纖維二糖水解酶的研究進展

袁茂翼，葉發銀，雷琳，趙國華,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心, 重慶, 400175)

纖維二糖水解酶的研究進展

袁茂翼1，葉發銀1，雷琳1，趙國華1,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心, 重慶, 400175)

纖維素是世界上最豐富的可再生資源，將其降解為小分子糖并轉化為燃料或精細化學品一直是研究的難點和熱點。纖維二糖水解酶是生物降解纖維素的關鍵酶之一，它屬于外切酶，作用于結晶纖維素的鏈末端依次切開相隔的β-1,4-糖苷鍵，釋放纖維二糖。論文對纖維二糖水解酶的來源、分類、結構，對纖維素的作用機理、酶學性質、分子進化、商業酶制劑生產情況及其應用特性進行了總結，同時對該研究進行了展望。

纖維二糖水解酶；酶學性質；結構；催化機理；應用

纖維素酶是能將纖維素水解的酶的統稱，是一類復雜的多酶體系，主要包括內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91和EC 3.2.1.176)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，它們協同作用于纖維素使其徹底降解為葡萄糖。其中，內切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結晶區，將纖維素長鏈降解為小分子纖維素或寡糖鏈；外切葡聚糖酶又稱作纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)，與內切葡聚糖酶協同作用并負責降解纖維素的結晶區，將纖維素鏈剝離并水解β-1,4-糖苷鍵釋放纖維二糖[1]。β-葡萄糖苷酶不直接作用于纖維素，主要是將內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶作用產生的寡糖鏈和纖維二糖水解為葡萄糖。鑒于CBH在食品物料改性以及生物質能源生產上巨大的應用潛能，本文在主要查閱國內外近10年文獻的基礎上，對CBH生物來源、理化特征及潛在應用進行了綜述，并對CBH研究中存在的問題和今后的研究方向進行了探討，以期推動CBH的深入研究及產業化應用。

1 纖維二糖水解酶的分類及來源

目前，對CBH的命名法主要包括EC法、CAZy法和mycoCLAP法等。在酶的國際系統分類編號(EC)中，纖維二糖水解酶占兩個編號：EC3.2.1.91(GH5、GH 6、GH 9)和EC 3.2.1.176(GH7、GH 9、GH 48)，其中CBHⅠ(EC 3.2.1.176)作用于纖維素鏈的還原端，CBHⅡ(EC 3.2.1.91)作用于纖維素鏈的非還原端[2-3]。真菌是纖維二糖水解酶的主要來源，主要是木霉、青霉和曲霉，且菌株多為野生型；另外也有產生CBH的細菌，但其產量比較低，因此相關研究不多(表1)。

表1 纖維二糖水解酶的來源Table 1 The source of cellobiohydrolasees

CAZy數據庫(http://www.cazy.org/)是專門針對碳水化合物活性酶的基因組、結構和生物化學信息的開放獲取網絡。CAZy數據庫根據酶催化結構域氨基酸序列的相似性[4-5]，將已報道的糖苷水解酶劃歸為144個家族，其中真菌CBH歸屬到GH6和GH7兩個糖苷水解酶家族，對于細菌來源的CBH屬于GH48、GH9、GH6、GH5。此外，mycoCLAP數據庫(http://mycoclap.fungalgenomics.ca)提供木質纖維素相關酶和活性蛋白質的信息，該數據庫提供的命名法能直接反映出酶的功能、所屬糖苷水解酶家族以及來源微生物的種屬信息。如名稱為CBH6A_COPCI的酶指來自Coprinopsiscinerea，屬于GH6家族的纖維二糖水解酶。

2 纖維二糖水解酶的結構

里氏木霉(Trichodermareesei)CBH是真菌CBH的典型代表，對其結構的研究也最為完善。研究CBH結構發現包含了具有降解活性的催化結構域(catalytic domain，CD)和吸附纖維素的纖維素結合結構域(cellulose binding domain，CBD)，這兩個結構域由一段O-糖肽鏈的連接橋(linker)相連接。里氏木霉CBH的CBD為“楔型”結構，一面親水，另一面疏水，且親水面上的3個酪氨酸殘基組成纖維素的吸附位點[6]。這些結構域位于肽鏈的羧基端(C-端)或氨基端(N-端)。在此基礎上也有人研究其他菌，比如來自NeocallimastixpatriciarumJ11的CBH的CBD位于N-端，包含Asn、Ala、Gly和Gla等殘基，而CD位于C-端，其連接橋包含Asn(28.8%)、Ala(13%)、Gly(13.7%)和Gla(10.1%)[7]。CBH的糖基化包括CD的N-糖基化和連接橋的O-糖基化，前者發生在天冬酰胺殘基上，后者發生在絲氨酸和蘇氨酸殘基上[8]。有報道認為高度糖基化會降低重組里氏木霉CBHⅠ對結晶纖維素的水解活性[9]。

2.1 催化結構域(CD)

里氏木霉CBHⅠ的CD的結構在1994年被解析，為反平行β-折疊形成的三明治主體結構，包含有4個短α-螺旋和β-束形成的線圈結構，并有10個二硫鍵[10]，CBHⅠ通道至少有10個結合位點(-7到+3)[11]，4個色氨酸殘基(Trp)促進纖維素糖單元的疏水堆積相互作用，這4個Trp分別是進口處的Trp-40，中心處的Trp-38，圍繞催化位點的Trp-367和Trp-376[12]。催化活性位點的3個氨基酸在催化機制中起著關鍵作用，Glu-217是催化酸和催化基礎，Glu-212是形成酶-糖基中間產物的親核試劑，Asp-214通過側鏈氫鍵與親核試劑形成穩態相互作用[11]。研究Phanerochaetechrysosporium的Cel7A發現，N端氨基酸谷氨酰胺循環產生焦谷氨酸殘基，有Asn188和Asn286兩個潛在的糖基化位點。Asn 286結合N-乙酰氨基葡萄糖[4]。

2.2 纖維素結合結構域(CBD)

目前已確定約有130個不同的CBD的結構。根據其氨基酸序列的相似性劃分為13個不同的CBD家族。同一家族中的CBD的結構相似，而不同家族的CBD結構具有拓撲性。真菌CBH的CBD大約由35個氨基酸殘基構成[13]。脫離了母體CBH的CBD沒有催化活性，不能水解纖維素。王祿山等[14]提出CBD在CBHⅠ降解纖維素過程中擔負兩個角色：1)通過其吸附于纖維素表面而增加底物與酶的接觸；2)裂解纖維素晶體表面的纖維素分子間的氫鍵。敲除CBD編碼序列后獲得的CBH對不溶性纖維素的水解活性明顯下降，而對可溶性纖維素的降解作用沒有明顯影響。Cel1和CelD是來自Aspergillusniveus的屬于GH7家族的兩種CBH，它們有相似的CD，但前者有CBD后者沒有，發現Cel1對結晶纖維素降解活性明顯大于CelD[15]。

2.3 連接橋

連接橋是一段高度糖基化的多肽，它的長短控制著CBH的CBD和CD間的距離，并對酶的構象和活性有顯著影響。連接橋的有效長度及柔性是CBH發揮催化活性所必需的。絲狀真菌CBH的連接橋一般包含30～40個氨基酸殘基，而細菌CBH則由約100個氨基酸殘基組成[6]。

3 纖維二糖水解酶的作用機理

CBH對游離纖維素鏈的水解機理首先是纖維素鏈結合到CBD上，并推動其進入CD的催化通道，CD沿著纖維素鏈滑動，進而從還原端或非還原端以纖維二糖為切割單元被降解(圖1)。CBD與酶底物結合包括氫鍵結合和疏水作用[16]。但截至目前，CBH對結晶纖維素的降解機理仍然不清楚，其過程推測如下[14-15]: 1)CBH通過其CBD的介導吸附到結晶纖維素表面(錨定)[4]；2)錨定的CBH鏈在結晶纖維素表面擴散移動的過程中，CD可識別到裸露于結晶纖維素表面的纖維素鏈末端(還原端或非還原端)并與之結合，使糖苷鍵水解并釋放纖維二糖。

圖1 纖維二糖水解酶的作用機理[46]Fig.1 The action mechanism of cellobiohydroalses[46]

4 纖維二糖水解酶的酶學特性

表2給出了常見CBH的來源菌、分類及酶學特性。由表2可知，不同CBH的最適pH范圍為3.0～9.0，大多數位于4.5～6.0的范圍內；最適催化溫度為35～70 ℃，分子質量約40～70 kDa，CBH的活性主要受pH、溫度、金屬離子、產物反饋抑制以及其他成分的影響。COLUSSI等[17]對來自Trichodermaharzianum的CBH(ThCel7A)研究發現，在pH3～5范圍內，酶活性隨著pH值增大而提升；在pH5～7范圍內，酶活性隨著pH值增大而降低。pH=5時，在20～50 ℃范圍內酶活性隨溫度上升而增加；當溫度超過50 ℃，酶分子發生變性其活性顯著降低。WANG等[7]發現，Hg2+和Ag+對來自NeocallimastixpatriciarumJ11的CBH有強烈抑制作用，該菌的酶在大腸桿菌表達后，加入10 mmol Hg2+可使酶完全失活，而10 mmol的Ag+使酶僅保留9%的活性。而對來自產紫青霉(Penicilliumpurperogenum)HBZ003的CBH，Fe2+與Mn2+表現出較強的激活作用，Ca2+、Co2+、Cu2+有弱的激活作用，而Mg2+、Zn2+及Al3+則呈現抑制作用[18]。

表2 常見纖維二糖水解酶的來源菌、分類及酶學特性Table 2 The origin, classification and enzymatic properties of common cellobiohydroalses

酶解產物纖維二糖對CBH有反饋抑制作用，尤其對CBHⅠ的影響更明顯[8,19-20]。KARI等[21]發現，β-型纖維二糖比α-型的抑制作用更強，抑制常數可達12.5 μmol/L。BARAMEE等[22]發現，低于100 mmol/L的纖維二糖對來自Cellulomonasfimi的CBH無抑制作用，而在255 mmol/L時其抑制作用可達50%。向反應液中添加β-葡萄糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶[23]、纖維二糖脫氫酶[24]可有效消除反饋抑制。半胱氨酸可通過與CBH酶蛋白分子發生巰基-二硫鍵交換反應而引起酶失活[25]?？扇苄阅揪厶悄芘cCBH的CBD結合，從而競爭性地影響酶與纖維素鏈的結合而降低催化效率[26]。多酚類物質以及漆酶氧化形成的酚低聚物對CBH也有明顯的抑制作用[27]。

5 纖維二糖水解酶的分子進化

來自于天然真菌的CBH雖然種類多，但往往其酶產量不高，適宜pH范圍窄，易發生熱變性以及底物反饋抑制明顯，這些缺陷嚴重限制了CBH的工業化應用。人們試圖通過構建基因工程菌株來克服這些缺點。表3給出目前CBH基因工程菌株構建情況及對酶特性的改善情況。

表3 CBH基因工程菌株構建宿主及酶特性改善情況Table 3 Construction of CBH gene engineering strains and improvement of enzyme characteristics

由表3可以看出，目前構建CBH基因工程菌株選擇的表達宿主主要有大腸桿菌、酵母(畢赤酵母、釀酒酵母、解脂耶氏酵母等)、絲狀真菌(木霉、曲霉和青霉等)[8]。通過基因工程可有效提升CBH酶的熱穩定性，拓寬其適宜工作pH范圍，降低產物的反饋抑制作用以及提升酶的產量。但總的來看，對酶熱穩定性的改善效果較好，但在提升酶產量等方面效果還不十分理想。

6 商業纖維二糖水解酶酶制劑的生產情況

目前用于商業纖維二糖水解酶酶制劑生產的菌株主要是里氏木霉(Trichodermareesei)和長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)。生產商業里氏木霉CBH的公司主要有Sigma-Aldrich、嘉漢生物科技有限公司和杰能科國際股份有限公司。如Sigma-Aldrich公司生產的Celluclast 1.5L以Avicel和pNPC為底物的比酶活分別為0.343 U/mg[28]和0.06 U/mg[29]。而愛爾蘭Megazyme、安必奇(Creative Enzymes)和BIOHJ慧嘉生物等都利用長枝木霉生產。如Megazyme的CBHI為無色粉末狀，易溶于水，最適pH為6.0，以底物CMC為底物的比酶活為0.1U/mg[30]。除此之外，也有用其他微生物生產商業CBH的案例，如嘉漢生物科技有限公司利用PenicilliumoxalicumJU-A10生產的酶以pNPC為底物的比酶活為0.21 U/mg[29]。研究還發現，來自真菌(釀酒酵母、畢赤酵母和解脂耶氏酵母)的CBH為高糖基化CBH，對可溶性底物或非結晶纖維素活性低[31]，但來自釀酒酵母的CBH很適合工業酒精的生產[32]。李亞玲等[33]研究發現，來自嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)CBH的比酶活為1.45 U/mg，回收率為5.25%，半衰期為1h(70 ℃)。目前商業化CBH產品生產存在的主要問題是酶活性、酶熱穩定性、pH耐受范圍均不理想。OLIVEIRA等[34]發現來自Humicolagriseavar.thermoidea的rCBHI.2有較高的最適溫度(60 ℃)、較寬的pH耐受范圍(pH4.0～9.0，最適pH為8.0)和良好的熱穩定性(70 ℃-240 min可保留88%活性)。

7 纖維二糖水解酶的應用

7.1 在食品工業中的應用

在食品工業中，CBH主要可作為加工助劑提升加工效率或改善產品的品質。利用來自太瑞斯梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)的CBH與商業酶CellicCTec2共同對棕櫚果進行前處理，可大幅度提升其出油率，其出油率與單獨商業酶CellicCTec2作用相比提升了39%[35]。VAILLANT等[36]在百香果汁中加入果膠酶(85 U/L)、CBH(100 U/L)和內切葡聚糖酶(700 U/L)，在30 ℃保溫處理1 h可使其中的果泥完全液化。向蘋果勻漿中添來自黑曲霉(Aspergillusniger)的CBH(29 U/mL)和果膠酶(50 U/mL)，在40 ℃處理24 h后獲得的蘋果混濁汁的穩定性顯著改善[5]。在加工脆皮面包和餅干時，向面團中添加羧甲基纖維素酶(9 300 U/g)、CBH(3 800 U/g)和木聚糖酶(2 500 U/g)，可降低面包的吸水率并提升其加工性能[5]。在面包生產中使用CBH酶制劑可減少乳化劑的用量[37]。

7.2 在生物工程中的應用

目前CBH的應用基本停留在實驗室研究階段，規?；I應用尚未實現，核心原因是尚不能提供價廉物美的商業化酶制劑或高產菌株。但就目前的研究情況來看，CBH未來在生物工程領域的潛在應用主要包括纖維二糖的生產、生物燃料的生產、纖維性物料的改性等。纖維二糖是CBH作用于纖維素的主要產物，它是重要的化工原料，可作為生產山梨醇[38]、丙酮[39]、丁醇[40]、丁二醇[41]和乳酸[41-42]的原料。以嗜熱芽孢桿菌屬(ThermophilicBacilluscoagulans)WCP10-4為例，利用纖維二糖作為唯一的碳源，不用額外加入β-葡萄糖苷酶就可有效地轉化纖維二糖為L-乳酸，200 g/L的纖維二糖轉化為 196.3 g/L 的L-乳酸，產率達到 97.8%[41]。由于能源的短缺，生物燃料的生產備受關注。為不與人爭糧，生物燃料生產的最佳原料應為自然界豐富的纖維素，目前常用富含木質纖維素的農業廢棄物(秸稈等)和固體垃圾(餐飲垃圾等)為原料生產[43]。其關鍵是將原料中的木質纖維素轉化為可發酵的糖，進而通過生物轉化形成諸如乙醇的生物燃料。目前常采用含有內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶等在內的特定纖維素降解酶組合來實現纖維素向可發酵糖的轉化[5,44-45]。如利用可表達里氏木霉內切葡聚糖酶，CBHⅡ和棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶釀酒酵母基因工程菌株作用于非結晶纖維素和離子液體溶脹纖維素，60 h后發酵液中乙醇含量可達2.1 g/L[4]。

8 結語

微生物來源的纖維二糖水解酶具有良好的工業應用前景。在食品領域，纖維二糖水解酶可與其他食品酶制劑協同降解水果及油料果實細胞壁多糖，以利于提高出汁率或榨油率，在釀造工業中，可降解啤酒中的多糖，以利于啤酒過濾澄清，在其他工業領域，纖維二糖水解酶可用于纖維二糖的生產，紡織工業中天然纖維物料的改性，以及能源工業中燃料乙醇的生產等等。雖然近年來對于纖維二糖水解酶的研究取得了突出成績，但仍存在許多值得深入探討的問題：1)纖維二糖水解酶作為纖維素酶大家族的一類關鍵酶，其催化水解結晶纖維素的機制有待進一步明確，比如酶與底物相互作用的精確模式、纖維二糖水解酶與其他纖維素酶的協同機制等；2)獲得具有商業價值的酶制劑是纖維二糖水解酶走向工業應用的重要途徑。一方面，通過高通量篩選技術挖掘新的酶種；另一方面，通過分子進化來改善酶的作用條件和催化性能，對于食品用途酶的生產菌株，還需重視來源菌株的安全性評價；3)要進一步探索纖維二糖水解酶在食品領域的潛在利用方面，如對結晶纖維素的有限可控降解，使獲得新型食品配料或添加劑成為可能。

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Researchprogressofcellobiohydrolases

YUAN Mao-yi1,YE Fa-yin1, LEI Lin1,ZHAO Guo-hua1,2*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715,China)

Cellulose is the richest renewable resource in the world, and it has been a difficult and hot spot for research to break down into small molecular sugars and turn them into fuel or fine chemicals.Cellobiohydrolase is one of the key enzymes of cellulose biodegradation, which belongs to excision enzyme. It acts on the end of the chain of crystalline cellulose and cuts the separated beta-1,4-glycosidic bond, finally releasing cellobiose.In this article, the source, classification, structure, the action mechanism, enzymatic properties of cellobiohydrolases,molecular evolution, production situation of commercial enzymes and their application characteristics are summarized. In addition, the research perspective on cellobiohydrolasesis proposed.

cellobiohydrolase; enzymatic properties; structure; catalytic mechanism; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014791

碩士研究生(趙國華教授為通訊作者,E-mail： zhaoguohua1971@163.com。)。

果蔬典型加工過程中品質功能劣變與保質減損及其調控機理(2016YFD0400204-2)；重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)

2017-05-17, 改回日期：2017-06-20