產高分子量木聚糖酶細菌的篩選及產酶條件優化

王中月，滕超，湯回花，李秀婷

1(北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，北京，100048)2(北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京，100048)

產高分子量木聚糖酶細菌的篩選及產酶條件優化

王中月，滕超，湯回花，李秀婷*

1(北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，北京，100048)2(北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京，100048)

通過透明圈法從土壤中篩選出55株產木聚糖酶的細菌菌株，經產酶發酵培養基復篩及SDS-PAGE酶譜分析得到1株產高分子量木聚糖酶細菌菌株Paenibacillussp. 39631。在單因素實驗的基礎上，運用響應面分析，對影響產酶發酵的各因素進行優化，得到的最佳產酶發酵條件：碳源(80目玉米芯粉)0.8%，氮源(牛肉膏)1%，初始值pH7.2，培養溫度30 ℃，轉速158 r/min，接種量2%，裝液量50 mL。在最佳培養條件下，經72 h液態發酵，酶活力達到44.12 U/mL，比優化前提高了4.36倍。

高分子量木聚糖酶；細菌菌株；液態發酵；響應面優化

木聚糖酶是一類重要的糖苷鍵水解酶，能夠專一地將木聚糖降解為寡木聚糖、低聚木糖和木糖[1]，根據對木聚糖主鏈作用方式的不同，分為β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶[2]。作為一種重要的工業應用酶制劑，木聚糖酶在食品、飼料、造紙等方面具有重要的潛在應用價值[3]，如添加適量木聚糖酶到小麥面粉中，可以有效改善面團的質量，其烘烤質量得到顯著提升；在制作果汁和酒時木聚糖酶可起到澄清作用[4-5]；可以用來增加家畜對飼料的消化吸收率，提高青貯飼料的營養價值[6]。

微生物是木聚糖酶的重要來源，如真菌、放線菌和細菌[7]，由于木聚糖酶在不同工業應用上的差異，需要從自然環境中篩選具有不同特性的木聚糖酶。根據木聚糖酶分子量的差異特性，可分為兩大類，即小于30 kDa的堿性木聚糖酶和大于30 kDa的酸性木聚糖酶，通常細菌可產生這2種木聚糖酶。研究表明，分子量較大的木聚糖酶具有良好的酶學特性，如底物特異性廣泛，因其具有多個底物結合位點，能夠高效作用于小分子量的木寡糖；另外對低分子量纖維素底物，特別是對含有芳香族基團的低聚纖維多糖具有相當可觀的活性[8]。GUPTA[9]研究發現，Staphylococcussp.SG-13可有效地降解麥麩、甘蔗蔗渣、玉米芯、楊樹木材等多種農業廢棄物。朱輝[10]對Paenibacilluspolymyxa的研究表明，該菌株所產高分子量木聚糖酶具有分解木聚糖和葡聚糖的能力，這和ZHANG[11]的研究結果相一致。ANTHONY[12]從造紙廠廢水篩選出1株耐堿的AspergillusfumigatusAR1，該菌株可產生多個從212 kDa到253 kDa的高分子量木聚糖酶，可適應較寬廣的pH范圍，并具有較好的耐熱性。GHIO[13]等過研究發現，Paenibacillussp.A59所產木聚糖酶在50～70 ℃具有良好的穩定性，酶解產物以木二糖為主。THIAGARAJAN[14]研究了AspergillusfumigatusMKU1所產高分子量木聚糖酶酶學性質，發現其最適溫度為90 ℃。SAINZ-POLO[15]研究了分子量為120 kDa的木聚糖酶的分子機制。因此為滿足工業對具有不同特性木聚糖酶的多樣化需求，篩選不同特性的木聚糖酶極有必要。

本文通過透明圈法從土壤中篩選得到1株產高分子量木聚糖酶的細菌菌株，通過單因素試驗及響應面分析對其產酶條件進行優化，以提高其產酶能力。

1 材料與方法

1.1 土樣

土壤樣品采集于山東濟南千佛山山頂、北京國家森林公園、河南漯河花花牛原料間、貴州貴陽十里河灘濕地公園等地，距離地表5～15 cm處的植被土壤。

1.2 試驗材料

玉米芯購自北京郊區(新鮮、無蟲蛀、無霉變、干燥)，用粉碎機粉碎，過80目篩，置于干燥處貯存備用；木糖、櫸木木聚糖(Beechwood xylan)：美國Sigma公司；玉米芯水不溶性木聚糖：實驗室自制；其他試劑如無說明均為國產分析純。

1.3 試驗設備

超凈工作臺，AIRTECH公司；DYY-10C電泳儀，北京六一儀器廠；DYC P-31BN水平電泳槽，北京六一儀器廠；高速離心機，美國Sigma公司；Image Quant 300凝膠成像儀，美國GE公司；STIK生化培養箱，施都凱儀器設備(上海)有限公司；恒溫搖床，美國精琪公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養基及主要試劑配制

平板初篩培養基(%)：玉米芯木聚糖1.00、NH4NO30.50、MgSO40.05、NaCl 0.50、K2HPO40.20、(NH4)2SO40.10、酵母粉0.03、瓊脂2.00、pH 8.0，121 ℃下滅菌20 min。

斜面保藏培養基(%)：胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl 0.50、瓊脂1.50，pH7.4，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養基(%)：胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl 0.50，pH7.4，121 ℃下滅菌20 min。

初始液體發酵培養基(%)：玉米芯2.00、酵母膏2.00、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50，pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min。

10 μmol/mL的木糖母液：精確稱取0.150 g木糖(Sigma)，用一定pH的緩沖液溶解并定容至100 mL，即得到10 μmol/mL的木糖母液，置于4℃冰箱中保存備用。

1%木聚糖底物溶液的配制：精確稱取2.0 g櫸木木聚糖，用高純水配制2%的木聚糖底物100 mL，需要時用一定pH值的緩沖液接1∶1混合成1%木聚糖底物溶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 菌株的初篩

制備菌液，即稱取土樣0.1 g，用900 μL無菌水稀釋成10-1，混勻，吸取100 μL混合液，用900 μL無菌水稀釋成10-2混勻后依次稀釋成10-3、10-4混合液，均勻涂布于平板篩選培養基上，置于37 ℃培養箱中培養2～3 d，觀察菌株生長狀態，挑取周邊能夠產生透明圈的菌株劃線分離進行純化培養，斜面保存。

1.4.3 菌株的復篩

挑取入選的斜面菌種接入種子培養基，37 ℃、180 r/min培養14 h，將培養好的種子培養液按一定比例接入基礎產酶培養基，裝液量為250 mL三角瓶裝液50 mL，180 r/min，37 ℃振蕩培養72 h，培養物經4 000 r/min離心10 min取上清，即為粗酶液。

1.4.4 標準曲線制作

將配置好的木糖母液分別稀釋成濃度為0.0、2.0、3.3、5.0、10.0 μmol/mL的標準糖液組，在10 mL試管中用移液槍精確加入0.1 mL標準糖液、0.9 mL木聚糖底物和1 mL DNS試劑(用前加入無水亞硫酸鈉，每100 mL加0.05 g)，在沸水中煮沸15 min，煮沸完畢加入1 mL 40%酒石酸鉀鈉護色，涼水冷卻，充分搖勻后，在540 nm下測吸光值A。以木糖含量為縱坐標，A為橫坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程。

1.4.5 木聚糖酶酶活力的測定方法

木聚糖酶活力的測定參照DNS法[16]：0.1 mL適當稀釋的酶液，加入到0.9 mL用0.05 mol/L、pH5.5乙酸緩沖液配制的10 g/L櫸木木聚糖底物溶液中，55 ℃反應5 min，加入1 mL DNS試劑終止反應，后續處理參照1.4.4。利用木糖標準曲線測生成還原糖(以木糖計)的量。木聚糖酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量(U)。

1.4.6 SDS-PAGE酶譜分析[17]

對粗酶液進行酶譜分析：在12.5%的聚丙烯酰胺凝膠中加入0.5%的櫸木木聚糖制備底物膠，在冰浴中進行常規蛋白電泳(濃縮膠80 V恒壓，分離膠100 V恒壓)。電泳結束后，先用25%異丙醇洗滌凝膠4次使酶蛋白復性，每次15 min；然后用0.05 mol/L、pH7.0 Tris-HCl緩沖液洗滌凝膠4次，每次18 min，洗滌完畢在55 ℃條件下保溫1 h；凝膠用0.5%的剛果紅染液染色15 min，最后用1 mol/L NaCl溶液脫色直至出現透明條帶，用0.5%的醋酸溶液進行護色。

1.4.7 產木聚糖酶發酵條件優化

(1)營養條件對產木聚糖酶活性的影響

在初始液態發酵培養基的基礎上，分別改變碳源和氮源的種類，初始含量均為20 g/L，搖瓶培養72 h，測定酶活，確定最佳碳源和氮源，然后改變碳源和氮源的濃度，進行碳源、氮源濃度的產酶發酵優化，所有試驗重復3次。

(2)培養條件對木聚糖酶活性的影響

確定最佳碳源和氮源后，考察初始pH值、發酵溫度、轉速、接種量、裝液量5個因素對產酶發酵的影響，分別測定各單因素條件下的酶活性，確定各因素適宜的范圍，所有試驗重復3次。

(3)Box-Behenken響應面分析法試驗設計

在單因素試驗基礎上，運用DPS軟件設計響應面實驗。根據Box-Behenken試驗設計原理，以木聚糖酶酶活為響應值，選取對發酵影響最為顯著的pH值、轉速、碳源濃度3個因素，設計因素3水平響應面分析實驗，并對數據進行回歸分析及顯著性檢驗，以確定產酶發酵的最佳組合，每個試驗點重復3次，取試驗結果的平均值，其中各自變量的因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factorsand levels of response surface experiment

2 結果與分析

2.1 產木聚糖酶細菌的篩選

土壤是重要的微生物獲取途徑，存在豐富多樣的微生物，通過透明圈法從土壤中進行產木聚糖酶細菌的平板篩選，共獲得目的菌株55株，通過產酶發酵得到粗酶液，測定酶活，產酶情況見表2。

表2 土樣中木聚糖酶產生菌的分離情況Table 2 Screening of xylanase produced strains

粗酶液經SDS-PAGE電泳酶譜分析，得到細菌菌株產木聚糖酶分子量情況，經酶譜分析，菌株 39631所產木聚糖酶可以產生4條木聚糖酶透明條帶，如圖1所示，且分子量均在60 kDa以上，這在目前文獻的報道中是比較少見的，具有良好的理論研究價值，作為目標菌株進行后續研究。經鑒定 39631為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp. 39631，可在初篩平板上產生明顯透明圈，如圖2所示。

M-高分子量標準蛋白；1-粗酶液圖1 Paenibacillus sp. 39631SDS-PAGE酶譜分析Fig.1 SDS-PAGE andzymogram of xylanase samples

圖2 Paenibacillus sp. 39631的透明圈Fig.2 Transparent zone of Paenibacillus sp. 39631(注：培養基為初篩平板；培養時間48 h)

2.2 單因素實驗設計與分析

2.2.1 碳源對Paenibacillussp. 39631產酶的影響

木聚糖酶屬于誘導性酶，不同碳源對發酵產酶均有影響。實驗選取玉米芯、玉米秸稈、麩皮、玉米芯木聚糖、玉米秸稈木聚糖、麩皮木聚糖為碳源底物進行產酶發酵，結果如圖3所示?？梢钥闯鲈诎l酵培養基中以玉米秸稈木聚糖、麩皮木聚糖為碳源時酶活相對較低，在5 U/mL左右；以玉米芯、玉米芯木聚糖為底物時，酶活分別為10.96 U/mL、11.84 U/mL，酶活相對較高且相差不大?？紤]到成本問題，選擇玉米芯為發酵培養基的基礎碳源。

a-玉米芯；b-麩皮玉米；c-秸稈；d-玉米芯木聚糖；e-玉米秸稈木聚糖；f-麩皮木聚糖圖3 碳源種類對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.3 The effect of different carbon source on Paenibacillus sp. 39631 xylanase production

在確定最適碳源后，考察碳源質量濃度對木聚糖酶酶活的影響，實驗選取 10、20、30、40、50 g/L 5個梯度進行試驗，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著玉米芯粉添加量的增加，木聚糖酶酶活呈逐漸下降的趨勢，可知在單因素改變的條件下，10 g/L的玉米芯粉添加量為最適質量濃度。

圖4 玉米芯質量濃度對菌株Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.4 Effect of corncob concentration on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.2 氮源對Paenibacillussp. 39631產酶的影響

在產酶基礎培養基中，以10%的70目玉米芯粉為培養基的碳源，添加20 g/L的不同氮源進行產酶發酵，實驗結果如圖5所示。

a-安琪酵母浸粉；b-酵母膏；c-胰蛋白胨；d-大豆蛋白胨；e-牛肉膏；f-硝酸銨；g-硝酸鈉；h-磷酸氫二氨；i-尿素圖5 不同氮源對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖5可知，牛肉膏作為氮源時，酶活最高達到12.43 U/mL，酵母膏、大豆蛋白胨次之，總體來說有機氮源優于無機氮源，因為有機氮成分復雜，能夠為微生物的生長提供更加豐富的營養物質[18]，最終選取牛肉膏作為后續產酶發酵的基礎氮源。

在確定最適氮源后，考察氮源質量濃度對木聚糖酶活的影響，實驗選取5、10、15、20、25、30、35、40 g/L 八個梯度進行試驗，結果如圖6所示。隨著氮源質量濃度的增加，木聚糖酶活呈先上升后逐漸下降的趨勢，在10 g/L時酶活最高達到16.68 U/mL，由此可知在單因素改變的條件下，10 g/L的氮源添加量為最適質量濃度。

圖6 氮源質量濃度對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources concentration on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.3 初始pH對菌株Paenibacillussp. 39631產酶的影響

在最優培養基的基礎上，分別設置4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0共7個pH梯度考察其對液體發酵產酶的影響。在恒溫震蕩箱中培養72h后，取發酵液進行酶活測定，共測3組，取平均值，結果見圖7。

圖7 發酵液初始pH值對Paenibacillus sp. 39631產酶的影響Fig.7 Effect of fermentation liquor pH value on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖7可知，在pH4.0～10.0的范圍內木聚糖酶活性呈先增大后下降的趨勢，在pH7.0的中性條件下酶活力最高，達到19.11 U/mL，而在酸性或堿性較強的條件下酶活較低，這主要是因為發酵液的初始pH影響菌株對營養物質的利用效率，通過改變細胞膜的通透性達到影響代謝產物的形成和分泌[19]，而較強的酸性或堿性pH條件下菌體的生長狀況不好，進而導致產酶降低。故選擇pH7.0為最佳初始pH。

2.2.4 發酵溫度對菌株Paenibacillussp. 39631產酶的影響

在以上最優培養基的基礎上，分別設置20、25、30、35、40、45 ℃共6個溫度梯度考察其對液體發酵產木聚糖酶活性的影響，結果見圖8。

圖8 發酵溫度對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.8 Effect of temperature on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖8可知，產酶發酵培養最適反應溫度范圍為25～30 ℃，其中30 ℃最有利于該菌株產酶發酵，此時產酶能力最強，而溫度過低或過高的條件均不利于產酶發酵。這是因為過低的溫度造成菌體生長緩慢，從而影響菌體產酶的速度；溫度過高，菌體雖然生長旺盛，但是培養基中的營養物質被過多的用于菌體自身生長繁殖，產酶速率則會相對降低[20]。因此，對菌株Paenibacillussp. 39631而言，最適宜的發酵溫度為30 ℃。

2.2.5 接種量對Paenibacillussp. 39631產酶的影響

由圖9可知，在接種量為2%時，Paenibacillussp. 39631產木聚糖酶活力最高，接種量大于2%后，酶活開始降低。接種量較大時，酶活降低的原因可能是菌體生長過快導致發酵液的黏度增加，在供氧量不變的情況下，會造成溶氧不足而影響到木聚糖酶的生成[21]，所以選擇2%為最適接種量。

圖9 接種量對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.9 Effect of inoculum dosage on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.6 轉速對Paenibacillussp. 39631產酶的影響

由圖10可知，搖床轉速對菌株Paenibacillussp. 39631的產酶活力影響比較明顯。當搖床轉速為90 r/min時，產酶活力最低，僅有9.0 U/mL，在搖床轉速為150 r/min時具有最高酶活24.66 U/mL。故將產酶發酵最佳轉速設定為150 r/min。

圖10 搖床轉速對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.10 Effect of rotating speed on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.7 裝液量對Paenibacillussp. 39631產酶的影響

在以上條件優化的基礎上，考察裝液量對發酵產酶的影響，發酵液中溶氧量與氧氣的傳遞效率和搖瓶裝液量直接相關，進而影響發酵液中菌體對營養物質的利用速率，從而影響木聚糖酶的生產效率[22]。Paenibacillussp. 39631為需氧微生物，所以裝液量的大小直接影響著它的生長和木聚糖酶的產生，由圖11可知，在250 mL錐形瓶中加入20～80 mL的液體發酵培養基，木聚糖酶活力呈現先增大后減小的趨勢，在裝液量為50 mL時產木聚糖酶活力為最高，達到36.12 U/mL。故選取50 mL為最適裝液量。

圖11 裝液量對Paenibacillus sp. 39631液態發酵產酶的影響Fig.11 Effect of liquid volume on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.3 響應面實驗設計與結果分析

利用統計軟件DPS進行實驗設計，根據表3的實驗結果進行響應面回歸分析，以木聚糖酶活力(Y)為響應值進行回歸擬合得到響應值(Y)對pH值(A)、轉速(B)、碳源濃度(C)的二次多項回歸方程：

Y=-788.43+169.16A+2.17B+8.82C-12.69A2-0.01B2-0.29C2+0.11AB-0.46AC-0.01BC

對回歸模型進行顯著性檢驗和方差分析結果如表4和表5所示。結果顯示，實驗所用模型經Fr檢驗：p=0.000 9<0.01，擬合回歸方程有意義，達到極顯著水平；并且該模型的擬合度指數R2=0.980 7，失擬項p=0.145 8>0.05，失擬項不顯著，這說明實驗數據純誤差較小，實驗精度較高，能夠較好地描述本次試驗的結果。

根據方差分析結果繪制各因素間響應面立體分析圖，它們反映了pH值(A)、轉速(B)、碳源質量濃度(C)這3個因素之間對響應值(Y)的影響。由圖12～14可知，pH和轉速的交互作用最為顯著，pH和轉速之間，當轉速一定時，木聚糖酶的酶活隨著pH的增大呈現先增加后減小的趨勢。

由統計軟件分析可知，Y預測最大值為44.601 8 U/mL，pH值7.219 7、轉速158.806 5 r/min，碳源質量濃度8.104 1 g/L。此時響應值值經實驗驗證，發酵得到的實際酶活為44.12 U/mL，實驗值與預測值基本相符，說明預測模型可應用于該木聚糖酶發酵條件的優化。

表3 Box-Behenken實驗設計及其結果Table 3 Design and result of Box-Behnken experiment

表4 模擬回歸系數顯著性檢驗和結果Table 4 Test and result of significance for simulated regression coefficient

表5 模型方程的方差分析結果Table 5 Variance analysis result of model eqution

圖12 pH值和轉速對木聚糖酶酶活的響應面分析圖Fig.12 Response surface showing the effects of pH and speed on xylanase production

圖13 碳源質量濃度和轉速對木聚糖酶酶活交互作用的的響應面分析圖Fig.13 Response surface showing the effects of carbon concentration and speed on xylanase production

圖14 pH值和碳源質量濃度對木聚糖酶酶活的響應面分析圖Fig.14 Response surface showing the effects of carbon concentration and pH on xylanase production

3 結論

通過透明圈法從土壤中篩選出了1株產高分子量木聚糖酶的細菌菌株，并對該菌株的木聚糖酶產酶條件進行了單因素實驗優化和響應面分析，得到該菌株木聚糖酶發酵最佳產酶條件：碳源(80目玉米芯粉)0.8%，氮源(牛肉膏)1%，初始pH值7.2，培養溫度30 ℃，轉速158 r/min，接種量2%，裝液量50 mL。該菌株所產木聚糖酶活力雖不是處于較高水平，但其所產的木聚糖酶分子量較高，具有很好的研究價值，且以玉米芯為最佳碳源，培養基原料成本低，為該酶的理論研究和工業應用奠定了理論基礎。

[1] 吳萍,李正鵬,何慶元,等.金針菇固態發酵產木聚糖酶的純化及其性質研究[J].藥物生物技術,2012(1):31-34.

[2] 葉波,周婭琴.木聚糖酶綜述[J].輕工科技,2012(7):14-16.

[3] 付冠華,李端,周晨妍,等.木聚糖酶的研究進展及其應用[J].安徽農業科學,2011,39(35):21566-21568.

[4] CUI Feng-jie,ZHAO Li-ming.Optimization of Xylanase Production fromPenicilliumsp.WX-Z1 by a Two-Step Statistical Strategy:Plackett-Burmanand Box-Behnken Experimental Design[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(8):10630.

[5] COURTIN C,DELCOUR J.Arabinoxylans and Endoxylanases in Wheat Flour Bread-making[J].Journal of Cereal Science,2002,35(3):225-243.

[6] TCHAOUN C,POOSARAN N,WATANABE M,et al.Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanasesproduced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioprocesses: a review[J].Process Biochemistry,2003, 38(9):1 327-1 340.

[7] 馬煥,權淑靜,劉德海,等.產木聚糖酶菌株的篩選、鑒定及其酶學性質研究[J].中國釀造,2016,35(12):123-128.

[8] 王國增.不同環境中木聚糖酶基因多樣性分析及宏基因組來源的新基因克隆與表達[D].北京:中國農業科學院,2011.

[9] GUPTA S,KUHAD R,BHUSHAN B,et al.Improved xylanase production from a haloalkalophilicStaphylococcussp. SG-13 using inexpensive agricultural residues[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2001,17(1):5-8.

[10] 朱輝,丁延芹,田方,等.多粘類芽孢桿菌SC2 xynD和gluB的克隆及序列分析[J].生物技術通報,2008,(4):171-174.

[11] ZHANG Qing-hua,LI Hang-guang,ZHU Xina-dong,et al.Exploration of the key functional proteins from an efficient cellulolytic microbial consortium using dilution-to-extinction approach[J].Journal of Environmental Sciences,2015,43(5):199-207.

[12] ANTHONY T, RAJ K.High molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerantAspergillusfumigatusAR1[J].Enzyme & Microbial Technology,2003,32(6):647-654.

[13] GHIO S,INSANI E,PINNINNY F,et al.GH10 XynA is the main xylanase identified in the crude enzymatic extract ofPaenibacillussp. A59 when grown on xylan or lignocellulosic biomass[J].Microbiological Research,2016,186:16-26.

[14] THIAGARAJAN S,JEYA M,GUNASEKARAN P.Purification and characterization of a high molecular weight endoxylanase from the solid-state culture of an alkali-tolerantAspergillusfumigatusMKU1[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,22(5):487-492.

[15] SAINZ M,GONZALEZ B,MENENDEZ M,et al.Exploring multimodularity in plant cell wall deconstruction: structural and functional analysis of xyn10C containing the CBM22-1-CBM22-2 tandem[J].Journal of Biological Chemistry,2015,290(28):17 116.

[16] 沈誠,李戎,胡婷莉,等.木聚糖酶活力的二硝基水楊酸(DNS)測定法[J].印染,2011,37(2):35-39.

[17] HUA Yun,HONG Tian.Novel cold-adaptivePenicilliumstrain FS010 secreting thermo-labile xylanase isolated from Yellow Sea[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2006,38(2):142-149.

[18] 劉程程,劉波,藍江林,等.產木聚糖酶芽胞桿菌的篩選及產酶條件優化[J].福建農業學報,2014,29(8):757-767.

[19] UEDA M,KOO H.Cellulase treatment of cotton fabrics. II. Inhibitory effect of surfactants on cellulase catalytic reaction.[J].Textile Research Journal,1994,64(64):615-618.

[20] 李雪龍.細菌性木聚糖酶高產菌株的篩選及其酶學性質研究[D].哈爾濱:東北林業大學,2008.

[21] 李群良,韓玉璐,張欣英,等.產木聚糖酶菌株的篩選及產酶條件優化[J].可再生能源,2011,29(2):89-91.

[22] 馬建盧.降解木糖渣真菌的篩選及其發酵條件和酶學性質的研究[D].鄭州:鄭州大學,2012.

Screeningofhighmolecularweightxylanase-producingbacteriaandoptimizationoffermentationconditions

WANG Zhong-yue,TENG Chao, TANG Hui-hua, LI Xiu-ting*

1(Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 100048, China)2(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing 100048, China)

55 Xylanase-producing bacteria from the different sources of soil samples through the transparent circle method a high molecular weight xylanase-producing bacteriaby liquid fermentation and SDS-PAGE zymogramanalysis.Through single factor experiment and response surface analysis,the factors affecting the enzyme production fermentation optimizedthe best enzyme production fermentation conditions : carbon source (corn cob powder)0.8%, nitrogen source (beef paste) 1%, initial pH value of 7.2, culture temperature 30 ℃, rotational speed of 158 r/min, of 2%, the fluid volume 50 mL. Under the optimized condition, the enzyme activity reached 44.12 U/mL after fermentation,which 4.36 times higher than before optimization.

high molecular weight xylanase; bacterial strains; liquid fermentation; the response surface optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014537

碩士研究生(李秀婷教授為通訊作者,E-mail：lixt@th.btbu.edu.cn)。

國家自然科學基金(31671793;1201449)

2017-04-15, 改回日期：2017-06-12