群體感應信號分子AI-2高產乳酸菌株篩選及特性研究

蔡針華，程娜，賈震虎*，逄曉陽

1(山西師范大學 生命科學學院,山西 臨汾,041000) 2(中國農業科學院農產品加工研究所,北京,100193)

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，是一類能利用碳水化合物產生乳酸，并對人體健康有特殊作用的重要益生菌。進入宿主腸道后可以通過生物拮抗作用抑制病原菌的粘附定植[1]和生長繁殖[2-3]，在宿主腸道發育過程中發揮著重要作用[4]。據報道乳酸菌具有促進食物消化與吸收、降低血清膽固醇、抑制病原菌和抗感染、抗腫瘤及預防衰老等作用[5]。迄今為止，對乳酸菌粘附和定植腸道的詳細機制仍在探索之中，但是目前學術界關于乳酸菌腸道黏附已經達成的初步共識是，腸道菌群和宿主免疫系統通過相互作用減少炎癥反應，對維持機體微生態平衡發揮著重要作用[6]。隨著研究的不斷深入，有關乳酸菌的研究已涉及生物學和醫學的各個領域，包括乳酸菌的鑒定和分類、與粘膜免疫機制、益生作用及表達系統等[7]。研究者發現乳酸菌菌群的群體行為跟很多生物現象相關，比如生物膜形成[8]、自溶[9]、腸道定植能力等，所以大量研究開始關注乳酸菌的群體行為，而細菌的群體感應現象是研究菌群群體行為的突破口[10]。

細菌的群體感應(quorum sensing，QS)系統是通過菌體向周圍環境中分泌群體感應信號分子，同時菌體細胞膜上具有感知這種信號分子的受體，當菌群密度達到一定閾值的時候，菌體細胞膜上的信號分子受體感受到這種密度壓力后，通過磷酸化的方式將QS信號傳遞給調控基因表達的調控蛋白，通過調控蛋白對菌體的生理代謝進行調節。細菌種間交流主要是通過自體誘導劑-2(Autoinducer-2，AI-2)來完成的[11]，AI-2主要是由保守的LuxS蛋白酶在甲基循環中催化合成，這種信號分子存在于大多數細菌中，在許多微生物進行種內和種間的交流起到了關鍵的作用。目前已報道在超過80種細菌中存在luxS基因[12-13]，不僅在致病菌中有luxS基因，許多益生菌中也擁有luxS基因并能夠生成AI-2[12,14-15]。研究表明，luxS介導的群體感應系統對細菌多種生理現象具有重要的調控作用[16]，因此深入研究乳酸菌luxS基因的功能將為后續解析乳酸菌群體感應信號傳導通路、探索乳酸菌在宿主腸道內粘附定植的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

8株乳酸菌均為實驗室保藏菌株。大腸埃希氏菌 DH5α 購自北京全式金生物技術有限公司。哈維弧菌 BB152 (VibrioharveyiBB152)，哈維弧菌 BB170 (VibrioharveyiBB170)、均購自美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 培養基及試劑

LB液體培養基：10 g胰蛋白胨(TRYPTONE)(OXOID 公司)、5 g酵母提取物(YEAST EXTRACT)(OXOID公司)、10 g NaCl(生工生物)，使溶質完全溶解，調節 pH值至7.5，定容至1 L，121 ℃，15 min滅菌，4 ℃保存備用。

AB培養基：1 L培養基中加入0.05 mol/L MgSO4(AMRESCO 公司)，0.3 mol/L NaCl(AMRESCO公司)，0.2% vitamin-free Casamino Acids(BD公司), 用KOH(AMRESCO公司)調pH至7.5，121 ℃，15 min滅菌后添加10 mL 1 mol/L K2HPO4(AMRESCO公司)(0.22 μm濾器過濾)，10 mL 0.1 mol/LL-精氨酸(AMRESCO 公司)(0.22 μm 濾器過濾)，20 mL 50%甘油(0.22 μm濾器過濾)。

MRS液體培養基：北京陸橋技術股份有限公司；MB液體培養基、MB固體培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒、細菌RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒，北京全式金生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

凝膠成像儀(GelDocXR+，美國伯樂公司)；快速梯度PCR儀(TP600)，日本TAKARA公司；實時熒光定量PCR儀(ABI7500)，美國Perkin ELmer公司；全波長酶標儀(SPARK20M)，瑞士TECAN公司；恒溫培養箱(OJ5-2012R)，上海精密儀器有限公司；恒溫金屬浴(MB-102)，杭州博日科技有限公司。

1.4 菌種保藏活化及各生長時期的確定

從70多株乳酸菌中經過平板計數挑選8株進行實驗(表1)。

表1 實驗所用菌株

將凍存的8株乳酸菌分別活化3代。每代于37 ℃培養18 h，連續培養3代即可用于實驗。BB170和BB152凍干粉復蘇，劃線于MB平皿，28 ℃恒溫箱靜置至生長出大小適宜的單菌落。隨后挑單菌落于MB液體培養基中，每代于28 ℃振蕩培養24 h，連續活化培養3代即可用于實驗。取商品化DH5α，于LB

液體培養基，37 ℃，200 r/min振蕩培養10 h至指數期，每代于37 ℃振蕩培養10 h，連續培養3代即可用于實驗，每次使用按4%的接種量接種于新鮮MRS培養基中。取活化好的乳酸菌菌液以4%的接種量于新鮮的MRS液體培養基中混勻，取1 mL于24孔透明酶標板中，用多功能酶標儀每隔1 h測1次OD600 nm值，繪制生長曲線確定各菌株的指數期，平臺期。

1.5 生物學方法檢測信號分子AI-2

將已活化好的8株乳酸菌按4%接種至滅菌后的MRS液體培養基中，37 ℃繼續培養18 h(平臺期)大約109CFU/mL，將菌液6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的滅菌濾菌器過濾分裝至2 mL離心管中，得到各乳酸菌的無菌上清液；按相同方法收集28 ℃振蕩培養13 h的V.harveyiBB152無菌上清液和37 ℃培養的DH5α無菌上清液分別作為陽性對照和陰性對照；所得無菌上清液分別貯藏于-80 ℃冰箱備用。

將報告菌株培養至菌體OD600 nm為0.8～1.2，然后用新鮮的AB培養基以1∶5 000的比例與報告菌株混勻。分別將各乳酸菌、V.harveyiBB152、DH5α無菌上清液作為待測樣品、陽性對照和陰性對照，經條件優化后按1∶100混合于稀釋后的報告菌株培養液中，置于30 ℃繼續振蕩培養。不加任何菌液的只有稀釋過的報告菌株培養液作為介質對照，1～6 h內，每隔1 h取200 μL至96孔黑色酶標板中，用多功能酶標儀的生物發光模式檢測其熒光強度值，在1～6 h內，以陰性對照組熒光強度值降到最小的時間點為基準，此時陽性組相對熒光強度設為1,信號分子AI-2的強度用相對熒光表示。樣品與對照均做3個復孔，每次實驗重復3次。按照以下方式計算各菌株熒光強度：陰性對照組熒光強度為陰性對照的熒光強度值與陽性對照的熒光強度值之比；待測組相對熒光強度值為待測樣品的熒光值與介質對照熒光值之比。

1.6 luxS基因的生物學鑒定

1.6.1 引物的設計

根據 NCBI上luxS基因的DNA全長序列(No.1063754)，應用Oligo7設計內參引物(16S rRNA-F和16S rRNA-R) 及特異性引物 (LuxS-F和LuxS-R)、(LDH-F和LDH-R)并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，具體引物序列見表2。

1.6.2 菌種RNA提取及cDNA合成

將4株乳酸菌按4%的接種量轉接入MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h至平臺期，離心收集菌體細胞，按照常規Trizol法提取菌體總RNA。cDNA按如下體系進行合成：3μL RNA(1 μg)溶液中加入 4 μL Mix和 1 μL gDNA Remove，Rnase-free Water至20 μL,輕輕混勻后 42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s以獲得cDNA。

1.6.3 實時熒光定量PCR

PCR反應體系(20 μL)為：Tip Green Qpcr SuperMix 10 μL,ddH2O 8.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Passive Reference Dye(50×) 0.4 μL,模板1 μL。PCR 反應條件為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 34s，40個循環；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行DNA測序。

1.7 乳酸菌種內不同pH下信號分子AI-2與菌體密度的關系

將篩選出高產AI-2信號的乳酸菌AST18進行耐酸性與信號分子AI-2的研究，備好的菌液按4%接種到不同pH培養基中，37 ℃培養18 h，按1.3.2的方法檢測不同pH培養條件下乳酸菌AI-2的情況。樣品與對照均做3個復孔，每次實驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 各菌株生長周期的確定

結合表1和圖1選取實驗室的8株乳酸菌是因為他們在連續活化3代培養18 h后，經平板計數菌落數都是109CFU/mL，通過多功能酶標儀獲得各乳酸菌的生長曲線，它們有相同的生長周期，在培養18 h后都達到了對數末期，保證了幾株菌的菌群密度一致性，幾株菌又是實驗室研究較多的，遺傳背景比較清楚，故實驗選取這8株乳酸菌來進行后續實驗。相關研究已經證實，乳酸菌產信號分子AI-2通常都在對數末期或者穩定初期達到最高[17-18]，這可能是由于大量 AI-2信號分子隨著菌體密度的增高而增多，但當其濃度達到一定閾值時，發生的內化作用，菌體重吸收或附著在細胞膜表面，調控穩定期的某些重要生理功能[18]。由圖1顯示，8株乳酸菌大概從3 h進入指數期，10 h到達指數末期，之后進入平臺期，OD600 nm在指數末期達到最大，在18 h時OD600 nm趨于穩定，處于平臺期，因此實驗中選擇培養18 h時測定不同乳酸菌產信號分子 AI-2的熒光強度。

圖1 8株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of eight strains of lactic acid bacteria

2.2 菌株培養上清AI-2信號檢測

結合已研究的方法[17-20]進行優化設計,實驗中用到的指示菌株V.harveyiBB170是標準菌株V.harveyiBB120的定向突變菌株，產信號分子AI-2的luxS基因是完整的，所以選它為報告菌株。不同細菌產生的信號分子AI-2，都能被報告菌株V.harveyBB170識別，誘導其熒光酶基因的表達，從而產生發光反應[21]。V.harveyBB152也是突變體且只能產生信號分子AI-2，故作為陽性對照[17]，大腸埃氏菌DH5α由于缺失luxS基因不能產生AI-2信號，故作為陰性對照。由圖2可知，在0～3 h內所有對照組的熒光強度均隨時間的延長而在不斷下降，且陰性對照在3 h時熒光強度已經達到最低，之后開始升高，由于陰性對照中只包含稀釋后的報告菌株，表明當培養時間達到3 h時，指示菌產生的信號分子AI-2濃度達到誘導其發光的閾值。因此，以3 h時的熒光強度值為標準計算各菌株相對熒光強度，表示信號分子AI-2活性。依據文獻[22]研究發現，V.harveyiBB170構成的AI-2檢測體系對pH值較敏感，過酸或者過堿均會對指示菌的發光性產生影響。從最優角度出發，按照1∶100的加樣比例添加，此時體系中既含有足夠量的AI-2信號分子足以誘導V.harveyiBB170產生熒光，同時又避免了培養上清液中酸度和抑菌物質對指示菌的影響[19]。檢測結果如圖3所示，8株乳酸菌的相對熒光強度只有1株SY13小于陰性對照，說明其中7株乳酸菌均可以產信號分子AI-2，其中乳酸菌YL-6、AST18和ZNJ160201的相對熒光強度明顯高于其他幾株，乳酸菌LGG、YL-LGG-ATCC和LJJ的相對熒光強度較弱。

圖2 不同孵育時間各樣品的熒光強度值Fig.2 The luminescence of different incubation time of samples

圖3 各乳酸菌培養18 h上清液的相對熒光強度Fig.3 The relative luminescence of lactic acid bacteria in incubation time 18 h

2.3 RT-PCR檢測luxS基因表達情況

已被證明[23]在細菌物種中導致產生AI-2的生物合成途徑是高度保守的，且已經在不同乳桿菌的基因組中發現了LuxS同源物，同時早些時候已經研究了一些乳桿菌屬物種產生AI-2的情況[22，24-25]。參與AI-2生物合成的重要酶是S-核糖基半胱氨酸酶，也稱為LuxS蛋白，基因組分析發現55種以上的細菌均含有AI-2合成酶luxS的同源保守序列[26]。選取其中乳酸菌AST18、ZNJ160201和SY13、YL-LGG-ATCC這4株菌用生物學方法來檢測AI-2熒光強度是否是由關鍵基因luxS所控制和熒光方法的準確性。對4株乳酸菌進行RT-PCR檢測，luxS基因的表達情況如圖4。luxS基因在乳酸菌AST18、ZNJ160201表達較強，在YL-LGG-ATCC表達較弱，而在SY13菌株中幾乎沒有表達，與圖2的熒光結果較一致，同時通過結合兩種檢測結果，說明AI-2熒光強度是由關鍵基因luxS所控制。

圖4 四株乳酸菌luxS基因和LDH基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of luxS gene and LDH gene of four lactic acid bacteria

LEBEE[24]等人已經研究得出luxS基因在乳酸菌中有中樞代謝作用。同時群體感應必不可少可能伴隨著能量反應，luxS基因可能間接的參與了EMP,磷酸戊糖和TCA等循環，因而實驗又選擇LDH基因來檢測QS系統與新陳代謝之間的關系。發現當luxS基因表達較強時，而LDH基因表達較弱，LDH基因編碼乳酸脫氫酶的生成，進而催化丙酮酸生成乳酸，乳酸是谷氨酸發酵的主要副產物，所以當luxS基因表達較強時，LDH基因相對較弱，乳酸生成相對較少，有利于宿主體內腸道的酸堿平衡，繼而維持腸道菌群平衡，從而在腸道內發揮益生作用。對這4株菌進行基因組提取，普通PCR擴增后，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖5所示，與實時熒光聚合酶列式反應結果一致，說明菌株AST18和ZNJ160201的AI-2信號強，luxS基因表達較強，AI-2信號強度是由關鍵基因luxS所主導。同時通過3個結果的一致性也說明了熒光檢測與RT-PCR檢測相結合是比較準確的方法用于群體感應信號分子AI-2的檢測。

圖5 LuxS基因PCR產物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of luxS gene amplified by PCR

2.4 生物發光與耐酸性特性研究

據報道[27],有機酸、蘋果酸對致病菌AI-2信號的產生有抑制作用。luxS基因參與環境調控脅迫，如酸性脅迫已經在變形鏈球菌中被證明[28-29]，但是該基因在乳酸桿菌中酸適應的作用尚不清楚。實驗探究乳酸菌在強酸環境中生長后AI-2信號變化情況，結果如圖6，乳酸菌在不同pH的培養基中培養后，AI-2信號也大不相同。在菌體數達到一定閾值時，能夠激發報告菌株發光酶的活性，誘導報告菌株發光，酸性越強AI-2信號越強。當pH等于3.5時，菌體密度幾乎是最低的，但是AI-2信號是最強的。而當pH等于2.5時，過酸的環境不利于菌體的生長，可能是菌體數沒有達到閾值，所以AI-2信號較弱，上述所得結果與1.3中檢測的LDH基因和luxS基因的表達相符合。這樣的結果說明AI-2信號提高了乳酸菌酸脅迫作用，繼而發揮其腸道益生作用；同時也說明菌體密度并不是群體感應變化的主要原因，可能與其所處的環境有極大的關系。為以后研究乳酸菌通過群體感應系統調節腸道菌群平衡及發揮免疫功能提供了一定的幫助。

圖6 不同pH條件下熒光強度與OD600 nm的關系Fig.6 The relationship of light intensity and OD600 nm under unequal pH condition

3 結論

本研究篩選出3株高產群體感應信號分子AI-2乳酸菌，通過RT-PCR檢測證明了熒光篩選方法的可靠性，同時確定了luxS基因編碼的LuxS蛋白是控制群體感應信號分子AI-2的主要酶。同時得出在酸性環境中AI-2信號更強，說明乳酸菌能夠通過群體系統的調控在酸性腸道內存活，并調控腸道菌群平衡，發揮其免疫功能。本研究為下一步研究luxS突變株與群體感應，免疫調節功能等關系奠定了基礎。

[1] BAUMGART D C ,SDIGNASS A U. Intestinal barrier function[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2002, 5(6): 685-694.

[2] LI X J,YUE L Y,GUAN X F,et al. The adhesion of putative probiotic lactobacilli to cultured epithelial cells and porcine intestinal mucus[J]. J Appl Microbiol, 2008, 104(4): 1 082-1 091.

[3] OHLAND C L,MACNAUGHTON W K. Probiotic bacteria and intestinal epithelial barrier function[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 298(6): G807-819.

[4] SOMMER F, BACKHED F.The gut microbiota-masters of host development and physiology[J]. Nat Rev Microbiol, 2013, 11(4): 227-238.

[5] 代永剛，田志剛，南喜平. 乳酸菌及其生理功能研究的進展[J]. 農產品加工(學刊), 2009(7): 24-26;29.

[6] 李紅娟.LactobacilluscaseiAST18抗真菌代謝產物分析及抑菌作用研究[D].北京：中國農業科學院, 2014.

[7] 任大勇,李昌,秦艷青,等. 乳酸菌益生功能及作用機制研究進展[J]. 中國獸藥雜志,2011,45(2):47-50.

[8] 謝麗斯，張宏梅，劉學祿，等. 從腐敗食品中分離的乳酸菌生物被膜形成的影響因素[J]. 食品與發酵工業, 2011, 37(3): 6-8.

[9] 孫潔. 乳酸菌發酵劑菌株的自溶特性及機理研究[D].北京：中國農業科學院, 2010.

[10] 馮鎮，張蘭威. 乳酸桿菌LB-3自溶酶特性研究[J]. 中國乳品工業, 2008, (9): 18-21.

[11] ASCENSO O S,MARQUES J C,SANTOS A R,et al. An efficient synthesis of the precursor of AI-2, the signalling molecule for inter-species quorum sensing[J]. Bioorg Med Chem, 2011, 19(3): 1 236-1 241.

[12] PARK H,YEO S,JI Y,et al.Autoinducer-2 associated inhibition byLactobacillussakeiNR28 reduces virulence of enterohaemorrhagicEscherichiacoliO157:H7[J]. Food Control, 2014, 45: 62-69.

[13] JIMENEZ J C,EDERLE M J. Quorum sensing in group A Streptococcus[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2014, 4(4):127.

[14] CHRISTIAEN S E,CONNELL MOTHERWAY M O,BOTTACINI F,et al. Autoinducer-2 plays a crucial role in gut colonization and probiotic functionality ofBifidobacteriumbreveUCC2003[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e98111.

[15] YEO S,PARK H, JI Y,et al. Influence of gastrointestinal stress on autoinducer-2 activity of twoLactobacillusspecies[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2015, 91(7).DOI:10.1093/femsec/fivo65.

[16] MAN Li-li,MENG Xiang-chen,ZHAO Ri-hong. Induction of plantaricin MG under co-culture with certain lactic acid bacterial strains and identification ofLuxSmediated quorum sensing system inLactobacillusplantarumKLDS1.0391[J]. Food Control, 2012, 23(2): 462-469

[17] MOSLEHI-JENABIAN S,GORI K,JESPERSEN L.AI-2 signalling is induced by acidic shock in probiotic strains ofLactobacillusspp.[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 135(3): 295-302.

[18] GORI K,MOSLEHI-JENABIAN S,PURROTTI M,et al. Autoinducer-2 activity produced by bacteria found in smear of surface ripened cheeses[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(1): 48-53.

[19] 張騰，賀銀鳳. 堅強腸球菌SQ-3-2基于Lux S群體感應系統信號分子AI-2的檢測及方法優化[J]. 食品與發酵工業, 2013, 39(2): 168-173.

[20] LI Z,NAIR S K.Quorum sensing: How bacteria can coordinate activity and synchronize their response to external signals?[J]. Protein Science, 2012, 21(10): 1 403-1 417.

[21] LEBEER S, CLAES I J J, VERHOEVEN T L A,et al. Impact ofluxSand suppressor mutations on the gastrointestinal transit ofLactobacillusrhamnosusGG[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(15): 4 711-4 718.

[22] DEKEERSMAECKER S C,VANDERLEYDEN J.Constraints on detection of autoinducer-2 (AI-2) signalling molecules usingVibrioharveyias a reporter[J]. Microbiology, 2003, 149(8): 1 953-1 956.

[23] WINANS S C,BASSLER B L. Mob psychology[J]. J Bacteriol, 2002, 184(4): 873-883.

[24] LEBEER S,DE KEERSMAECKER S C,VERHOEVEN T L. Functional analysis ofluxSin the probiotic strainLactobacillusrhamnosusGG reveals a central metabolic role important for growth and biofilm formation[J]. J Bacteriol, 2007, 189(3): 860-871.

[25] TANNOCK G W,GHAZALLY S,WALTER J,et al. Ecological behavior ofLactobacillusreuteri100-23 is affected by mutation of theluxSgene[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8 419-8 425.

[26] RAO R M,PASHA S,SOWDHAMINI R. Genome-wide survey and phylogeny of S-Ribosylhomocysteinase (LuxS) enzyme in bacterial genomes[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 742.

[27] ALMASOUD A, HETTIARACHCHY N,RAYAPROLU S,et al. Inhibitory effects of lactic and malic organic acids on autoinducer type 2 (AI-2) quorum sensing ofEscherichiacoliO157:H7 andSalmonellaTyphimurium[J]. Lwt-Food Science and Technology, 2016, 66: 560-564.

[28] WEN Z T, BUME R A.LuxS-mediated signaling inStreptococcusmutans is involved in regulation of acid and oxidative stress tolerance and biofilm formation[J]. J Bacteriol, 2004, 186(9): 2 682-2 691.

[29] SZTAJER H,LEMME A,VILCHEZ R,et al. Autoinducer-2-regulated genes inStreptococcusmutansUA159 and global metabolic effect of theluxSmutation[J]. J Bacteriol, 2008, 190(1): 401-415.