4-氯苯氧乙酸鈉對大豆芽品質的影響及其安全風險性分析

李長鳳，王沙沙，崔小利，譚悅，丁涌波，闞建全,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶,400715)3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

4-氯苯氧乙酸鈉對大豆芽品質的影響及其安全風險性分析

李長鳳1，王沙沙1，崔小利1，譚悅1，丁涌波1，闞建全1,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶,400715)3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

為了觀察和探討4-氯苯氧乙酸鈉(sodium 4-chlorophenoxyacetate，4-CPANa)對大豆芽生長狀況的影響及其安全風險評價，實驗優化了大豆芽中4-CPANa的測定方法，同時設計了大豆芽生產模擬實驗，分別用4-CPANa浸泡自來水培育(方式一)、4-CPANa浸泡并噴灑自來水培育(方式二)和4-CPANa噴灑法自來水培育(方式三)3種方式培育大豆芽，對成熟大豆芽進行感觀評定和基本生長指標測定，并對培育大豆芽中4-CPANa的殘留量進行了分析。結果表明：優化的4-CPANa測定方法對大豆芽樣品中4-CPANa測定的回收率為84.67%～89.78%，最低檢出限為0.05 mg/kg。,3種培育方式下，其方式一中添加0.5 mg/L 的4-CPANa和方式三中添加5 mg/L 的4-CPANa的大豆芽在色澤、外觀、滋味氣味、組織形態上得分相對較高，總分分別為83.67、83.45。按方式一培育大豆芽其產率、鮮重、軸徑、軸長、根比重、根長較佳的4-CPANa添加濃度0.5 mg/L；按方式二較佳的添加濃度0.5 mg/L；按方式三較佳的添加濃度5 mg/L。3種培育方式下，各處理組大豆芽中4-CPANa的殘留量均隨著培育時間的延長而減少。綜合比較得出方式三即4-CPANa濃度為5 mg/L的總體效果最好，且最終無殘留，在人群中沒有暴露風險。

大豆芽；4-氯苯氧乙酸鈉；生長狀況；安全風險評價

大豆芽，又名如意菜、芽苗菜，是一種四季可生產且物美價廉的蔬菜，同時富含VC、氨基酸、膳食纖維等對人體有益的成分，且脂肪和膽固醇含量很低，深受廣大消費者喜愛[1-3]。但近年來不法商家在利益的驅使下，為了縮短大豆芽生產周期，改善大豆芽外觀，增加大豆芽產量，在大豆芽的生產過程中非法添加對人體有害的農藥、獸藥、抗生素、激素等。據相關報道[4-8]，大豆芽中主要添加的激素為6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)和4-氯苯氧乙酸鈉(sodium 4-chlorophenoxyacetate，4-CPANa)，其中4-CPANa的檢出率和超標率較為嚴重。

4-CPANa俗稱促生靈、番茄靈、防落素，為內吸性光譜植物生長調節劑。在大豆芽生產中，4-CPANa可以促進大豆芽下胚軸粗大、減少根部萌發、加速細胞分裂。相關研究表明[9-10]，4-CPANa對小鼠為低毒、低蓄積性藥物，其毒性效應主要表現為對小鼠肝臟和腎臟的毒性作用。此外，4-CPANa能夠誘導大鼠性細胞凋亡。因此4-CPANa在人體內的殘留及其對健康的危害作用不容忽視。而4-CPANa是否可以作為添加劑在大豆芽生產中使用，也是一直爭論的熱點。我國GB2760—1996中曾經允許4-CPANa使用并規定4-CPANa的殘留量小于0.1 mg/kg，但在這之后的GB2760《食品添加劑使用標準》中將其刪除，不再用于大豆芽生產。美國規定4-CPA可用于無根綠豆芽，殘留限量為0.01 mg/kg。而歐盟4-CPA則未獲批準，不能使用[11-13]。

目前，對大豆芽中4-CPANa的研究大多集中在檢測方法上[14-18]，而4-CPANa對大豆芽品質的影響及在大豆芽中的殘留變化和安全性風險分析的研究較少。因此，本研究設計大豆芽生產模擬實驗，在大豆芽生產過程中采用不同添加方式和不同濃度的4-CPANa溶液，研究其對大豆芽品質的影響，并根據4-CPANa在大豆芽中的殘留量進行安全風險評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆種子，重慶市江北區盤溪農產品批發市場；4-CPANa標準品，德國Dr. Ehrenstorfer公司；4-CPANa優級純，合肥博美生物科技有限公司；N-丙基乙二胺(PSA)，Agilent公司；乙腈、H3PO4、NaCl、HCl：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

Bear DYJ-S6031豆芽機，廣州小熊電器有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司； 5810離心機，德國eppendorf公司；SB 25-12超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

本文對大豆芽生產作坊和農貿市場進行調研后，總結出以下3種常用的大豆芽培育方式：

方式一：4-CPANa浸泡自來水培育，即分別用0、0.5、1、5、10 mg/L的4-CPANa溶液浸泡大豆5 h后，放入豆芽機中用自來水培育78 h。依次記為CK、C1-0.5、C1-1、C1-5、C1-10。

方式二：4-CPANa浸泡噴灑自來水培育，分別用0、0.5、1、5、10 mg/L的4-CPANa溶液浸泡大豆5 h后放入豆芽機中用自來水培育，并在每天的早晨(8∶00)噴淋1次對應濃度的4-CPANa溶液1 min；依次記為CK、C2-0.5、C2-1、C2-5、C2-10。

方式三：4-CPANa噴灑自來水培育，以自來水浸泡大豆5 h后放在豆芽機中用自來水培育，并分別用0、0.5、1、5、10 mg/L的4-CPANa溶液在每天的早晨(8∶00)噴淋一次對應濃度的4-CPANa溶液1 min；依次記為CK、C3-0.5、C3-1、C3-5、C3-10。

實驗培育溫度范圍為23～28℃，前5 h屬于浸泡階段，每隔5 min噴水1次，5 h之后為培育階段，每隔1 h噴水1次，每次噴水時間為1 min，整個過程避光。

1.4 分析測定方法

1.4.1 感官評定方法

參照模糊數學綜合評價法[19]對給定大豆芽從色澤、外觀、滋味氣味和組織形態四方面進行綜合評分，評分標準[20-21]見表1?？偡?∑(項目得分×權重)，取平均分作為最終評分。

1.4.2 基本指標的測定方法

按四分法取樣，在大豆芽培育盤中每部分隨機取4根大豆芽，共16根，作為樣本。參照張永清等方法[22]分別測定其產率、鮮重、軸長、軸徑、根比重、根長等指標。

表1 大豆芽的感官評定評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of bean sprouts

1.4.3 大豆芽中4-CPANa的測定方法

1.4.3.1 樣品前處理

稱取粉碎后的大豆芽試樣10 g于50 mL離心管中，加入100 mg/L的4-CPANa工作液1mL，再加入19 mL酸化乙腈，300 W超聲20 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL濃縮至3 mL，轉入15 mL離心管中并用乙腈定容至5 mL，加入1 mL HCl溶液，振搖混勻后加入2.5 g NaCl，混勻，靜置10 min，取2mL上清液于4 mL離心管中，加入50 mg的PSA，3 000 r/min離心2 min。上清液用氮氣吹干后加1 mL酸化乙腈搖勻至完全溶解，經0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜分析測定。

1.4.3.2 液相色譜條件[25-26]

色譜柱：ZORBAX SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；測定波長：228 nm；流動相：乙腈+磷酸鹽緩沖液(65+35)，其中磷酸鹽緩沖液pH=3.0。

1.4.3.3 標準曲線的繪制

分別吸取4-CPANa標準工作液用色譜級酸化乙腈稀釋，配制成濃度依次為0.5、1、2、5、10 mg/L的標準系列溶液，液相色譜進行檢測，以峰面積Y(mAU)對濃度X(mg/L)進行線性回歸，回歸方程為Y=29.53X+0.801，回歸系數R2=0.999 3。

1.5 試驗數據處理方法

所有試驗數據均是3次重復試驗的平均值。使用SPSS 17.0對相關數據進行方差分析，顯著性水平為p<0.05，采用皮爾森相關系數雙尾檢驗(Two-tailed)法；并使用Excel、Origin 9.0等軟件進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 大豆芽中4-CPANa的測定方法優化實驗

本文參照楊婕等方法[25-26]，結合QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)前處理技術，對大豆芽中4-CPANa的測定方法進行了優化。

2.1.1 色譜條件的選擇

2.1.1.1 測定波長的選擇

本文對2 mg/L和10 mg/L的4-CPANa標準溶液在190～400 nm進行掃描。由圖1可見， 2 mg/L和10 mg/L的4-CPANa均在228 nm處有最大吸收峰，因此選取228 nm作為測定波長。

圖1 4-CPANa的吸收光譜圖Fig.1 The absorption spectrum of 4-CPANa

2.1.1.2 流動相的選擇

經預試驗發現，楊婕等[25]采用梯度洗脫程序對樣品進行測定，容易造成液相色譜圖基線漂移，影響對4-CPANa的準確定量。因此本文分別以乙腈+磷酸鹽緩沖液為流動相，進行等度洗脫。分別設置乙腈+磷酸鹽緩沖液比例為70∶30、65∶35、60∶40、55∶45進行實驗，結果顯示乙腈和磷酸鹽比為65∶35時，4-CPANa分離效果最好。再在此條件下調整磷酸鹽緩沖液pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，結果顯示pH=3.0時，4-CPANa峰形最好。

2.1.2 樣品處理

2.1.2.1 提取劑的選擇試驗

本實驗比較了目前實驗室常用和文獻報道較多的酸化乙腈(含乙酸0.1%)、乙腈為提取劑[23-25]。由表2可得，以酸化乙腈為提取劑提取大豆芽中4-CPANa的回收率比乙腈高，且相對標準偏差較小，這和柳菡[27]的研究結果一致。因此，選擇酸化乙腈作為大豆芽中4-CPANa的提取劑。

表2 采用2種不同溶劑提取時4-CPANa的回收率Table 2 Extraction recoveries of 4-CPANa with two extraction solvents

2.1.2.2 超聲法提取大豆芽中4-CPANa條件的選擇試驗

本文比較了樣品在200、250、300、350 W功率下，依次超聲提取10、20、30、40、50、60 min后，樣品中4-CPANa的含量。由圖2可知，樣品在200、250、300、350 W功率下提取時，樣品中4-CPANa含量分別在40、20、20、20 min處達到最大值，說明較高功率可以加速4-CPANa的提取速度，縮短提取時間。但隨著超聲時間延長，350 W超聲時4-CPANa含量下降明顯。研究表明[28]，超聲波可以破壞植物細胞壁，促進有效成分的釋放并溶入提取溶劑，因此，一定功率超聲時，可促進目標物的提取，當功率過高時，會引起目標物降解損耗，同時會引起大豆芽中脂溶性物質溶入提取液中，影響目標物的提取率。因此，綜合考慮，選擇功率為300 W，超聲20 min為提取條件。

圖2 超聲功率和時間對4-CPANa測定結果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time or power on the determination of 4-CPANa

2.1.2.3 提取液的濃縮試驗

為降低大豆芽中4-CPANa的檢出限，本文在酸化乙腈提取大豆芽中4-CPANa后，將原來的10 mL提取液濃縮至5 mL，然后取2 mL凈化，用氮氣吹干，并用酸化乙腈定容至1 mL；2次濃縮后相同含量的4-CPANa在液相色譜圖上的響應值增大，檢出限降至0.05 mg/kg。

2.1.3 大豆芽中4-CPANa測定的方法考察

按照2.1.1和2.1.2中優化后的條件，測定大豆芽中4-CPANa的殘留，結果如圖3所示。

A:4-CPANa標準色譜圖； B:大豆芽樣品中4-CPANa加標色譜圖；C:空白大豆芽樣品中4-CPANa色譜圖圖3 大豆芽中4-CPANa測定的方法考察結果Fig.3 The determination method of 4-CPANa in bean sprouts was investigated

4-CPANa標準品的保留時間為7.596 min，空白大豆芽樣品中未檢測到4-CPANa；大豆芽加標樣品中目標物色譜峰的保留時間為7.582 min，與標準品相比在±2.5%的允許偏差之內。根據保留時間和樣品加標疊加圖譜定性，可知大豆芽中本身沒有4-CPANa殘留，且該方法能夠將4-CPANa與其他干擾峰分開。

精密度和準確度試驗為在空白大豆芽樣品中分別加入0.4、1.5、5 mg/L 3個濃度的4-CPANa標準溶液，測定4-CPANa在大豆芽樣品中的回收率，結果見表3。該方法的平均回收率為84.67%～89.78%，其RSD均小于6%。將加標5 mg/L的6組大豆芽前處理后進行測定，其RSD為4.09%。說明該方法的準確度和精密度可以滿足4-CPANa的檢測要求。

表3 大豆芽中4-CPANa的加標回收率實驗Table 3 The recoveries experiment of 4-CPANa in bean sprouts

2.2 4-CPANa對大豆芽品質的影響

2.2.1 4-CPANa對大豆芽感官品質的影響

如表4所示，3種方式處理的各組大豆芽在滋味氣味上得分都與對照組相近。隨著4-CPANa處理濃度增加，3種方式處理的大豆芽在色澤、外觀、組織形態上得分均呈現先升高后降低的趨勢，這可能是由于低濃度4-CPANa處理后大豆芽的根長被抑制，而高濃度4-CPANa處理組大豆芽的根和軸長均受到抑制，下胚軸膨大起結，顏色也暗淡，故評分出現降低[29]。根據感官評定結果，以方式一處理的各組大豆芽中，C1-0.5組和C1-1組感官評定所得總分均高于對照組，而C1-10組與對照組相比，感官評定所得總分呈顯著性降低；以方式二處理的各組大豆芽中，C2-0.5組和C2-1組的感官總分較對照組呈顯著性增加；以方式三處理的各組大豆芽中，各實驗組別的感官總分差異性不顯著，均較對照組有所上升。綜合考慮，方式一為0.5 mg/L的4-CPANa處理的大豆芽(C1-0.5組)感官品質最好，得分83.67；方式二為0.5 mg/L(C2-0.5組)，得分82.91；方式三為5 mg/L (C3-5組)，得分83.45。

2.2.2 4-CPANa處理的大豆芽基本指標的測定結果

由圖4所示，按方式一處理的大豆芽，隨4-CPANa濃度的增加，軸徑逐漸增加，根比重和根長逐漸減小，其產率、鮮重、軸長也逐漸減小，但0.5 mg/L組和1 mg/L組與對照組相比沒有顯著性差異。綜合考慮，方式一處理以0.5 mg/L的4-CPANa浸泡大豆后自來水培育(C1-0.5組)所獲大豆芽品質最好。

按方式二處理的大豆芽，產率、鮮重、軸長和根比重的變化趨勢及各組間的顯著性分析結果與方式一致。而對于軸徑和根長，所有經4-CPANa溶液處理過的實驗組均與對照組間產生顯著性差異。綜合比較，方式二處理的大豆芽品質最好的是4-CPANa濃度為0.5 mg/L的實驗組(C2-0.5組)。

表4 4-CPANa不同方式處理的大豆芽感官評分結果Table 4 The results of sensory evaluation of bean sprouts with 4-CPANa in different ways

注：表4中小寫字母“a”“b”“c”表示相同指標不同組間的顯著性結果：同一字母表示差異性不顯著(p>0.05)，不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；每個參數測3次平均值，表5～表7相同。

A：產率；B：鮮重；C：軸徑；D：軸長；E：根比重；F：根長圖4 4-CPANa不同方式處理后大豆芽的基本指標變化Fig.4 The changes of basic indicators of bean sprouts with 4-CPANa in different ways注：圖4中圖形上的小寫字母“a”“ b”“ c”“ d”表示相同指標不同組間的顯著性結果：相同字母表示差異性不顯著，不同字母表示差異性顯著(p<0.05)。

按方式三處理的大豆芽，用濃度為5 mg/L的4-CPANa處理時，其大豆芽的產率、鮮重、軸長與對照組相比沒有出現顯著性降低，而其軸徑卻顯著增粗，根比重和根長也顯著降低。因此認為方式三處理時以4-CPANa濃度為5 mg/L(C3-5組)時大豆芽品質最好。

綜上可知，4-CPANa可以促進大豆芽增粗，同時對根部有一定抑制作用，濃度過高時會抑制大豆芽的生長，影響大豆芽的品質，這與楊婕等[26]的研究結果一致。但本文采用方式一處理的大豆芽，各實驗組軸長均低于對照組，這與楊婕等的研究結果有所不同，可能是試驗原料不同引起的差異。對3種培育方式下的代表實驗組進行感官上的比較，C1-0.5和C3-5組得分相對較高，但C3-5組的軸長更長，根比重和根長較低，而生產大豆芽時添加4-CPANa目的是提高大豆芽外觀品質，減少根長，因此認為方式三的C3-5組(5 mg/L)效果最好。

2.2.3 大豆芽中4-CPANa的殘留量變化

由表5～表7可知，在3種培育方式下，大豆芽中4-CPANa的殘留量都隨著培育時間的延長呈顯著性降低。方式一的C1-0.5組在24 h后、C1-1組在48 h后檢測不到殘留，可能是大豆芽在培育過程中，不斷噴淋自來水，導致殘留量降低，也可能是4-CPANa被大豆芽吸收，在體內發生了降解[30]。王一茜[25]分別用5、20、40 mg/L的 4-CPANa溶液浸泡綠豆，之后每天加入10mL去離子水培育7 d，結果顯示，在7 d的檢測期內，3組樣品中4-CPANa的殘留量呈現顯著的下降趨勢，且最終均有一定的殘留，該研究中4-CPANa在豆芽培育期的變化趨勢與本文一致，而最終殘留量的差異可能與原料、培育方式以及4-CPANa的添加濃度不同有關。方式二的C2-0.5組在24 h時檢測不到殘留，36 h時檢出0.051 mg/kg的殘留，48 h后又無殘留，C2-1組以及C3-5組也出現類似異?，F象。研究表明[25]，4-CPANa在豆芽培育初期降解速度快，隨培育時間延長，降解速度逐漸變緩。因此，在24 h檢測時，噴淋的4-CPANa溶液被大豆芽吸收后又發生了迅速降解，致使檢測不出殘留，而在36 h檢測時，4-CPANa降解速度減慢，噴淋的4-CPANa被吸收后還未及時降解，在大豆芽中產生累積，導致檢測出殘留。方式三在最終收獲時只有C3-10組剩余0.187 mg/kg的殘留，其余組均未有4-CPANa檢出。

上述3種培育方式下成熟大豆芽中4-CPANa的最大殘留量為方式二處理下的C2-10組，即0.638 mg/kg。若以此作為大豆芽中4-CPANa的最大殘留水平，設定個人平均每天的大豆芽攝入量為500 g，按照營養學上設定的標準人體重為60 kg為參考標準，那么4-CPANa的每日暴露水平為0.005 3 mg/(kg·bw)，這一數值比ADI值0.08 mg/(kg·bw)低了一個數量級，因此暫時無暴露風險。

表5 方式一處理的不同培育時間大豆芽中4-CPANa殘留量 單位：mg/kgTable 5 The content of 4-CPANa in different incubation periods of bean sprouts under the treatment of method one

表6 方式二處理的不同培育時間大豆芽中4-CPANa的殘留量 單位：mg/kgTable 6 The content of 4-CPANa in different incubation periods of bean sprouts under the treatment of method two

表7 方式三處理的不同培育時間大豆芽中4-CPANa含量 單位：mg/kgTable 7 The content of 4-CPANa in different incubation periods of bean sprouts under the treatment of method three

3 結論

大豆芽中4-CPANa檢測方法優化結果表明，以228 nm為檢測波長，乙酸化乙腈為提取劑， 300 W超聲20 min，濃縮后結合QuECHERS技術，用PSA凈化樣品，進行HPLC測定，4-CPANa回收率為84.67%～89.78%，最低檢出限為0.05 mg/kg。

4-CPANa對大豆芽品質的影響主要是促進軸徑增粗，抑制軸長及根部生長。3種方式培育大豆芽，品質最好的分別是方式一的C1-0.5、方式二的C2-0.5、方式三的C3-5組；整體比較后，以方式三中的C3-5組為最優組，即以自來水浸泡大豆后，每天早上噴淋一次5 mg/L的4-CPANa溶液。大豆芽中4-CPANa的安全風險性評價結果顯示，4-CPANa在人群中沒有暴露風險。

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Analysisofsodium4-chlorophenxyacetateonbeansproutsqualityandsafetyevaluation

LI Chang-feng1, WANG Sha-sha1, CHUI Xiao-li1, TAN Yue1,DING Yong-bo1, KAN Jian-quan1,2,3*

1(College of Food Science Southwest University, Chongqing 400715，China)2(Key Laboratory of Products Processing and Storage of Chongqing， Chongqing 400715，China)3(Department of Agriculture Storage Fresh-Keeping Quality and Safety Risk Assessment Laboratory， Chongqing 400715，China)

The aim of this study was to investigate the effect of sodium 4-chlorophenoxyacetate (4-CPANa) treatment on the growth of bean sprouts and its safety. The determination of 4-CPANa in bean sprouts was optimized and simulation experiment was designed. The first method was using 4-CPANa solution to soak in tap water during bean sprouts cultivation; the second method was using 4-CPANa solution to soak and cultivated by spraying tap water; the third method was 4-CPANa and water alternating spray. Then the sensory evaluation and basic growth indexes of mature bean sprouts and the residues of 4-CPANa in the sprouts were determined. The results showed that the spiked recoveries of 4-CPANa in bean sprouts were 84.67%-89.78%, the lowest detection limit was 0.05mg/kg. The first method with 0.5mg/L 4-CPANa and the third group with 5 mg/L all showed higher scores in color, appearance, taste, smell and texture. The total scores were 83.67 and 83.45 respectively. The first method showed better result in the yield, fresh weight, axis diameter, axis length, root weight and root length of bean sprouts. The residual amount of 4-CPANa in bean sprouts of the three treatment groups decreased with the increasing of incubation time. The conclusion is that the best quality of bean sprouts was the third method with 5 mg/L 4-CPANa: no residual of 4-CPANa was detected and no exposure risk for people.

bean sprouts; sodium 4-chorophenxyacetate; growth; safety evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013887

碩士研究生(闞建全教授為通訊作者,E-mail：ganjq1965@163.com)。

中華人民共和國農業部財政專項項目(GJFP201501201)

2017-01-19，改回日期：2017-04-14