秘魯魷魚骨粉添加對醬油制曲的影響

詹超群，鄧尚貴，霍健聰，修策，金凱楠

(浙江海洋大學 食品與醫藥學院，浙江 舟山，316000)

目前我國對魷魚加工副產物的研究利用已取得豐碩成果，如魷魚皮制取膠原蛋白、內臟用于生產活性蛋白肽、魷魚眼提取透明質酸等[1-2]，但唯獨對魷魚骨的加工利用到目前為止基本處于一片空白。

制曲是釀造高品質醬油的關鍵，曲以大豆為主要培養基原料，含有多種微生物及生物酶，通過降解培養基中的各種蛋白質、碳水化合物，進而締造氨基酸、肽和葡萄糖等多種醬油風味前體物質[3-5]。目前研究多集中于菌種復配對醬油制曲及風味的影響，及制曲工藝條件研究，而對醬油曲成分對醬油制曲風味影響的研究成果寥寥無幾。

魷魚骨是當前魷魚加工產業中尚未得到充分利用的一類加工副產物。前期研究發現：魷魚骨中含有大量蛋白質和豐富的呈味氨基酸，是一類極具開發潛力的蛋白質資源?；谶@一狀況，本研究以魷魚骨為研究對象，將其添加到制曲原料中，探討其對醬油曲風味的影響。本研究不僅有望為海鮮醬油的釀造提供一種風味優良的種曲，而且符合當前水產品加工副產物高質化利用方向。

1 材料與方法

1.1 材料

魷魚骨粉，魷魚骨由浙江興業集團有限公司提供，為秘魯魷魚骨，曬干后(水分含量5.24%)采用粉碎機粉碎至120目篩；醬油種曲購自上海佳民釀造食品有限公司，為蛋白酶和淀粉酶活性較高的中科3.951(即滬釀3.042)米曲霉孢子；魯氏酵母為實驗室自備(提前配制成108個/mL的菌懸液)；其余原料如大豆、面粉等均為市售。

試驗用甲醛、鹽酸、福林試劑，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司，分析純；乙腈，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司，色譜純。

1.2 主要設備及型號

紫外分光光度計(U-2800)，日本回立公司；固相微萃取設備(SUPELCO，57330-U)，美國Supelco公司；萃取頭(100 μm PDMS，聚二甲基硅氧烷)，上海洽姆儀器科技有限公司；氣質聯用設備(安捷倫7890B)，美國安捷倫公司；其余均為實驗室常用設備。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬油曲制備

參考舟山裕大釀造有限公司醬油曲制備工藝：優質黃豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡10 h,100 ℃蒸汽滅菌處理20 min，處理后的黃豆冷水沖淋至40 ℃后瀝干，并拌入300 g面粉，攪拌均勻后加入1.95 g種曲(即原料質量的0.15%)和10 mL魯氏酵母菌懸液，同時分別加入0.5%(A組)、1.3%(B組)和2.0%(C組)的魷魚骨粉(以不加入魷魚骨粉為對照)。醬油曲制備好后進行后期培養，33 ℃培養12 h，然后翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培養溫度降至28 ℃，繼續培養36 h后制曲結束。

1.3.2 醬油曲酵母總數、孢子數量及質量評定

孢子及酵母菌數的測定分別參考SB/T 10315—1999和GB 4789.15—2010；同時觀察不同時間醬油曲的外形色澤品質。

1.3.3 相關酶活力的測定

蛋白酶活力測定參照GB/T 23527—2009，即40 ℃下水解酪蛋白每分鐘生成1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個蛋白酶活力單位；α-淀粉酶活力測定參照CHUTMANOP的方法，酶解條件為40 ℃、pH 7.2，以可溶性淀粉為底物、30 min液化10 mg可溶性淀粉所需的酶量為1個酶活力單位；糖化酶活力測定采用國標法GB/T 8276—2006，在40 ℃、pH 4.6條件下，1 h分解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖為1個酶活力單位。

1.3.4 固形物含量測定

固定物含量測定采用105 ℃烘箱法干燥至衡重，根據前后重量變化確定固形物含量。

1.3.5 揮發性風味物質鑒定

參考馮笑軍[6]的方法，略有變動。具體操作為：稱取10 g樣品置于100 mL螺口瓶中，加入24 mL蒸餾水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力攪拌器上60 ℃攪拌處理15 min，用DVB/CAR/PDMS(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭吸附60 min，而后插入氣相色譜進樣，解析5 min。色譜柱采用安捷倫毛細柱，升溫速度2 ℃/min，到90 ℃后保溫5 min；而后升溫速度調至8 ℃/min，到250 ℃后保溫1 min；載氣為氦氣，流量1.0 mL/min；質譜條件為電子能力80 eV，電壓350 V，離子源溫度240 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z50～450。測定完畢后進行定性定量鑒定，其中定量鑒定采用面積歸一化法，定量鑒定參考風味物質數據庫。

1.3.6 數據處理

用SPSS 13.0對數據進行分析。利用ANOVA方差分析軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 制曲過程中種曲孢子及酵母菌數量的變化

制曲過程中酵母綜述和孢子數的變化如圖1和圖2所示。由圖1可知，對照和各處理組在制曲的4～20 h階段酵母總數均呈上升趨勢，在20～36 h階段酵母總數則呈下降趨勢，對照組和各處理組在20 h時出現最大值；各處理組在制曲過程中均顯著高于對照組(p<0.05，除4 h外)。孢子在酵母發酵后期產生，從圖2可以看出，36 h時兩組孢子數均達到8.5×108以上，在相同制曲時間下總體來看同對照組間除個別組外無顯著性差異(p>0.05)。

圖1 制曲過程中酵母總數變化Fig.1 The changes of the total number of yeast in koji-making圖中不同小寫字母標識處理間差異顯著(p<0.05)，下同。

圖2 制曲過程中孢子總數變化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

2.2 制曲過程中發酵曲外形色澤變化

圖3是制曲過程中不同發酵時間種曲的外觀形態變化。

圖3 制曲過程中不同發酵時間種曲外觀形態變化(B組)Fig.3 Morphologicalchanges of soy sauce koji during different fermentation time (B group)

從圖3可以看出，發酵16 h，醬油曲外觀附著白灰色菌絲體，淡黃色孢子數量很少，外觀僅能看出略微呈黃色，曲料松散，有獨特的曲香味；到24 h時，曲料表面菌絲體明顯增多，外觀蓬松，外觀呈較為明顯的黃綠色，無不良氣味；當發酵時間為36 h時，曲料外觀成形度差，呈明顯黃色，曲料蓬松，曲香味明顯，同對照比香味明顯不同。

2.3 制曲過程中主要酶系活力的變化

蛋白酶是醬油曲質量的重要評價指標[7]，制曲過程中米曲霉分泌的蛋白酶可以降解大豆蛋白，產生氨基酸、多肽等多種風味物質，為醬油的良好風味做出重要貢獻。滬釀3.042米曲霉是一種發酵特性較好的曲霉，發酵過程中會產生酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。由圖4可知，在制曲28～36 h間，各處理組同對照之間存在顯著性差異(p<0.05)，表明添加魷魚骨粉對醬油曲酶活力有一定促進效應，但各添加劑量間酶活力效應不同，其中B和C組間無顯著性差異(p>0.05)。

圖4 發酵過程中蛋白酶活力變化Fig.4 Protease activity changes during fermentation

醬油中的單糖、雙糖及簡單多糖含量對于增加醬油的黏稠度、提高醬油的掛杯性以及為美拉德反應提供原料至關重要，決定單糖、雙糖等碳水化合物含量的酶是淀粉酶(α-淀粉酶和糖化酶)[9-11]。從圖5和圖6可以看出，各處理組除24 h外，其余時間α-淀粉酶和糖化酶活力均高于對照組，表明添加適量魷魚骨粉對米曲霉產生淀粉酶的活力有促進作用。

圖5 發酵過程中α-淀粉酶活力變化Fig.5 Changes of α-amylase activity during fermentatio

前期研究發現，魷魚骨蛋白質含量較高，含有較多的碳水化合物，尤其是氨基酸含量高達82.86 g/100g，明顯高于海螵蛸，且魷魚骨的氨基酸評分最接近FAO/WHO氨基酸標準模式，蛋白質質量較高。魷魚骨中豐富的碳源和氮源可能是促進米曲霉生長，進而合成更多高活性淀粉酶的原因。

圖6 發酵過程中糖化酶活力變化Fig.6 Changes of glucoamylase activity during fermentation

2.4 固形物含量

制曲是給微生物提供碳源、氮源等營養物質，促使微生物菌體數量大幅增殖的過程，隨著微生物數量的增長，培養基中的營養物質被消耗后變成CO2和水散失，培養基質量減輕，因而固形物含量能在一定程度上作為衡量制曲的指標[8]。從圖7可以看出，隨著制曲時間的延長，對照組與實驗組的固形物含量均呈上升趨勢，其中添加了魷魚骨粉的實驗組在相同時間下固形物含量均低于對照組，表明各實驗組中的酵母生長繁殖消耗了大量營養物質，但不同實驗組間存在差異，其中B和C組在培養至36 h時固定物含量基本相同(60.8%和60.1%)，無顯著性差異。

圖7 制曲過程中固形物含量的變化Fig.7 Changes of solids content during fermentation

2.5 醬油曲中揮發性風味物質分析

采用GC-MS對實驗組和對照組成曲的揮發性香氣成分進行檢測，結果見表1。從揮發性成分種類上來看，對照組和實驗組檢出的揮發性成分基本相同(除C組含有少量甲基吡嗪外)，包括5種醇類、8種酯類、4種酸類、4種醛類、2種酚類及其他成分5種，表明添加魷魚骨對醬油曲揮發性香氣物質的成分沒有任何影響；從揮發性成分的含量上來看，對照組中除乙醇、乙酸、苯乙酸、庚醛和苯乙醛含量高于實驗組外，其余成分含量均低于實驗組?？傮w來看，B組的揮發性成分含量達到36.31%，高于對照組3.58%，也高于A組和C組，且不同實驗組的揮發性成分含量也各不相同，同添加量并無相關性，其中原因有待進一步研究。

表1 揮發性風味物質成分的GC-MS分析結果

注：“—”表示未檢出。

3 結論

添加適量魷魚骨粉對米曲霉生長和相關酶系分泌無顯著性影響，其中實驗組的酵母數量顯著高于對照組，但孢子數僅略高于對照組；魷魚骨添加量為1.3%的醬油曲在培養36h時，曲料色澤發黃，香氣明顯，質量較好；添加魷魚骨對醬油曲料中微生物各種酶系的分泌有促進效果，其中蛋白酶和淀粉酶活性都顯著高于對照組；添加魷魚骨對醬油曲料的揮發性香氣成分種類沒有影響，且大部分揮發性成分含量均有不同程度上升，其中B組的揮發性成分達到36.31%，顯著高于對照組的32.73%，表明添加魷魚骨對于醬油曲的發酵和品質提升具有促進效果。

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