四川自然發酵香腸中組胺降解菌的篩選鑒定及初步應用

張楠，楊勇，李彬彬，徐曄，李仁杰，張姍

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

四川自然發酵香腸簡稱四川香腸或川味香腸，是我國傳統發酵肉制品之一，因其麻辣爽口的特點深受消費者喜愛。近年來，發酵食品的食用安全性問題不斷受到關注，而生物胺是關注熱點。四川香腸的成熟伴隨著復雜的微生物變化和蛋白質變化，原料肉以及自然環境中的微生物可能會產生氨基酸脫羧酶，導致生物胺的產生。生物胺是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有機化合物[1]，對于維持人體正常生理功能有著重要意義。但是，過量的生物胺會對人體健康造成危害，如高血壓、頭痛、腹瀉和嘔吐等[2]，其中組胺的毒性最大[3]。

SUN等[4]研究結果表明，30種市售四川香腸中組胺為最主要的生物胺，且所有樣品中組胺含量超過了100 mg/kg。孫霞等[5]對傳統發酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化結果表明，組胺含量在成熟時高達127.90 mg/kg。盧士玲等[6]調查的42個傳統中式香腸中，有11.9%的樣品組胺超過規定標準。PAPAVERGOU等[7]發現，50個希臘發酵干香腸中組胺含量在0～515 mg/kg之間，有28%的樣品組胺含量超過了100 mg/kg。ROSEIRO等[8]發現，20%的薩拉米香腸中組胺含量超過了100 mg/kg，成熟30 d的香腸中生物胺總量約為2 500 mg/kg。由此可見，控制發酵香腸中組胺的含量，對保證發酵香腸的安全有重要意義。

目前，國內外專門針對發酵香腸中組胺降解菌篩選的研究還鮮有文獻報道。本研究以四川省內不同地區的20個自然發酵香腸樣品作為實驗材料，對能用做香腸發酵劑且具有降解組胺能力的菌株進行篩選鑒定，為四川香腸的安全生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

20個自然發酵香腸樣品均購于四川省的4個不同區域，分別是川西8個(成都市3個、雅安市3個和資陽市2個)、川東4個(遂寧市2個、南充市2個)、川北4個(綿陽市2個和廣元市2個)、川南4個(宜賓市2個、攀枝花市2個)。香腸成熟時間均為30 d，采樣后置于無菌塑料袋中，4℃下貯藏備用。

新鮮豬肉、腸衣、食鹽、白酒、白糖等原輔料均購于四川省雅安市農貿市場。

2株生物胺產生菌大腸桿菌(Escherichiacoli)和奧默柯達菌(Kodamaeaohmeri)由四川農業大學食品學院肉品加工實驗室從四川香腸中分離得到。

1.2 試劑與儀器

試劑：組胺標品、丹磺酰氯：Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇等：色譜純；色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、磷酸吡哆醛、鹽酸二甲基對苯二銨鹽酸鹽、α-萘酚等：分析純；細菌總DNA提取試劑盒、PCR相關試劑：天根公司。

儀器：SW-GJ-IFD型超凈工作臺，蘇凈集團泰安公司；SYQ-DSX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；BMS602型均質機，德國BRT公司； LC-2010CHT高效液相色譜儀，日本島津；PCR和凝膠成像儀，Bio-Rad；pHS-3C+酸度計；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；游標卡尺，恒量公司；牛津杯(內徑0.6±0.01 cm，外徑0.8±0.01 cm，高度1.0±0.01 cm)。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基制作

產胺上層培養基：溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 5.2。產胺下層培養基：MRS固體培養基中加入5 g色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸，0.05 g磷酸吡哆醛，調pH 5.2。

1.3.2 降生物胺乳酸菌分離純化

參照盧世玲等[6]的方法略做修改。取25 g肉樣于225 mL無菌生理鹽水中均質混勻，取1 mL進行富集培養并梯度稀釋，取稀釋液200 μL涂布于含8 g/L CaCO3的MRS固體培養基上培養24 h，挑取具有溶鈣圈的菌株于產生物胺顯色培養基上進行顯色，每個適宜稀釋度平行3次。5 min內顯紫色的為產胺菌，黃色為不產胺菌，平行顯色2次。將2次均顯黃色菌株于MRS培養基上分離純化3次后于4 ℃斜面保藏備用。

1.3.3 菌株初篩

能用做發酵肉制品發酵劑的乳酸菌應耐受6% NaCl和150 mg/kg NaNO2，具有產酸能力較強，發酵葡萄糖不產氣，不產H2O2、H2S、NH3和黏液等特點。由于蛋白質為生物胺的前體物質，菌株還需對蛋白質無明顯的分解作用，此外具有氧化酶活性的菌株可以降解生物胺。據此，進行以下篩選實驗[9-10]：耐食鹽試驗、耐亞硝酸鹽試驗、產黏性試驗、葡萄糖產氣試驗、產H2S試驗、H2O2試驗、過氧化氫酶試驗、產色素檢測、精氨酸產氨試驗、V-P試驗、石蕊牛乳試驗、硝酸鹽還原試驗、蛋白質降解活性試驗和氧化酶活性試驗。

1.3.4 菌株復篩

取初篩菌株分離純化3次，并在MRS液體培養基中活化3次，然后接入含300 μg/mL組胺的營養肉湯培養基中，37 ℃培養48 h后，取1 mL樣品，加入0.1 mol/L的鹽酸1 mL后于-20 ℃冰箱中待測。取1 mL含300 μg/mL組胺的營養肉湯培養基1 mL作為空白對照。樣品平行測定3次取平均值。

1.3.4.1 標準溶液配制與柱前衍生

準確稱取組胺標品0.010 0 g，用0.1 mol/L的鹽酸定容至10 mL，分別吸取5、10、20、50、100、200、500、1 000 μL的標準溶液定容至10 mL，各取1 mL依次加入200 μL 2 mol/L NaOH，300 μL飽和NaHCO3和2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液并混勻，40 ℃暗反應45 min后加入100 μL的NH4OH去除殘留的丹磺酰氯，加乙腈定容至5 mL后 0.45 μm濾膜過濾，用于標曲繪制。

1.3.4.2 樣品檢測

待測樣品衍生步驟同1.3.4.1。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，采用梯度洗脫程序，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 菌種鑒定

1.3.5.1 菌落形態特征鑒定

菌落形態：觀察分離得到的菌落形態(形狀、顏色等)，并記錄結果。

菌株形態：將菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(大小、形狀等)，并記錄結果。

1.3.5.2 生理生化特征鑒定

將篩選得到的菌株用微量發酵管進行生理生化鑒定，參考乳酸菌的鑒定標準[11]，對菌株生理生化特征進行分析。

1.3.5.3 分子生物學鑒定

將所分離得到的菌株在MRS液體培養基中37 ℃培養24 h，按照天根公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行PCR擴增。

所選用的引物為通用引物：上游引物為27f，下游引物為1492r。PCR反應為25 μL體系：包括1 μL的模板DNA，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq Master MIX 12.5 μL，無菌水9.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，30個循環(95 ℃變性1 min；55 ℃退火90 s；72 ℃延伸2 min)，最終72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送成都擎科公司測序，并與NCBI數據庫中已知序列進行對比。

1.3.6 菌株生長特性

1.3.6.1 菌株生長能力和產酸能力測定

將菌株接種到MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，每2 h分別用分光光度計和pH計測定600 nm處吸光值和pH值，以空白培養基作為對照，平行3次取平均值。

1.3.6.2 菌株耐食鹽能力和耐亞硝酸鹽能力測定

將菌株接種到分別含0、20、40、60、80 g/L NaCl和分別含0、50、100、150、200 mg/kg NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，用分光光度計測定600 nm處吸光值，以空白培養基作為對照，平行3次取平均值。

1.3.6.3 菌株在不同溫度和酸度下生長能力測定

將菌株接種到MRS液體培養基中，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養24 h，用分光光度計測定600 nm處吸光值，以空白培養基作為對照，平行3次取平均值。

將菌株接種到pH值為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，用分光光度計600 nm處吸光值，以空白培養基作為對照，平行3次取平均值。

1.3.7 抑菌試驗

1.3.7.1 降解菌之間的抑制作用

參考劉冬梅等[12]的方法，以鑒定得到的降解菌兩兩做抑菌試驗，步驟如下。指示菌在MRS液體培養基中活化24 h后調OD值為0.8±0.02，取200 μL培養液涂布于營養瓊脂培養基上；受試菌活化24 h后調OD值為0.8±0.02，取1 mL接種到新的培養基中37 ℃培養24 h， 95 ℃水浴15 min后8 000g離心10 min，取上清液200 μL接入牛津杯中，4 ℃擴散4 h后，37 ℃培養24 h，觀察現象。以空白培養基做對照，平行4次。

1.3.7.2 組胺降解菌對產胺菌的抑制作用

以兩兩間無抑制作用的降解菌分別對產胺菌做抑菌試驗；以降解菌按1∶1∶1的比例混合后對產胺菌做抑菌試驗。指示菌和受試菌濃度的調整同1.3.7.1，以空白培養基做對照，平行4次。用游標卡尺測定抑菌圈大小。

1.3.8 組胺降解菌對四川香腸組胺含量的影響

1.3.8.1 香腸制作和樣品采集

參照鞏洋[13]的配方和工藝流程制作香腸。

本研究在預實驗的基礎上，確定香腸的工藝參數：發酵溫度20 ℃，發酵相對濕度75%，發酵時間2 d；成熟溫度13 ℃，成熟相對濕度60%，成熟時間28 d。以篩選得到的組胺降解菌作為發酵劑，接種量為107CFU/g，菌株按照1∶1∶1的比例混合加入。

實驗分組：A組為未接種組，B組為接種組。取香腸加工貯藏過程中的9個工藝點，即0(原料肉)、2、6、10、14、18、22、26、30 d進行采樣。

1.3.8.2 組胺含量測定

取5 g肉加入20 mL 0.1 mol/L的鹽酸勻漿，4 ℃，4 000g離心10 min，沉淀部分如前的方法再提取1次。取2次的上清液用0.1 mol/L的鹽酸定容到50 mL，取1 mL樣液進行柱前衍生。衍生步驟同1.3.4.1，測定方法同1.3.4.3。

1.3.9 數據處理與統計分析

2 結果與討論

2.1 組胺降解菌的篩選

2.1.1 菌株分離純化結果

溴甲酚紫的pH變色范圍為5.2(黃色)～6.8(紫色)，而生物胺是一種有機堿，當菌株產生生物胺時會使培養基的pH值高于6.8而變為紫色。采用單層平板培養雙層平板顯色的方法，從不同地區的20個市售四川香腸樣品中一共分離得到能在MRS培養基上生長且具有溶鈣圈，倒入上層培養基顯黃色(不產生物胺)的菌株256株(圖1-b)；分離得到在營養瓊脂培養基上生長，倒入上層培養基顯紫色(產生物胺)的菌株7株(圖1-a、1-c)。

2.1.2 菌株初篩結果

圖1 培養基顯色結果Fig.1 Chromogenic result of color medium

由于水分的散失，香腸在成熟時食鹽和亞硝酸鹽的質量分數能達到6%和0.015%左右。因此，能用作發酵劑的菌株應耐受質量分數為6%的食鹽和質量分數為0.015%的亞硝酸鹽。黏液能影響香腸的組織狀態，產氣會影響香腸結構的致密性，H2S、H2O2和NH3等不良氣體會影響香腸的風味，色素會影響香腸的感官。因此，發酵劑應該不產黏液、H2S、H2O2、NH3和色素等。另外，亞硝酸鹽不僅具有發色作用，還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，因此菌株還應該具有還原硝酸鹽的能力。由于蛋白質是生物胺的前體物質，發酵劑最好不具有蛋白質降解能力。具有氧化酶活性的菌株可以降解生物胺。

在分離得到的256株菌中，符合發酵肉制品發酵劑相關標準且具有氧化酶活性的菌株共17株，編號分別為2、4、19、25、33、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50，初篩結果如表2所示。將這17株菌進行組胺降解能力的測定。

表2 菌株初篩結果

注：+：反應為陽性；-：反應為陰性。

2.1.3 菌株降組胺能力

2.1.3.1 組胺標準曲線繪制結果

由圖2可知，溶劑峰及雜質峰在5 min前洗脫，組胺的保留時間為15.018 min，保留時間相對穩定，峰形對稱、尖銳，能達到較好的分離度。根據峰面積求得組胺濃度的回歸方程為y=22 214x+993.97，決定系數R2=0.999 1，說明線性良好。

圖2 組胺標品高效液相色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of standard histamine

2.1.3.2 組胺降解率測定結果

由圖3可知，17株菌對組胺都有不同程度的降解能力，其中19號、41號、46號、47號和48號菌株的降解率分別為23.07%、17.90%、14.48%、15.47%和26.79%，均高于10%，可用于后續實驗。

圖3 菌株的組胺降解率Fig.3 The histamine degradation rate of strains

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態學鑒定結果

將復篩得到的組胺降解率較高的菌株接種到MRS培養基上，37 ℃培養24 h后觀察菌落形態并進行革蘭氏染色。菌株和菌落的形態學鑒定結果如表3所示。

表3 菌株形態和菌落形態鑒定表

2.2.2 生理生化鑒定結果

參照《乳酸細菌分離鑒定及其試驗方法》對復篩得到的5株菌進行生理生化鑒定，結果如表4所示。初步判定19號為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，41號為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，46號為混淆魏斯氏菌(Weissellaconfusa)，47號和48號為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。

表4 菌株生理生化鑒定結果

注：+：反應為陽性；-：反應為陰性；/：未檢測。

2.2.3 分子生物學鑒定結果

采用試劑盒提取編號為19、41、46、47和48菌株的DNA，用通用引物對5株菌的16S rDNA進行擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳后得到5條長約1 500 bp的擴增產物，如圖4所示。

圖4 16S rDNA的PCR產物電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of 16S rDNA PCR amplification

泳道1為marker DL 2 000，泳道2為19號菌株的PCR產物，泳道3為41號菌株的PCR產物，泳道4為46號菌株的PCR產物，泳道5為47號菌株的PCR產物，泳道6為48號菌株的PCR產物。將PCR測序結果與NCBI數據庫中的已知序列進行對比，結果如表5所示。

表5 菌株分子生物學鑒定結果

2.3 抑菌試驗

2.3.1 組胺降解菌之間的抑制作用

牛津杯抑菌實驗結果表明，19號、41號、46號、47號和48號5株菌之間無明顯拮抗作用。由于屎腸球菌可能具有耐藥性，根據菌株鑒定結果，選擇19號、41號和46號3株安全的且為食源性的乳酸菌，用于后續研究。

2.3.2 組胺降解菌對產胺菌的抑制作用

圖5(a)為混合菌對大腸桿菌的抑菌圖，圖5(b)為單一菌對奧默柯達菌的抑菌圖。抑菌圈測量結果發現，19號、41號、46號以及混合菌對大腸桿菌的抑菌圈大小分別在1.530～1.566、1.360～1.478、1.412～1.470、1.688～1.886 cm范圍內，對奧默柯達菌的抑菌圈大小分別在1.312～1.354、1.318～1.402、1.210～1.370、1.422～1.464 cm范圍內。由表6可知，菌株對大腸桿菌的抑制作用比奧默柯達菌強，表明大腸桿菌的敏感性比酵母菌強，這可能是由于細菌和真菌的細胞結構不同導致對抑菌物質的敏感性不同。許多研究表明，乳酸菌的代謝產物，如乳酸[16]，乳酸鏈球菌肽[17]，有機酸[18]等均具有抑菌活性，而混合菌種對產胺菌的抑菌圈大小顯著大于單一菌種對產胺菌的抑菌圈大小(p<0.05)，可能是因為不同菌株的發酵液中的抑菌物質對產胺菌的抑制具有協同作用，而抑菌物質的確定還有待進一步研究。

a-混合菌對大腸桿菌的抑菌圖；b-單一菌對奧默柯達菌的抑菌圖圖5 組胺降解菌對組胺產生菌的抑制作用Fig.5 The inhibition of histamine reducing strains to histamine producing strains

表6 抑菌實驗結果

Table 6 The results of inhibition

受試菌抑菌圈直徑/cm大腸桿菌奧默柯達菌空白0.805±0.0040.802±0.00319號1.546±0.0151.334±0.01741號1.422±0.0491.368±0.03746號1.444±0.0271.312±0.071混合菌1.772±0.0881.436±0.019

2.4 組胺降解菌的生長特性

2.4.1 菌株的生長能力和產酸能力

能用做香腸發酵劑的菌株需要有較強的生長能力和產酸能力。由圖6和圖7可知，3株菌的生長能力和產酸能力為19號高于41號高于46號，在培養24 h后培養基的pH值均低于5.0，說明3株菌均具有較好的產酸能力，符合生產發酵香腸的基本要求。

圖6 菌株的生長能力Fig.6 The growth ability of strains

圖7 菌株的產酸能力Fig.7 The acid producing ability of strains

2.4.2 菌株的耐食鹽和耐亞硝酸鹽能力

能用于香腸發酵劑的菌株需要能耐受60 g/L的食鹽和150 mg/kg的亞硝酸鹽。由圖8和圖9可知，當食鹽質量濃度低于60 g/L時3株菌均能生長，當質量濃度升高到80 g/L時，3株菌培養24h后的OD值均低于0.2，這是由于較高的食鹽濃度增加了滲透壓從而抑制了菌株的生長活性；亞硝酸鹽濃度在0～200 mg/kg范圍內，3株菌均能較好地生長。該結果表明，3株菌耐受一定濃度的食鹽和亞硝酸鹽，符合生產發酵香腸的發酵劑的基本要求。

圖8 菌株的耐食鹽能力Fig.8 The resistant to salt of strains

圖9 菌株的耐亞硝酸鹽能力Fig.9 The resistant to nitrite of strains

2.4.3 不同pH和溫度下的生長能力

香腸的發酵和成熟溫度通常在10～20 ℃之間，香腸成熟時pH值通常在5.2～5.6之間。由圖10和圖11可知，3株菌均可在一定的低溫和低pH值情況下生長，能滿足香腸發酵的要求。

圖10 不同pH值下3菌株的生長能力Fig.10 The growth ability at different pH

圖11 不同溫度下3菌株的生長能力Fig.11 The growth ability at different temperature

2.5 四川香腸加工過程中組胺含量的變化

由圖12可知，香腸發酵結束時(2 d)未檢測到組胺，而在香腸成熟的整個過程中，未接種組和接種組的組胺含量均呈上升趨勢，與孫霞等[19]結果相似。這可能是因為原料肉中組氨酸含量較低，隨著成熟過程中大量的蛋白質分解產生組氨酸，而組氨酸在微生物的作用下產生組胺而不斷積累。香腸成熟時(30 d)，接種組的組胺含量(46.56 mg/kg)比未接種組的組胺含量(66.77 mg/kg)降低了30.26%，說明混合發酵劑確實能顯著降低(p<0.05)四川香腸中組胺的含量。但是，由抑菌實驗可知發酵劑對產胺菌也具有較強的抑制作用，有多少組胺是通過發酵劑產生的氧化酶降解而減少的，有多少組胺是由于產胺菌被抑制而減少的，還有待深入研究。

圖12 組胺含量的變化Fig.12 The change of histamine content during fermentation

3 結論

本實驗通過平板顯色法和高效液相色譜法能對組胺降解菌進行有效地分離篩選，得到符合發酵劑相關標準，能較好地降解組胺含量且為食源性的乳酸菌共3株，分別為植物乳桿菌、戊糖片球菌和混淆魏斯氏菌，對組胺的降解率分別達23.07%、17.90%、14.48%。3株菌之間無明顯拮抗作用，具有較好的生長能力和產酸能力，能耐受低溫、低pH值、60 g/L的食鹽及150 mg/kg的亞硝酸鹽，滿足發酵香腸的生產要求?；旌暇瓯葐我痪昴芨玫匾种飘a胺菌的生長。香腸成熟30 d時，接種組按照1∶1∶1的比例混合，可顯著降低組胺含量。本研究結果表明，在四川香腸發酵過程中接種專門篩選的乳酸菌可以降低其組胺的含量，這對于提升傳統發酵肉制品的食用安全性具有重要的意義。

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