臟結構與這5類都有較大差異。根據形態特征, 半滑舌鰨與牙鲆腎臟可以歸為一類, 但是否能夠代表鲆鰈魚類腎臟, 還需要歸納更多鲆鰈魚類的腎臟特征才能確定。

魚類腎臟在系統發育上一般經歷前腎和中腎兩個階段, 前腎只出現于胚胎階段, 具有排泄功能, 但在成魚中逐漸退化, 大多失去了排泄功能; 但是很多真骨魚的前腎殘存下來, 成為類淋巴組織, 具有免疫和造血功能, 也就是頭腎[12]。雄性軟骨魚成魚腎臟前部被輸精管占據, 其腎小體較硬骨魚更發達,腎小管保留少量從體腔中收集廢物的腎口, 但主要是直接從血液中收集含氮廢物排出體外, 由輸尿管輸尿[13]。

圖4 半滑舌鰨頭腎印跡片免疫組化Fig. 4 Immunohistochemical staining of a head kidney smear from half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)4-1. CD16單克隆抗體(RLM3090)標記免疫球蛋白使用抗體, ×20; 4-2. CD68單克隆抗體(RLM3161)標記巨噬細胞黏蛋白, ×20; 4-3. CD20單克隆抗體(RLM3048)標記B淋巴細胞, ×20; 4-4. CD4單克隆抗體(RLM3070)標記T淋巴細胞表面糖蛋白, ×204-1. CD16 monoclonal antibody (RLM3090) detected low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A/low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B, ×20; 4-2. CD68 monoclonal antibody (RLM3161) detected macrosialin, ×20; 4-3. CD20 monoclonal antibody (RLM3048) detected B-lymphocyte antigen CD20, ×20; 4-4. CD4 monoclonal antibody (RLM3070) detected T-cell surface glycoprotein CD4, ×20

魚類頭腎含有豐富的血管、血竇和血細胞, 介導和參與免疫反應[14], 不僅是免疫細胞發生、分化和增殖的重要場所, 還是捕獲抗原和產生抗體的主要場所[15]。鯉(Cyprinus carpio)的頭腎主要為淋巴細胞聚集的淋巴髓樣組織, 無淋巴區和非淋巴區之分[16], 與淋巴細胞的增殖有關, 不能生成紅細胞或粒細胞[17]。草魚(Ctenopharyngodon idellu)的頭腎包括淋巴細胞聚集區和粒細胞聚集區, 這兩個區域之間也沒有明顯界限[18-19], 主要有淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、單核細胞和粒細胞等, 其中粒細胞又根據胞漿內特殊顆粒的形態結構和大小分為3個型[19]。羅非魚(Oreochromis niloticus)的頭腎主要包括紅細胞、淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、巨噬細胞和黑色素巨噬細胞中心, 其中粒細胞包括3個型[20]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)頭腎與體腎在形態上并沒有明顯的界限, 頭腎實質是由許多血竇、網狀細胞、少量的噬黑色素細胞和各種血細胞交織在一起構成的,其免疫細胞包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、Ⅰ型顆粒細胞和Ⅱ型顆粒細胞[21]。大菱鲆(Scophthalmus maximus)早期頭腎發育形成的過程中, 其前腎小管結構退化的同時, 形成黑色素細胞-巨噬細胞中心,失去了分泌和排泄功能, 成為免疫和造血組織[22]。本研究中, 半滑舌鰨頭腎組織涂片以及石蠟切片結果均未發現噬黑色素細胞, 從電鏡圖中可以發現和牙鲆相似的Ⅰ型顆粒細胞和Ⅱ型顆粒細胞, 同時還存在一些特殊形態的顆粒細胞。通過以上比較, 發現雖然頭腎的功能在不同魚種間相似, 都參與免疫應答,但是對細胞組成的分析結果顯示細胞類型在不同魚種間有不同程度的區別, 這也暗示魚類頭腎的功能存在細微的多樣性。

魚類的體腎是成魚的排泄器官, 也具有調節滲透的功能。半滑舌鰨體腎中分布大量的腎單位, 石蠟切片的結果可以看到腎小囊、近曲小管、遠曲小管以及集合管等結構。牙鲆的體腎可以分為中腎和后腎兩部分, 兩者的差別是中腎有一條“腎中管”; 腎小管占體腎70%以上的體積; 另外, 在牙鲆體腎中還發現黑色素巨噬細胞, 這說明牙鲆的體腎在調解滲透、排泄廢物的同時, 也參與宿主的免疫應答過程[3];同樣, 大菱鲆在早期發育體腎成熟后, 除了腎小管結構, 還可在體腎中觀察到豐富的淋巴細胞[22]。本研究未在半滑舌鰨體腎中觀察到相應的結構與細胞。

半滑舌鰨是中國重要的經濟海水魚類, 但是疾病問題仍然是困擾產業發展的重要問題?；及牖圉嵠⒛I壞死癥的魚腎臟有嚴重的病理變化, 研究引起這種病理變化的原因以及腎臟的功能受到哪些影響, 都需要腎臟組織結構的理論支持。本研究對半滑舌鰨腎臟的形態與細胞組成進行了初步研究, 初步闡明了腎臟結構與形態。今后還應對半滑舌鰨體腎更精細的結構進行研究, 從而進一步了解半滑舌鰨腎臟結構與功能。

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Histological structure and cell distribution of the tongue sole (Cynoglossus semilaevis) kidney

SUN Bin1, SUN Jin-sheng1, ZHANG Li-na2, XIAO Peng3,4
(1. College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China; 2. National & Regional Joint Engineering Laboratory for Ecological Mariculture, Qingdao 266071, China; 3. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Jun. 22, 2016

Cynoglossus semilaevis; kidney; histological structure; paraffin section; ultrathin section

Half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis) is an important aquaculture species in China. Here, we illustrated the structure of the tongue sole kidney by observing paraffin sections and ultrathin sectioned samples by light and transmission electron microscopy. The tongue sole kidney was anatomically divided into the head and trunk kidneys. The head kidney was a biforked structure in front of the trunk kidney. The head kidney was located on top of the heart, close to the rear of the head. Some blood cells and many immune cells were found in the head kidney, such as lymphocytes, monocytes, and granulocytes. We inferred that the tongue sole head kidney played an important role in the immune response and hemopoiesis. The trunk kidney was located immediately behind where the two head kidney branches joined. The trunk kidney was stretched along the spine in the abdominal cavity and was composed of many glomerular secretory structures and renal units, indicating that it possesses an excretory function.

Q174

A

1000-3096(2017)04-0024-07

10.11759//hykx 20160622001

(本文編輯: 譚雪靜)

2016-06-22;

2016-12-15

國家自然科學基金項目(31672692); 山東省自主創新及成果轉化專項(2014ZZCX06204); 鰲山科技創新計劃(2015ASKJ02)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.31672692; Independent Innovation and Achievements Transformation Special Foundation of Shandong Province, No.2014ZZCX06204; The Scientific and Technological Innovation Project, No.2015ASKJ02]

孫斌(1991-), 女, 天津人, 碩士研究生, 主要從事水生動物疾病防控研究, E-mail: sunbin91@126.com; 肖鵬, 通信作者, 副研究員, E-mail: xiaopeng@qdio.ac.cn