γ-聚谷氨酸復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

白登榮，劉根，賀雪華，尚永彪,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715) 2(農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室(重慶)，重慶,400715) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶,400715)

目前常見的肉糜制品種類繁多，但主要是魚肉糜和豬肉糜，雞肉糜卻很少，這主要是由于雞肉的一些固有特性使得雞肉糜的加工較魚肉糜和豬肉糜復雜[1]，嚴重限制了雞肉糜制品的產業化發展。在肉類加工過程中，肌肉鹽溶性蛋白的凝膠特性很大程度上決定了肉糜類制品的質地、組織狀態、外觀和出品率等[2]，而且受眾多因素的影響。為了改善雞肉糜制品的凝膠特性，目前研究較多的是加入添加劑，如谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TGase)、大豆分離蛋白、多糖、多聚磷酸鹽等。此外，如漂洗、斬拌、超高壓處理及加熱方式等凝膠制備工藝的優化也從很大程度上改善了雞肉糜制品的凝膠特性。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是一種水溶性、可生物降解、無毒性的高分子氨基酸聚合物[3-4]，它能夠增加腸胃蠕動，促進小腸對礦物質的吸收，且其降解產物谷氨酸單體還可以被人體吸收利用[5-6]。TGase是一種催化?；D移反應的酶，它能使蛋白質分子間發生交聯，改變蛋白質的空間網絡結構，從而改善蛋白質的凝膠特性。近年來，在TGase改善肌原纖維蛋白凝膠特性等方面的研究已經相當廣泛，但關于γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響的研究鮮有報道。本文以冷凍雞胸肉為原料，研究不同質量分數的γ-PGA和TGase復合后對其肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，并分析凝膠特性變化的機理，以幫助解決雞肉糜凝膠特性差等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，購于重慶北碚永輝超市，-18 ℃冷凍儲藏備用。使用前取一定量的雞胸肉解凍后剔除可見脂肪及結締組織，加入冰水斬拌成肉糜，于4 ℃條件下冷藏。

Na2HPO4、NaH2PO4、牛血清蛋白、CuSO4、尿素、KCl、NaCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、β-疏基乙醇、HCl，成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉寧波大川精細化工有限公司；SDS、2-硝基苯甲酸(DTNB)，BIOSHARP；Tris Sigma-Alorich，以上均為分析純。TGase(酶比活力為100 U/g)，東圣食品科技有限公司；γ-PGA，軒凱生物科技有限公司，以上均為食品級。

1.2 儀器與設備

PHS-4C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；XHF-D內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；722-P可見分光光度計，上?，F科儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；RZ-288c攪肉機美的集團；DW-25W518冰箱，青島海爾電器有限公司；UltraScan PRO測色儀，美國HunterLab公司；CT-3質構儀，美國Brookfield公司；Mini-PROTEAN?電泳槽，美國BIO-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)的提取

參考XIONG[7]的方法并稍作修改。取一定量的雞肉糜加入4倍體積0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 7.0)，10 000 r/min高速勻漿60 s后冷凍離心(4 ℃、5 500 r/min)15 min，棄去上清液，將所得沉淀按上述步驟重復提取2次，然后將所得沉淀與4倍體積0.1 mol/L NaCl (pH 6.25)混合，6 000 r/min高速勻漿30 s，4 ℃、5 500 r/min離心15 min，在將所得沉淀與8倍體積0.1 mol/L NaCl(pH 6.25)混合，過濾、去除結締組織，4 ℃、5 500 r/min離心15 min后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。蛋白質含量的測定采用雙縮脲法。

1.3.2 肌原纖維蛋白熱誘導凝膠的制備

取一定量的肌原纖維蛋白于4 ℃的磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4、pH 6.5)中，在4 ℃條件下2 800 r/min勻漿24 s使蛋白充分溶解，勻漿過程中盡量避免氣泡的產生，使蛋白質溶液質量濃度為40 mg/mL，分別加入不同質量分數的γ-PGA(0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%)和TGase(0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%)混勻，調節pH值為6.5，在4 ℃條件下處理1 h，然后取7 mL樣液于10 mL的離心管中，在水浴鍋中先40 ℃保溫30 min，然后80 ℃保溫30 min形成凝膠，快速冷卻，然后在4 ℃的條件下放置過夜后進行凝膠相關特性的測定。

1.3.3 凝膠硬度和彈性的測定

制備好的凝膠從4 ℃條件下取出后放于室溫下平衡30 min。使用質構儀對其凝膠硬度和彈性進行測定。測定參數設置如下：探頭類型：TA5；測前速度：5 mm/s；測中速度：1 mm/s；測后速度：1 mm/s；壓縮比：50%；觸發點負載：5.0 g；觸發類型：Auto；數據攫取速率：200 Hz；停留時間：5 s。

1.3.4 凝膠保水性的測定

參考SALVADOR等[8]的方法對凝膠保水性進行測定。制備好的凝膠從4 ℃條件下取出后放于室溫下平衡30 min，放入離心管中稱重記為m1；于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，除去離心管中的水后稱重記為m2，結果取平均值。凝膠保水性計算見公式(1)：

(1)

式中：m，離心管的質量，g；m1，離心前離心管和凝膠的質量，g；m2，離心后離心管和凝膠的質量，g。

1.3.5 凝膠白度值的測定

采用UltraScan PRO色差儀進行凝膠白度值分析，測色儀先用白、黑板校正，然后將樣品垂直緊扣在鏡口，測定并記錄L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)，所有樣品做3次平行實驗，每個樣品取3個點進行測定，每個點重復3次，結果取平均值。白度值的計算見公式(2)：

(2)

1.3.6 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用的測定

1.3.7 活性巰基和總巰基的測定

參考ELLMAN[10]的方法并作適當的修改。稱取8 g蛋白凝膠化樣品溶解于22 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液C(pH 7.0，內含10 mmol/L EDTA、0.6 mol/L KCl)中，10 000 r/min均質30 s后10 000 r/min離心10 min。利用雙縮脲法測定上清液中蛋白質量濃度并調節至1 mg/mL。取5.5 mL蛋白溶液與0.1 mL DTNB(10 mmol/L)混合，4 ℃條件下放置1 h后在412 nm處測定溶液的吸光度，計算活性疏基含量；取0.5 mL蛋白溶液與5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液D(pH 8.0，內含10 mmol/L EDTA、0.6 mol/L KCl、8 mol/L尿素)混合，再加入0.1 mL DTNB(10 mmol/L)，40 ℃條件下保溫25 min后在412 nm處測定溶液的吸光度，計算總巰基含量。巰基的摩爾吸光系數為13 600 (L/mol·cm)。

1.3.8 凝膠蛋白溶解度的測定

參考RAWDKUEN等[11]方法。稱取1 g蛋白凝膠化樣品溶解于20 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(內含1% SDS，8 mmol/L尿素和2% β-疏基乙醇，pH 8.0)中，均質后在100 ℃加熱2 min，室溫下攪拌4 h，然后10 000 r/min離心30 min。取上清液10 mL，加入2 mL 冷的50%TCA，混合液在4 ℃條件下放置18 h后10 000 r/min離心20 min，取沉淀用10%的TCA沖洗，待沉淀風干后溶于0.5 mmol/L NaOH中。利用雙縮脲法測定蛋白質濃度，結果以可溶性蛋白占總蛋白(樣品直接溶于0.5 mmol/L NaOH中測得的蛋白含量)含量的百分比表示。

1.3.9 肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳

參考LAEMMLI[12]的方法進行凝膠電泳的測定。取一定量的肌原纖維蛋白用0.6 mol/L NaCl(pH 6.5)溶液調節蛋白質質量濃度為2 mg/mL，加入不同質量分數的γ-PGA和TGase混勻，調節pH值為6.5，在4 ℃條件下處理1 h后進行電泳樣品的制備。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳開始時先采用恒定電流15 mA，待樣品進入分離膠后將電流調節至25 mA。

1.3.10 數據處理

所有試驗重復3次，每個處理有3個平行樣，結果取平均值。用Excel 2015對數據進行處理，用Origin軟件進行繪圖，用SPSS Statistics 17.0對數據進行顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響如圖1所示。

圖1 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度(a)和彈性的影響(b)Fig.1 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on the hardness and springiness of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖1可知，在未添加TGase時，隨著γ-PGA質量分數的增大，凝膠硬度和彈性呈先增大后減小的趨勢，且在γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠硬度和彈性分別達到最大值，與完全空白組(未添加TGase和γ-PGA)相比分別顯著增大(p<0.05)了61.11%、13.10%；添加TGase后，在同一TGase質量分數條件下，隨著γ-PGA質量分數的增大，凝膠硬度和彈性先顯著增大后變化不明顯，但在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時，凝膠硬度和彈性顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，凝膠硬度和彈性先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質量分數為0.12%時，添加0.7%的TGase后反而使凝膠硬度和彈性明顯減小(p<0.05)。在TGase質量分數為0.5%、γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠硬度和彈性分別達到最大值，與完全空白組相比分別提高了4.48倍、1.27倍。研究發現，γ-PGA水溶液在加熱過程中會產生多肽鏈的隨機斷裂[13]，一定質量分數的γ-PGA降解后暴露出的Glu殘基與蛋白質中的Lys殘基之間通過非二硫共價鍵發生交聯[14]，使凝膠硬度和彈性隨著γ-PGA質量分數的增大而增大，添加一定質量分數的TGase后，在TGase催化作用下，蛋白質之間非二硫共價鍵的形成增加，γ-PGA-蛋白質和蛋白質-蛋白質之間的交聯作用增強，形成的三維網絡結構變得更加有序，從而使凝膠硬度和彈性進一步提高，然而當γ-PGA和TGase質量分數過高時，凝膠硬度和彈性增加不明顯甚至減小，這可能是由于底物濃度已經飽和，過高質量分數的γ-PGA和TGase使得γ-PGA-蛋白質、蛋白質-蛋白質之間過度交聯，造成凝膠網絡結構無序化，從而影響凝膠硬度和彈性的提高[15]。將γ-PGA和TGase復合使用后對凝膠硬度和彈性的增強效果明顯大于單獨使用γ-PGA或TGase對凝膠硬度和彈性的增強效果，這說明γ-PGA和TGase之間可能存在協同作用。

2.2 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響如圖2所示。

圖2 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on water holding capacity of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖2可知，在未添加TGase時，隨著γ-PGA質量分數的增大，凝膠保水性呈先增大后減小的趨勢，且在γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠保水性達到最大值，這可能是由于一定質量分數的γ-PGA使體系中的凈電荷增加，靜電斥力也隨之增加，蛋白質分子間的空隙增大，從而使凝膠保水性提高[16]。此外，由于γ-PGA側鏈上大量游離羧基所帶負電荷的排斥作用，使γ-PGA分子鏈的空間伸展很大[17]，即使在較低的濃度條件下，仍然能保持良好的吸水保濕性能，這有利于凝膠保水性的進一步提高。添加TGase后，在同一TGase質量分數條件下，凝膠保水性隨著γ-PGA質量分數的增大先顯著增大后變化不明顯，但在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時，凝膠保水性顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，凝膠保水性先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質量分數為0.12%時，添加0.7%的TGase反而使凝膠保水性顯著減小(p<0.05)。在TGase質量分數為0.5%、γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠保水性達到最大值，與完全空白組相比提高了10.97%。凝膠保水性的增加主要是可移動水的增加，其增加程度受蛋白質內在結構和外在條件的影響，在凝膠制作過程中添加一定質量分數的TGase可以催化蛋白質分子間形成異型肽鍵及致密的網絡結構，加之受熱過程中一定質量分數的γ-PGA降解后與蛋白質之間發生交聯使凝膠孔洞更加細小、均勻，網絡結構更加緊密，從而使更多的水分包埋或被結合在凝膠結構中[18]，然而當γ-PGA和TGase質量分數過高時會造成γ-PGA-蛋白質、蛋白質-蛋白質之間產生過度聚集作用，蛋白質的凝膠網絡結構被嚴重破壞，蛋白質與水分子之間的相互作用減弱，從而對凝膠保水性能產生不利影響[19]。

2.3 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響如圖3所示。

圖3 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響Fig.3 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on whiteness of gelatin from chicken myofibrillar protein

當TGase質量分數為0～0.1%、γ-PGA質量分數小于0.06%時，在同一TGase質量分數條件下，凝膠白度值隨著γ-PGA質量分數的增大變化較小(p>0.05)，然而在γ-PGA質量分數大于0.06%時，隨著γ-PGA質量分數的增大，凝膠白度值逐漸減小(p<0.05)，且在γ-PGA質量分數為0.12%時，凝膠白度值達到最小值，這可能是由于隨著γ-PGA質量分數的增大，第二階段加熱過程中Maillard反應的速度加快[20]，有色物質的生成導致凝膠白度值降低；當TGase質量分數為0.3%～0.7%時，在同一TGase質量分數條件下，凝膠白度值隨著γ-PGA質量分數的增大先明顯減小后變化不明顯。在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，凝膠白度值先逐漸減小后變化不明顯。在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時，凝膠白度值最小，但與完全空白組相比僅降低了2.51%。造成凝膠白度值下降的原因可能是由于添加TGase和γ-PGA后，γ-PGA-蛋白質以及蛋白質分子間發生共價交聯，蛋白質的凝膠網絡結構變得更加緊密，降低了凝膠L*值，所以蛋白凝膠白度值降低[21]，這可能也與TGase本身的黃褐色使凝膠顏色加深有關。此外，凝膠白度值的變化與保水性也有一定的關系[22]，一定質量分數的γ-PGA和TGase使凝膠保水性增加，凝膠樣品表面的游離水減少，從而降低了與白度值正相關的L*值。

2.4 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠化學作用力的影響

肌肉蛋白質熱誘導凝膠形成的過程實際上是肌原纖維蛋白變性聚集的過程，在這個過程中，離子鍵、疏水相互作用、氫鍵和二硫鍵等化學作用力共同作用促使蛋白質的凝膠結構發生變化[23]，而凝膠結構的改變最終會對蛋白質的凝膠特性產生重要影響。

2.4.1 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵、氫鍵和疏水相互作用的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵、氫鍵和疏水相互作用的影響如圖4所示。

圖4 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵(a)、氫鍵(b)和疏水相互作用(c)的影響Fig.4 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on ionic bonds, hydrogen bonds and hydrophobic interactions of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖4可知，在未添加TGase時，離子鍵和氫鍵隨著γ-PGA質量分數的增大呈先增大后減小的趨勢，且在γ-PGA質量分數為0.06%時分別達到最大值，疏水相互作用隨著γ-PGA質量分數的增大呈先增大后減小的趨勢；添加TGase后，在同一TGase質量分數條件下，離子鍵和氫鍵隨著γ-PGA質量分數的增大逐漸減小，而疏水相互作用隨著γ-PGA質量分數的增大先顯著增大后變化不明顯，這可能是由于γ-PGA側鏈上存在的大量活性較高的游離羧基與蛋白質的親水基團發生競爭，從而使蛋白質分子間的疏水相互作用增強，但在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時，疏水相互作用顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，離子鍵和氫鍵逐漸減小，這可能是由于在TGase的催化作用下，蛋白質的空間結構發生變化，活性基團被大量包埋或參與非二硫共價鍵的形成[24]，導致離子鍵和氫鍵逐漸減小，而疏水相互作用隨著TGase質量分數的增大先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質量分數為0.12%、TGase質量分數為0.7%時疏水相互作用反而明顯減小(p<0.05)。TGase能夠催化蛋白質中Lys殘基的ε-氨基與Glu的γ-酰胺基之間形成ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵，促進蛋白質分子間或分子內發生共價交聯[25]，隨著TGase質量分數的增大，交聯作用逐漸增強，更多的親水基團被包埋在致密的凝膠網絡結構中，從而使疏水相互作用逐漸增大，然而當γ-PGA和TGase質量分數過高時，疏水相互作用增加不明顯甚至有所減小，這可能是由于底物濃度已經飽和，過高質量分數的γ-PGA和TGase使得γ-PGA-蛋白質、蛋白質-蛋白質之間過度交聯，導致凝膠網絡結構變得無序，此時疏水相互作用已不能再改善蛋白質的凝膠特性[26]。

FOEGEDING等[27]認為，疏水相互作用在蛋白質凝膠形成過程中起關鍵作用，適宜的疏水相互作用能減少肉糜體系中的熵值，促進蛋白質之間的聚集和交聯，從而促使其形成穩定的凝膠網絡結構，但過強的疏水相互作用反而會導致凝膠脫水收縮，使凝膠強度降低，這與本文的研究結論相似。通過與圖1比較可知，疏水相互作用是維持蛋白質凝膠三維結構穩定性的主要化學作用力，而離子鍵和氫鍵對維持蛋白質凝膠三維結構的穩定貢獻不大。

2.4.2 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基與總巰基的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基和總巰基的影響如圖5所示。

圖5 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基(a)和總巰基(b)的影響Fig.5 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on active sulfhydryl(a) and total sulfhydryl(b) of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖5-(a)可知，在同一TGase質量分數條件下，活性巰基含量隨著γ-PGA質量分數的增大顯著增大(p<0.05)，這可能是由于γ-PGA側鏈上大量活性較高的游離羧基使包埋在疏水基團內部的巰基暴露出來，在γ-PGA質量分數大于0.06%以后，隨著γ-PGA質量分數的增大，活性巰基含量變化不明顯(p>0.05)。在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，活性巰基含量先顯著減小后變化不明顯，特別是TGase質量分數小于0.06%時，活性巰基含量減小的幅度更大，這可能是因為在TGase的催化作用下，γ-PGA-蛋白質、蛋白質-蛋白質之間交聯作用加強，在形成更加致密的凝膠三維結構的過程中包埋了較多的活性巰基，從而使活性巰基含量隨著TGase質量分數的增大逐漸減小。由圖5-(b)可知，γ-PGA復合TGase對蛋白質凝膠總巰基含量的影響較小，這說明γ-PGA和TGase對二硫鍵的形成影響也較小。有研究表明[28-31]，二硫鍵的形成主要受加熱方式和加熱程度的影響。

2.4.3 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響

含有SDS、尿素和β-疏基乙醇的Tris-HCl緩沖溶液可以斷裂肌原纖維蛋白凝膠中除ε-(γ-Glu)-Lys以外的其他化學鍵[32]。因此，蛋白質凝膠中ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵的多少可以根據其在上述試劑中溶解度的高低來判斷。γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響如圖6所示。

由圖6可知，在未添加TGase時，凝膠溶解度隨著γ-PGA質量分數的增大呈先減小后增大的趨勢，且在γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠溶解度較低；添加TGase后，在同一TGase質量分數條件下，隨著γ-PGA質量分數的增大，凝膠溶解度呈明顯的下降趨勢，且在γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠溶解度較低，隨著γ-PGA質量分數的進一步增大，凝膠溶解度變化不明顯，但在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時，凝膠溶解度有所增大(p<0.05)。

圖6 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響Fig.6 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on solubility of gelatin from chicken myofibrillar protein

在同一γ-PGA質量分數條件下，隨著TGase質量分數的增大，凝膠溶解度先減小后變化不明顯，但在γ-PGA質量分數為0.12%時，添加0.7%的TGase后反而使凝膠溶解度明顯增大(p<0.05)。在TGase質量分數為0.5%、γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠溶解度較低，說明凝膠中非二硫共價鍵的形成量較高，這與圖1的結果基本一致，說明非二硫共價鍵也是維持凝膠三維結構穩定性的主要化學作用力。γ-PGA復合TGase對蛋白質凝膠溶解度的影響可能是由于在熱誘導凝膠形成的過程中，γ-PGA受熱降解暴露出的Glu殘基與蛋白質中的Lys殘基交聯形成ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵[14]，或在TGase的催化作用下，蛋白質分子間或分子內交聯形成ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵[33]，當γ-PGA質量分數和TGase質量分數在一定范圍內增大時，形成的ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵也就越多，蛋白質的凝膠特性也就越好，然而當γ-PGA和TGase質量分數較高時，非二硫共價鍵增加趨勢變緩甚至有所減小，從而影響蛋白質凝膠特性的進一步提高。因此，γ-PGA和TGase只有在配比合理的情況下才能最大程度的發揮協同作用，從而極大的改善蛋白質的凝膠特性。

2.5 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響

γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響如圖7所示。

M-標準蛋白；C-未添加γ-PGA也未添加TGase的蛋白樣品；MHC-肌球蛋白重鏈；Actin-肌動蛋白圖7 γ-PGA復合TGase對雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響Fig.7 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on the SDS-PAGE pattern of chicken myofibrillar protein

從圖7-(a)中可以看出，與末添加γ-PGA的蛋白樣品相比，加入γ-PGA后的蛋白樣品其肌球蛋白重鏈(MHC)條帶和肌動蛋白(Actin)條帶都明顯減弱。隨著γ-PGA質量分數的增大，MHC條帶和Actin條帶都逐漸減弱，這可能是由于在蛋白質中少量的TGase的催化作用下，γ-PGA降解后產生的Glu殘基與蛋白質中的Lys殘基發生交聯反應、形成大分子物質，然而當γ-PGA質量分數進一步增大時，此時底物濃度已經飽和，MHC條帶和Actin條帶并未隨著γ-PGA質量分數的進一步增大而繼續減弱。在含有γ-PGA的蛋白樣品中加入0.5%的TGase后，如圖7-(b)所示，隨著γ-PGA質量分數的增大，MHC條帶和Actin條帶都逐漸減弱，且在γ-PGA質量分數增大至0.06%后MHC條帶和Actin條帶變化都不明顯，這與圖1的結果一致。從圖7-(c)中可以看出，MHC條帶隨著TGase質量分數的增大逐漸減弱，這是由于TGase催化MHC之間通過ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵發生交聯并形成了大分子物質[34]，但當TGase質量分數進一步增大時，MHC條帶并未發生明顯變化，在整個過程中Actin條帶也未發生明顯變化，說明Actin沒有參與TGase催化的交聯作用。在含有TGase的蛋白樣品中加入0.06%的γ-PGA后，如圖7-(d)所示，與未添加γ-PGA也未添加TGase的蛋白樣品相比，MHC條帶和Actin條帶都明顯減弱。隨著TGase質量分數的增大，MHC條帶逐漸減弱，而Actin條帶并未發生明顯變化。從圖7-(b)和圖7-(d)中可以看出，將γ-PGA和TGase復合使用后MHC條帶的減弱程度明顯大于單獨使用γ-PGA或TGase對MHC條帶的減弱程度，這說明γ-PGA和TGase復合使用時能夠最大限度地增強蛋白質的交聯程度，進而改善蛋白質的凝膠特性。此外，從圖7-(a)、圖7-(b)、圖7-(d)中可以看出，在凝膠頂部存在著一些顏色很深的條帶，這可能是由于γ-PGA的分子量很高，其在高溫條件下降解后產生了一些分子質量超過200 kDa的高分子物質[35]，這些物質在進行凝膠電泳時無法進入到濃縮膠和分離膠中，從而聚積在凝膠頂部。

3 結論

γ-PGA和TGase之間存在協同作用，將γ-PGA和TGase復合使用后對雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的改善效果明顯優于單獨使用γ-PGA或TGase對凝膠特性的改善效果，且在TGase質量分數為0.5%、γ-PGA質量分數為0.06%時，凝膠硬度、彈性和保水性都達到最大值；在TGase質量分數為0.7%、γ-PGA質量分數為0.12%時凝膠白度值最小?；瘜W作用力分析表明，經γ-PGA和TGase處理后，疏水相互作用和非二硫共價鍵是構成凝膠三維結構的主要作用力，離子鍵、氫鍵和二硫鍵是次要作用力，二硫鍵主要形成于加熱過程中。SDS-PAGE凝膠電泳圖譜結果表明，TGase能夠催化γ-PGA-蛋白質和蛋白質-蛋白質之間通過ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵發生交聯反應并形成大分子物質，使肌原纖維蛋白凝膠三維網絡結構變得更加致密。

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