浸提對甜橙果皮中黃烷酮和多甲氧基黃酮的影響及其抗氧化活性研究

聶超，趙梓燕，劉珞憶，董昕穎，周志欽,2*

1(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715) 2(西南大學 南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶，400715)

甜橙(CitrussinensisOsbeck)是柑橘重要的栽培類型之一，味道甜美多汁。既適于鮮食，又可用于生產橙汁。甜橙加工后，產生大量皮渣等副產物，造成資源的浪費[1-2]。國內外研究表明，甜橙果皮中富含具有抗氧化、抗炎、抗衰老等功能的黃酮類物質，對慢性疾病的防治有一定功效[3-5]。黃烷酮(flavanones，FLAs)和多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones，PMFs)是甜橙果皮中主要的黃酮類物質。其中PMFs是一類高度甲氧化的黃酮類化合物，幾乎僅存在于柑橘屬水果中[6]，因其易于吸收，且活性高于一般黃酮，所以受到人們的廣泛關注[7]。

黃酮類物質的提取主要有溶劑浸提、超聲波、微波、超臨界提取等方法[8]。其中溶劑浸提法操作簡單，廣泛用于工業化提取[9]。在優化提取方法上，前人的研究大多根據比色法測定總黃酮含量，以此來優化提取條件[10]。比色法測定黃酮存在有一定的缺陷，不能精確反映具體物質的變化。朱攀攀[11]等利用高效液相色譜法(HPLC)，研究了不同超聲參數對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷的影響。但針對柑橘多甲氧基黃酮提取的研究鮮有報道。

大孔樹脂吸附、溶劑萃取、水沉法等富集純化方法，常用于黃酮物質的精制，能夠有效除去糖酸、蛋白質等水溶性雜質[12]。水沉法具有收率高，工藝簡便，成本較低等優點，因此更適于實際生產[13]。吳婉瑩[14]等對比采用水沉法與大孔樹脂法桑葉總黃酮，發現兩種方法精制后的產物純度沒有明顯差異。目前，關于水沉法精制柑橘黃酮的研究報道較少。

本實驗研究浸提參數對甜橙果皮中黃烷酮與多甲氧基黃酮的影響，針對不同極性的黃酮類物質，確定最佳提取條件。利用水沉法精制粗提取物，研究精制后提取物對DPPH、ABTS等自由基的清除作用。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

甜橙于2016年12月中下旬采自重慶市國家果樹種質資源柑橘圃(National Citrus Germplasm Repository, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing, China)。洗凈,晾干，削皮，果皮于50 ℃烘箱烘干，經粉碎機粉碎后過80目篩子，置于干燥器中備用。

標準品蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素，購于美國Sigma公司。甲醇(色譜純),購于美國Sigma公司;甲酸(色譜純),購于美國Fisher公司;無水乙醇(分析純)，購于成都市科龍試劑廠。

1.2 主要儀器和設備

密理博Milli-Q Advantange A10超純水系統,美國密理博(Millipore)公司;電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9240A),上海齊欣科學儀器有限公司;高效液相色譜儀(Waters e2695)、光電二極管陣列檢測器(Waters 2998),美國Waters公司;電子天平(Sartorius BSA224S，感量0.1 mg，Max 220 g),賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;水浴恒溫振蕩器(SHA-C),金壇市宏業實驗儀器廠;EYEL4 FDU-2000小型冷凍干燥機，旋轉蒸發儀,日本東京理化器械株式會社。

2 實驗方法

2.1 黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件

采用高效液相色譜法測定黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量。參考張元梅[15]等方法，色譜柱：Sunfire-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A(0.1% 甲酸超純水)和B(甲醇)，采用梯度洗脫，洗脫程序為：(1)0～20 min，37%～50% B；(2)20～35 min，50%～80% B；(3)35～40 min，80%～100% B；(4)40～50 min，100% B；(5)50～60 min，37% B，流速：0.7 mL/min。在特定波長范圍內對3種黃烷酮類(蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷)，3種多甲氧基黃酮(甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素)進行檢測。其中黃烷酮的檢測波長為283 nm，多甲氧基黃酮的檢測波長為330 nm。

2.1.2 標準品溶液配制

精確稱取各標準品物質10.0 mg，甲醇定容至10.0 mL，得濃度為1 mg/mL的母液。將母液稀釋成不同濃度，按照上述HPLC條件分別進樣，以峰面積為縱坐標，標準品溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.1.3 提取液中黃酮含量測定

取甜橙果皮黃酮提取液，經0.22 μm濾頭過濾，濾液裝入棕色進樣瓶，按照2.1.1所述方法測定。采用單標法對其進行定性，根據標準曲線進行定量分析。

2.2 不同條件下提取甜橙果皮中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量

稱取5.0 g的甜橙果皮粉末，分別考察溶劑體積分數、浸提溫度、浸提時間、料液比對提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮含量影響。(1)溶劑體積分數，選擇60%、70%、80%、90%、100%的乙醇。在料液比為1∶20，90 ℃下加熱回流浸提4 h；料液比為1∶10，60 ℃下加熱回流浸提2 h。(2)浸提溫度，設置電加熱套溫度60、70、80、90、100、110 ℃。以70%乙醇為溶劑，在料液比為1∶20下加熱回流浸提4 h；80%乙醇為溶劑，在料液比為1∶10下加熱回流浸提2 h。(3)浸提時間。料液比為1∶20，在90 ℃下以70%乙醇加熱回流浸提0.5、1、2、3、4、5 h；料液比為1∶10，在60 ℃下以80%乙醇加熱回流浸提0.5、1、2、3、4、5 h。測定提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量(4)料液比。以1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40為料液比，在90 ℃下，70%乙醇加熱回流浸提4 h；60 ℃下，80%乙醇加熱回流浸提2 h。測定提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量。

2.3 甜橙果皮總黃酮提取物的精制

水沉法是中藥生產中常用精制工藝，按照2.2所得出的最優條件提取甜橙果皮中的總黃酮，將提取液冷卻后過濾。參照陳華麗[13]等方法，稍作修改，在45 ℃減壓濃縮濾液，按照浸膏∶水=1∶4(g∶mL)加水沉淀，4 ℃靜置2 h，5 000 r/min離心10 min，將沉淀進行真空冷凍干燥。采用HPLC測定精制前后黃酮組成與含量，方法參照2.1，使用標準曲線法進行定量，各峰對應的黃酮物質含量相加即為總黃酮含量，同時考察水洗次數對總黃酮純度和保留率的影響。具體計算公式如下：

(1)

(2)

2.4 甜橙果皮總黃酮提取物的體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參考GORINSTEIN等[16]的方法，稍做修改。準確稱取0.019 7 g DPPH標準品，甲醇定容至500 mL，標準品濃度為0.1 mmol/L。取0.1 mL待測樣液加到3.9 mL DPPH溶液中，振蕩均勻后避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值。不同濃度提取物的抗氧化能力采用DPPH消除率表示，具體計算公式如下：

(3)

其中：A0，0.1 mL乙醇加到DPPH標準液的吸光值；A測，0.1 mL樣品溶液和DPPH標準液混合的吸光值。

2.4.2 ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除能力測定參照ALMEIDA等[17]的方法，稍作修改。分別配制140 mmol/L過硫酸鉀溶液和7 mmol/L ABTS+溶液待用，取176 μL過硫酸鉀溶液與10 mL ABTS+溶液混合均勻后避光反應12～16 h。將混合液用乙醇稀釋到吸光值為(0.7±0.002)，即為ABTS工作液。取0.1 mL待測樣品液加到3.9 mL ABTS溶液中，搖勻后反應10 min，于734 nm處測定吸光值。樣品溶液的抗氧化能力采用ABTS自由基消除率表示，具體計算公式如下：

(4)

其中:A0，0.1 mL乙醇加到ABTS標準液的吸光值；A測，0.1 mL樣品溶液和ABTS標準液混合的吸光值。

2.5 統計分析

采用Excel和SPSS 19軟件對數據進行統計分析，采用Origin 8作圖，試驗重復3次，以“均值±標準差”表示。

3 結果與分析

3.1 黃酮標準品HPLC分析與標準曲線繪制

6種主要類黃酮標準品回歸方程、相關系數如表1所示。本方法測定的蕓香柚皮苷、橙皮苷等標準品濃度與峰面積呈良好線性關系，符合定量要求。

表1 黃酮物質標準品回歸方程、相關系數、線性范圍

3.2 不同提取條件下甜橙果皮黃酮含量變化

研究了不同提取條件下黃酮含量變化，結果表明,甜橙果皮中黃酮主要分為黃烷酮和多甲氧基黃酮，且黃烷酮的含量遠高于多甲氧基黃酮，其中橙皮苷是含量最高的黃烷酮，這與WANG[18]等研究結果一致。在不同提取條件下，總黃酮的含量為(8.74±0.26)～(24.04±0.75) mg/g，與LIU[19]等研究結果相似。

3.2.1 不同體積分數乙醇提取對甜橙果皮中黃酮類物質含量的影響

不同體積分數乙醇提取，所得提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量變化如圖1所示。隨著乙醇體積分數的增加，黃烷酮和多甲氧基黃酮的變化規律略有差異。對于黃烷酮，橙皮苷和香蜂草苷的含量最大值出現在乙醇體積分數為70%時，而蕓香柚皮苷含量最大值出現在乙醇體積分數為60%時。進一步提高乙醇體積分數，3種黃烷酮含量均出現明顯的下降。YANG[20]等在研究黃烷酮提取時發現，存在一個最佳乙醇體積分數，進一步增加乙醇體積分數會導致提取效率下降。這可能是高體積分數的乙醇極性偏小，不適用于黃烷酮的提取[21]。

隨著乙醇體積分數的變化，3種多甲氧基黃酮含量的變化趨勢相似，呈先增加后降低最后趨于平穩的趨勢。在80%體積分數乙醇提取下，3種多甲氧基黃酮含量均達到最大值。其中，甜橙黃酮的含量從(0.60±0.04) mg/g增加到(0.87±0.01) mg/g。隨著乙醇體積分數的增加，多甲氧基黃酮的含量開始降低并趨于平穩。LIBRN[22]等發現，在85%的乙醇體積分數提取下，多甲氧基黃酮含量最高，這與我們研究結果相似。由于多甲氧基黃酮極性偏小，根據相似相溶原理，高體積分數乙醇有利于多甲氧基黃酮提取。進一步提高乙醇體積分數，極性開始改變，導致提取效率下降。也有學者認為，高體積分數的乙醇可能破壞細胞壁性質，使得酚類物質不易溶出，同時對酚類物質的轉移也有一定影響[23]。

綜上所述，我們認為，乙醇體積分數為70%時，黃烷酮和總黃酮得率最高，乙醇體積分數為80%時，有利于多甲氧基黃酮。

圖1 不同乙醇濃度對對果皮中黃酮類物質含量的影響Fig.1 Effect of water content in ethanol on the yield of flavonoids

3.2.2 不同浸提溫度對甜橙果皮中黃酮類物質含量的影響

溫度對果皮中黃酮類物質含量的影響如圖2所示。由圖2可知，黃烷酮的含量變化規律大致相同，呈先增加后降低的趨勢。溫度從60 ℃增加到90 ℃，蕓香柚皮苷、橙皮苷和香蜂草苷等含量迅速增高，這與朱攀攀[11]等研究結果一致。隨著溫度升高，溶劑分子運動加速，有利于黃酮類物質提取[24]。其中橙皮苷的含量從(6.46±0.53) mg/g提高到(15.22±1.28) mg/g，增加了1倍多。當浸提溫度超過90 ℃后，黃烷酮的含量開始下降。這可能是由于溫度升高，破壞了黃酮化合物的結構[25]。

多甲氧基黃酮的含量隨溫度的變化與黃烷酮的變化明顯不同，提取溫度從60 ℃升高到110 ℃，多甲氧基黃酮含量無明顯變化。M’HIRI[26]等在提取多甲氧基黃酮時發現，隨著溫度的增加，其含量無明顯變化。KO[27]等的研究證明，在較高溫度時，多甲氧基黃酮類物質具有良好的穩定性，能夠保持較高的提取率，但其糖苷類物質卻開始降解。我們推測，相較于黃烷酮，多甲氧基黃酮在高溫下更加穩定。

由黃烷酮和多甲氧基黃酮的變化趨勢可以看出，提取溫度為90 ℃黃烷酮和總黃酮等物質提取量最高，而溫度為60 ℃就可以較好地提取多甲氧基黃酮。

圖2 不同浸提溫度對對果皮中黃酮類物質含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the flavonoids yield

3.2.3 浸提時間對甜橙果皮中黃酮類物質含量的影響

黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量隨提取時間的變化規律由圖3所示。由圖3可知，提取時間從0.5 h增加到4 h，蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量均明顯上升，4 h時達到最大值分別為：(1.11±0.08)、(18.10±0.75) mg/g。當提取時間超過4 h后，含量開始下降。香蜂草苷最大值出現在2 h，隨后含量開始下降。時間[28]是影響黃酮提取的重要因素，CHEIGH[24]等在研究橙皮苷和蕓香柚皮苷提取時發現，時間對提取含量的影響主要與溶解性和熱穩定性有關，提取時間太短不利于物質的溶解，提取時間太長容易造成黃烷酮的降解。

多甲氧基黃酮含量隨著提取時間的變化規律不同。其中甜橙黃酮的變化趨勢與黃烷酮相似，隨著提取時間的增加呈先上升后下降趨勢，最大值出現在2 h，和香蜂草苷相同。但川陳皮素和橘皮素的變化規律與甜橙黃酮不同，其含量隨時間的增加先增加后趨于平穩，沒有出現下降的趨勢，最大值均出現在1 h，較早于甜橙黃酮。XU[29]等也發現川陳皮素、甜橙黃酮等含量隨著提取時間的增加并沒有發生下降的現象，這可能與其結構有關[30]。同時相較于黃烷酮，多甲氧基黃酮類物質更易提取[27]，所需時間較短。

溶劑浸提法最大缺點就是時間太長，從多甲氧基黃酮提取來看，提取時間為1～2 h，即可獲得較高含量。而黃烷酮和總黃酮的提取時間需要4 h才能達到最大值。

圖3 浸提時間對果皮中黃酮類物質含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids yield

3.2.4 料液比對甜橙果皮中黃酮類物質含量的影響

液料比是影響提取的關鍵因素之一，合適的料液比可以促進物質的溶解，增加提取效率。由圖4可知，黃烷酮和多甲氧基黃酮的產量都隨料液比的提高呈先增加后降低趨勢。橙皮苷和香蜂草苷在料液比為1∶20時含量達到最高，蕓香柚皮苷含量的最大值出現在料液比為1∶10，而后隨著料液比的增加，含量開始下降。同時我們發現，在料液比從1∶5提高到1∶20時，橙皮苷的含量顯著增加，這與許鷺[31]等研究相同，增加料液比利于黃酮物質的提取。

多甲氧基黃酮的含量變化規律相似，呈先增加后降低趨勢。與黃烷酮不同的是，甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素3種多甲氧基黃酮均在料液比為1∶10時含量達到最高。李成平[33]等發現料液比為1∶15時多甲氧基黃酮得率較高，這與我們的研究結果相近。

在料液比為1∶10時多甲氧基黃酮含量即可達到最高值，而黃烷酮和總黃酮的最大值則出現在料液比為1∶20時，我們推測是由于多甲氧基黃酮相較于黃烷酮較易溶出所致。隨著料液比繼續增加，黃酮的提取效率開始下降，這可能是料液比的提高，其他物質如多糖和蛋白質的溶解性提高，阻礙了黃酮的溶解，不利于提取[32]。

圖4 不同料液比對果皮中黃酮類物質含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the flavonoids yield

3.3 甜橙果皮總黃酮提取物的精制

甜橙果皮粗提取物中含有大量的糖、有機酸、色素等物質以及一些油脂類雜質，致使樣品不易凍干，且容易吸潮。如圖5所示，水沉法可以有效等除去糖、酸等雜質。水沉次數對精制效果的影響如表2所示，綜合考慮純度、保留率以及用水量，選擇水沉兩次為宜。精制后提取物中總黃酮純度從12.34%提高到42.05%。李春美[34]等利用AB-8大孔樹脂分離純化柚皮黃酮，產物純度為39.67%，蘆柑總黃酮經大孔樹脂純化后，純度可達63.1%[35]。本實驗得到的提取物純度介于兩者之間，且方法簡便快捷，易于操作。

A-標準品；B-精制前；C-精制后；1-蕓香柚皮苷； 2-橙皮苷：3-香蜂草苷；4-甜橙黃酮；5-川陳皮素；6-橘皮素圖5 六種標準品和精制前后總黃酮提取物的HPLC圖譜Fig.5 The HPLC spectra of six standards and extracts of total flavonoids before and after purification

表2 水沉次數對精制效果的影響

Table 2 Effect of different times of water precipitation on the results

水沉次數總黃酮/(mg·g-1)純度/%保留率/%1387.23±4.52a38.72b83.64a2420.57±8.46b42.05a81.73b3433.32±12.37c43.33a78.18c

注:表2結果表示為3次測定的平均值±標準差;同一列不同小寫字母表示在0.05顯著性水平上差異顯著。

3.4 甜橙果皮總黃酮提取物的抗氧化活性

3.4.1 甜橙果皮總黃酮提取物對 DPPH和ABTS自由基的清除能力

不同濃度甜橙果皮提取物對 DPPH、ABTS自由基的清除能力如圖6所示。由圖6看出，甜橙果皮提取物對DPPH、ABTS自由基均表現出較好的清除作用。同一濃度下，甜橙果皮提取物對ABTS的清除能力高于DPPH，這與不同自由基本身性質有關[36]。

另外，隨著果皮提取物濃度的增加，其對DPPH、ABTS自由基的清除率也逐漸增大，劑量效應關系明顯。甜橙果皮提取物對DPPH、ABTS自由基的IC50分別為(1.12±0.13)、(0.22±0.01) mg/mL。LIU[37]在研究甜橙黃酮提取物對DPPH的清除能力時發現，其IC50為(1.19±0.12) mg/mL，與本研究結果一致。

圖6 不同濃度的甜橙果皮提取物中黃酮對自由基的清除作用Fig.6 scavenging potency of extract of orange peels with different concentration

3.4.2 甜橙果皮總黃酮含量與DPPH和ABTS自由基清除能力相關性分析

對甜橙果皮提取物中黃酮含量與抗氧化活性進行相關性分析，結果如圖7所示。果皮提取物中黃酮含量與DPPH(R2=0.959 7，p<0.01)、ABTS(R2=0.985 7，p<0.01)自由基清除能力均呈顯著正相關關系，這說明提取物中黃酮的含量與抗氧化性極相關，提取物中的黃酮類物質是抗氧化的主要物質，這與LOU[38]等在研究金橘總黃酮含量與抗氧化能力的相關性時，得到的結果相似。但萬利秀[39]等研究發現，柑橘果皮中總黃酮含量與DPPH自由基清除能力無關，分析其原因可能是，提取液中存在其他雜質，影響了實驗結果。

圖7 甜橙果皮提取物中黃酮含量與自由基清除能力的相關性分析Fig.7 Analysis of the correlation between the radical scavenging ratios (%) and the total flavonoids of the extracts from orange peels

4 結論

甜橙果皮中的黃酮類物質主要為黃烷酮和多甲氧基黃酮，本實驗主要采用加熱浸提法提取甜橙果皮中的黃酮類物質并利用HPLC對不同提取條件下黃烷酮和多甲氧基黃酮進行了精確的定量，篩選出了最優的提取條件。研究結果發現，黃烷酮的最佳提取條件為：以70%體積分數的乙醇作為溶劑，料液比為1∶20，90 ℃提取4 h，提取效果最佳，達到(24.74±0.42) mg/g；多甲氧基黃酮提取的最佳條件為：以80%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶10，60 ℃提取2 h，多甲氧基黃酮的提取效果最佳，達到(2.47±0.08) mg/g。

采用水沉法精制甜橙黃酮提取物，經HPLC檢測分析，精制后提取物中的總黃酮純度達到42.05%，其中多甲氧基黃酮含量為(19.93±0.14) mg/g。利用DPPH、ABTS兩種體外抗氧化體系評價精制后甜橙果皮提取物總黃酮的抗氧化作用，發現甜橙果皮提取物總黃酮對ABTS的清除作用較強，且總黃酮含量與抗氧化能力呈極顯著正相關，甜橙果皮提取物中的黃酮類物質是主要的抗氧化成分。

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