星形膠質細胞活化后瞬時受體電位通道6在TBI中的作用*

張禮均，馮 華

(1.重慶市急救醫療中心神經外科 400014；2.第三軍醫大學西南醫院神經外科，重慶 400038)

星形膠質細胞活化后瞬時受體電位通道6在TBI中的作用*

張禮均1，馮 華2△

(1.重慶市急救醫療中心神經外科 400014；2.第三軍醫大學西南醫院神經外科，重慶 400038)

目的 探討大鼠顱腦損傷(TBI)后星形膠質細胞(AST)瞬時受體電位通道(TRPC)6在TBI中扮演的角色。方法 將健康成年雄性SD大鼠39只分為假手術組、致傷組和去鐵胺(DFX)組，每組13只。參照Feeney法建立大鼠大腦沖擊傷模型，完成Morris水迷宮實驗、大腦缺損體積，免疫熒光檢測TRPC6與神經膠質原纖維酸性蛋白質(GFAP)共表達，以及Western blot定量檢測TRPC6水平。結果 DFX組比致傷組大鼠大腦缺損體積明顯減小[(115.35±13.70)mm3vs.(209.99±16.70)mm3，P<0.05]，Morris水迷宮實驗發現DFX組平臺搜索策略[(3.13±0.35)分]和搜索時間[(36.15±26.63)s]均較致傷組[(2.13±0.64)分和(110±47.34)s]明顯改善(P<0.05)。免疫熒光雙標發現DFX組GFAP高表達，且與TRPC6共表達增多。Western blot定量檢測發現DFX組TRPC6明顯下調(P<0.01)。結論 大鼠TBI早期DFX治療后AST活化，TRPC6高表達，進而起到神經保護作用。

顱腦損傷；神經膠質原纖維酸性蛋白質；瞬時受體電位通道；去鐵胺

顱腦損傷(TBI)一直表現為高致殘率和高死亡率，是神經外科救治重點難點，而神經外科醫師關注的焦點依然是如何挽救損傷灶周圍的“半暗帶(penumbra)”，以挽救更多的神經細胞，保留更多神經功能，從而達到改善患者預后的目的。既往“半暗帶”神經元的保護是實驗研究的重點，然而，眾所周知，中樞神經系統中，絕大多數是星形膠質細胞(AST)，AST在TBI中扮演的作用知之甚少。體外實驗研究發現膠質細胞活化可以預防鐵離子進入突觸間隙，從而避免鐵超載造成神經元的毒性作用[1]，與本課題前期研究結果一致[2]，因此作者認為AST可能在TBI中扮演重要角色，現將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康成年雄性SD大鼠39只，由第三軍醫大學大坪醫院野外戰外科研究所實驗動物中心提供。主要試劑：甲磺酸去鐵胺(DFX，諾華制藥，瑞士)；兔抗Actin多克隆抗體(ABCAM公司，英國)；神經膠質原纖維酸性蛋白質(GFAP)抗體(Sigma，美國)；瞬時受體電位通道(TRPC)6抗體(Sigma，美國)；熒光二抗(中杉公司，中國)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5X)，P0015(武漢碧云天，中國)；TEMED，15524010(Invitrogen，美國)；瓊脂糖(TAKARA，日本)。主要設備：Leica TCS NT型激光共聚焦顯微鏡(德國)；Morris水迷宮(江蘇，中國)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立與分組 參照Feeney法建立大鼠大腦沖擊傷模型，1%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，大鼠立體定向儀固定大鼠頭部，正中切口開顱，鉆孔位于冠狀縫后2.00 mm和矢狀縫右側2.00 mm，擴大骨窗約6.00 mm，充分暴露腦組織，并保持硬膜完整，立體定向固定打擊桿，打擊桿重量30.00 g，高度15.00 cm，直徑4.50 mm，垂直腦表面進行打擊，制備大鼠大腦沖擊傷模型。將39只SD大鼠分為假手術組、致傷組、DFX組，每組13只。致傷組和DFX組，于模型制備后2.00 h分別給予生理鹽水、DFX 100 mg/kg(用等量生理鹽水溶解稀釋)腹腔注射，間隔12 h給藥1次，直至28 d實驗結束。假手術組只開顱，不打擊，給藥方法同致傷組。

1.2.2 Morris水迷宮 于模型制備后23 d，將各組動物進行Morris水迷宮實驗訓練，每天2次，于28 d動物處死前，完成Morris水迷宮實驗，評估實驗動物的空間學習記憶力。

1.2.3 大腦缺損體積 于28 d實驗結束時處死各組動物，完整保留大腦組織，采用多田公式計算大鼠大腦缺損體積。

1.2.4 TRPC6與GFAP免疫熒光雙標 取額部致傷灶周圍腦組織，采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ進行石蠟切片脫蠟，梯度乙醇(下行)入水，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，加封閉血清，0.01 mol/L PBS漂洗1次，加TRPC6抗體(1∶100)，孵育1.00 h，室溫，過夜，0.01 mol/L PBS漂洗3次，加熒光二抗(羊抗小鼠/FITC，1∶50)，37 ℃，1.00～1.50 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，封閉血清30 min；加GFAP抗體(1∶100)，孵育1.00 h，室溫，過夜，0.01 mol/L PBS漂洗3次，加GFAP熒光二抗(兔抗羊/CY3，1∶50)，37 ℃，1.00～1.50 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，DAPI復染胞核，0.01 mol/L PBS漂洗3次，甘油封片。對照實驗：不加一抗，用健康人或兔血清代替免疫血清，其余步驟同上，結果為陰性。

1.2.5 Western blot檢測 蛋白裂解液裂解細胞提取細胞內蛋白，BCA法進行蛋白質定量，用SDS-PAGE進行電泳分離，轉PVDF膜。轉膜完以后用去離子水泡下膜，倒掉廢液加適量5%脫脂奶粉，搖2.00 h，TBST洗膜3次，每次10 min，TRPC6孵育(1∶700)，4 ℃搖床過夜，轉至室溫搖置約30 min，以恢復室溫，TBST洗膜3次，每次10 min，加辣根過氧化物酶標記二抗(1∶500)，搖床搖2.00 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL顯色并曝光顯影，保存圖片。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗 完成5 d的訓練后，進行Morris水迷宮實驗(圖1)。假手術組動物能迅速搜索到平臺，需時(18.77±5.99)s，搜索策略基本都是直線式或趨向式[(3.63±0.52)分]；而致傷組動物搜索到平臺的時間為(110.12±47.34)s，搜索策略基本為邊緣式或隨機式[(2.13±0.64)分]；DFX組動物搜索到平臺的時間為(36.15±26.13)s，搜索策略基本為趨向式[(3.13±0.35)分]。致傷組搜索時間明顯延長，搜索策略以邊緣式或隨機式為主，與假手術組比較，致傷組無論是平臺搜索時間還是搜索策略差異均有統計學意義(P<0.01)；DFX組搜索時間明顯縮短，搜索策略以趨向式為主，與致傷組比較，DFX組平臺搜索時間和搜索策略差異均有統計學意義(P<0.05)；DFX組與假手術組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

A：假手術組；B：致傷組；C：DFX組。

圖1 Morris水迷宮實驗軌跡圖

2.2 各組大鼠大腦缺損體積比較 28 d實驗結束，致傷組和DFX組可見致傷側半球缺損體積直徑較打擊桿直徑顯著增加，致傷組傷側僅殘留少量皮層和額葉、枕葉腦組織，而DFX組大腦缺損體積明顯縮小(圖2)。與致傷組[(209.99±16.70)mm3]比較，DFX組[(115.35±13.70)mm3]大腦缺損體積明顯減輕(P<0.05)。

S1、S2、S3：假手術組；D1、D2、D3：DFX組；I1、I2、I3：致傷組。

圖2 各組大鼠28 d實驗結束時大腦大體標本

2.3 TRPC6+GFAP免疫熒光雙標 檢測TRPC6與GFAP共表達情況(圖3)，發現假手術組GFAP高表達，TRPC6低表達，TRPC6與GFAP共表達甚少，且密度低，共表達呈橙色；致傷組致傷灶周圍TRPC6表達明顯增強，但卻偶見GFAP染色陽性的細胞，共表達也少見，但可見TRPC6表達強化的突起；DFX組可見TRPC6表達較致傷組下調，而GFAP染色陽性的細胞數量多，細胞體增大，與TRPC6共表達數量顯著增加。

2.4 各組大鼠TRPC6表達水平比較 Western blot檢測TRPC6表達情況(圖4)，發現假手術組TRPC6表達較弱，致傷組TRPC6表達顯著增強，予以DFX治療后，TRPC6表達顯著下調。進一步采用Quantity One Version 4.4軟件半定量分析，結果發現假手術組TRPC6表達較低(1.17±0.04)；與假手術組比較，致傷組明顯升高(1.50±0.09)，差異有統計學意義(P<0.05)；與致傷組比較，DFX組明顯下降(1.16±0.04),差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 GFAP+TRPC6免疫熒光雙標

a：P<0.05，與致傷組比較。

圖4 各組大鼠TRPC6表達水平比較

3 討 論

AST是中樞神經系統最多的細胞[3]，在鐵轉運方面扮演重要角色，而不是儲存鐵，然而其作用卻往往被忽視。有研究發現，TBI后AST的功能狀態會通過調控谷氨酸攝取和釋放[4-5]、神經元能量物質的代謝[6-7]來影響神經元的存活。Lin等[8]發現，TBI后自噬和凋亡可導致AST損傷,運用白藜蘆醇能抑制活性氧族累積，減少谷氨酸的毒性作用，起到保護AST的作用，進而保護神經元，改善神經功能。

課題組前期研究發現，TBI予以DFX能顯著改善空間學習記憶力，但機制不清[2,9]。眾所周知，中樞神經系統中AST的數量約占90%，且對鐵離子等神經毒性物質的耐受性好于神經元。本課題進一步研究發現DFX組AST細胞體肥大，GFAP染色明顯增強，同時TRPC6表達明顯增強，予以DFX治療能顯著減少大鼠大腦缺損體積，并改善大鼠空間學習記憶力。推測其機制，予以DFX激活AST，上調TRPC6表達，攝取鐵離子增加，達到神經保護的作用。

有研究發現，AST活化的特點之一就是中間絲(波形蛋白和GFAP)增加，導致細胞分裂增加和細胞肥大[10-11]。跟小膠質細胞類似，AST活化促使大量神經營養物質產生，受損細胞免于死亡[12-13]，且減少谷氨酸對神經細胞的興奮性毒性作用[14]。AST可以轉運鐵離子，而不是儲存鐵離子，有研究發現脫髓鞘大鼠表現出AST鐵累積、鐵蛋白和抗氧化的血紅蛋白加氧酶都增加，提示AST通過鐵離子相關的自身調節途徑發生保護反應減少了鐵離子介導的細胞毒性作用。本實驗觀察到DFX組AST細胞體顯著增大，提示早期DFX治療后可以引起AST活化。Pelizzoni等[1]發現，神經退行性疾病存在鐵離子誘導AST活化，攝取更多鐵，從而減少鐵超載所致神經毒性作用，達到保護神經元的作用，與本實驗結果一致，提示TBI后AST細胞肥大可能是一種神經保護作用[15]，可能機制是AST活化后，TRPC6表達強化，攝取更多鐵離子進入AST，減少鐵超載所致神經毒性，達到神經保護作用。

綜上所述，作者推測，TBI后大量鐵離子早期即導致“半暗帶”大量AST和神經元死亡，造成大腦缺損體積增加，動物空間學習記憶力下降，而早期予以DFX治療有效可能是DFX螯合大量鐵離子后，避免AST和神經元迅速死亡，存活下來的AST活化，通過TRPC6等將過量鐵離子轉運入活化AST，避免過量鐵離子造成神經元損傷而起到神經保護的作用，為臨床TBI救治開辟一條新思路。

[1]Pelizzoni I,Zacchetti D,Campanella A,et al.Iron uptake in quiescent and inflammation-activated astrocytes:a potentially neuroprotective control of iron burden[J].Biochim Biophys Acta,2013,1832(8):1326-1333.

[2]張禮均,胡榮,李飛,等.去鐵胺對大鼠大腦打擊傷的治療作用[J].第三軍醫大學學報,2012,34(23):2349-2352.

[3]De Keyser J.Mostert JP.Koch MW.Dysfunctional astrocytes as key players in the pathogenesis of central nervous system disorders[J].J Neurol Sci,2008,267(1/2):3-16.

[4]Myer DJ,Gurkoff GG,Lee SM,et al.Essential protective roles of reactive astrocytes in traumatic brain injury[J].Brain,2006,129(10):2761-2772.

[5]Rosenberg PA.Accumulation of extracellu1ar glutamate and neuronal death in astrocyte-poor cultures exposed to glutamine[J].Glia,1991,4(1):91-100.

[6]Reiner DJ,Mietlicki-Baase EG,McGrath LE,et al.Astrocytes regulate GLP-1 receptor- mediated effects on energy balance[J].J Neurol,2016,36(12):3531-3540.

[7]Kiray H,Lindsay SL,Hosseinzadeh S,et al.The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination[J].Exp Neurol,2016,283(Pt B):541-549.

[8]Lin C,Chen T,Yang L,et al.Resveratrol protects astrocytes against traumatic brain injury through inhibiting apoptotic and autophagic cell death[J].Cell Death Dis,2014,5(3):e1147.

[9]張禮均,胡榮,李飛,等.瞬時受體電位通道6在大鼠大腦沖擊傷后鐵代謝中的作用[J].第三軍醫大學學報,2012,34(23):2353-2356.

[10]Herrmann JE,Imura T,Song B,et al.STAT3 is a critical regulator of astrogliosis and scar formation after spinal cord injury[J].J Neurol,2008,28(28):7231-7243.

[11]Lee KM,Maclcan A.New advances on glial activation in health and disease[J].World J Virol,2015,4(2):42-55.

[12]Zhao Z,Alam S,Oppenheim RW,et al.Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor in the CNS rescues motoneurons from programmed cell death and promotes their long-term survival following axotomy[J].Exp Neurol,2004,190(2):356-372.

[13]Matsui T,Moil T,Tateishi N,et al.Astrocytic activation and delayed infarct expansion after permanent focal iachemia in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(6):711-722.

[14]Schousboe A,Sonnewald U，Civenni G,et al.Role of astrocytes in glutamate homeostasis:implications for excitotoxicity[J].Neurotox Res,2005,8(3):221-225.

[15]Pardo L,Schluter A,Valor LM,et al.Targeted activation of CREB in reactive astrocytes is neuroprotective in focal acute cortical injury[J].Glia,2016,64(5):853-874.

Effect of TRPC6 after astrocytes activation in traumatic brain injury*

ZhangLijun1,FengHua2△

(1DepartmentofNeurosurgery,ChongqingMunicipalEmergencyMedicalCenter,Chongqing400014China; 2DepartmentofNeurosurgery,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To explore the role of astrocytes transient receptor potential channel 6(TRPC6) in rat brain injury(TBI).Methods Thirty-nine male Sprague-Dawley(SD) rats were divided into the sham operation group,injury group and deferoxamine(DFX) group(n=13).According to the previous model construction scheme established by our research group Feeney method,the rat brain impact injury model was established.The Morris water maze test was performed and the defected brain volume was measured.The immunofluorescence was adopted to detect the co-expression of TRPC6 and GFAP.Then Western blot was performed.Results The defected brain volume after TBI in the DFX group was significantly decreased compared with the injury group[(115.35±13.70)mm3vs.(209.99±16.70)mm3]](P<0.05).The Morris water maze test found that the platform search strategy and search time in the DFX group were(3.13±0.35) and(36.15±26.63)s,which were significantly improved compared with(2.13±0.64) and(110±47.34)s in the injury group(P<0.05).The immunofluorescence found that GFAP in the DFX group was highly expressed,moreover the co-expression with TRPC6 was increased.Western blot found that TRPC6 in the DFX group was significantly down-regulated(P<0.01).Conclusion In rat TBI early stage,strocytes are activated after DFX treatment and TRPC6 is highly expressed,playing a neuroprotective role.

traumatic brain injury;glial fibrillary acidic protein;transient receptor potential channels;deferoxamine

國家自然科學基金青年基金項目(30901545)；重慶市自然科學基金項目(cstc2015jcyjA1051);重慶市衛計委臨床重點?？祈椖?渝衛醫函2015-517)。 作者簡介：張禮均(1975-)，主治醫師，博士，主要從事顱腦創傷及神經外科重癥監護的研究?！?/p>

，E-mail:fenghua8888@vip.163.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.003

R642；R651.1+5;R965

A

1671-8348(2017)18-2456-03

2017-01-12

2017-03-16)