響應面優化的南極磷蝦蛋白磷酸化改性工藝

戚亭，陳雪忠，劉志東*，劉寶林，黃洪亮，曲映紅，汪雯翰

1(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海,200093) 2(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海,200090) 3(上海海洋大學食品學院，上海,201306) 4(上海市農業科學院食用菌研究所，上海,201403)

天然來源蛋白質由于結構等因素，其某些功能特性在應用方面受到很大的限制。為了更廣泛地被應用，需對食品蛋白質的功能特性進行改性。常用的食品蛋白質改性方法包括：物理改性、化學改性和生物改性，即借助外界因素促使蛋白質的氨基酸殘基，蛋白質分子重排，空間結構和理化性質改變，進而影響功能特性[1]。蛋白質的磷酸化改性是蛋白質支鏈上的羥基被磷酸根取代的過程，被認為是一種有效改善蛋白質功能特性的化學改性方法[2]。近年來，以花生蛋白、乳蛋白、雞蛋清蛋白、大豆分離蛋白等為原料開展的磷酸化改性研究表明改性蛋白結構發生變化，蛋白質功能特性得到明顯改善，且磷酸化對蛋白質的消化影響不顯著[3-7]。然而，針對南極磷蝦蛋白的磷酸化改性的研究至今鮮有報道。

南極磷蝦(EuphausiasuperbaDana)是一種生活在南冰洋的南極洲水域的磷蝦，生物資源量巨大[8-10]。南極磷蝦蛋白中含有FAO/WHO要求的人體必需的全部的氨基酸[11-12]。南極磷蝦蛋白的生物價極高，但是由于受功能特性所限，其應用領域較窄；若能夠經過改性改善南極磷蝦蛋白質的功能和營養特性，可進一步拓寬南極磷蝦蛋白質的綜合利用[13-14]。

本文以南極磷蝦蛋白為原料進行磷酸化改性研究，通過優化南極磷蝦蛋白磷酸化改性條件，以期能夠為南極磷蝦蛋白資源的開發利用等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極大磷蝦(EuphausiasuperbaDana) 2016年由上海開創遠洋漁業有限公司于南極設得蘭群島海域捕獲，儲存于實驗室超低溫冰箱中備用。

HCl、三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,STP)、NaOH、醋酸鋅、NaH2PO4、氨水-氯化銨緩沖液(pH=10)、EDTA-二鈉、Na2PO4、鉻黑T、三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)等，試劑均為國產級分析純。

1.2 儀器和設備

TGl-16M高速臺式冷凍離心機；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；電子天平；PHS-3C型pH計； PRO250均質器；傅里葉紅外光譜測試儀；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計；BM255攪拌機；真空冷凍干燥機。

1.3 試驗方法

1.3.1 南極磷蝦蛋白的提取

參照高飛等的方法[15-16]。

1.3.2 脫脂南極磷蝦蛋白的制備

參照WANG[17-18]等的方法但略有改動，室溫下采用95%的乙醇對南極磷蝦蛋白粉脫脂處理，磁力攪拌每間隔2～3 h更換1次乙醇至脂肪去除，結束后于通風櫥中風干。

1.3.3 脫脂南極磷蝦蛋白三聚磷酸鈉的磷酸化[19]

(1)取磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)溶解脫脂南極磷蝦蛋白，10 000 r/min均質后室溫攪拌1 h。

(2)加入三聚磷酸鈉，調節反應pH，于恒溫加熱磁力攪拌器中反應。

(3)反應結束后，將反應后的磷酸化蛋白置于4 ℃環境多次透析除鹽。

(4)將透析好的樣品冷凍干燥，-80 ℃儲存備用。

1.3.4 磷酸化程度測定[20-21]

參考孟陸麗等的方法但略有改動。取透析后的脫脂南極磷蝦蛋白磷酸化反應液5 mL，加入10% TCA沉淀蛋白質，10 000 r/min離心10 min，向上清液中加入過量1 mol/L的醋酸鋅，使其中的焦磷酸在pH 3.8～3.9條件下以焦磷酸鋅的形式沉淀，然后用pH 10的氨水-氯化銨緩沖液溶解焦磷酸鋅，用2～3滴鉻黑T做指示劑，用0.02 mol/L的EDTA-Na2標準溶液滴定，當溶液的顏色由紫紅變成藍色時即為滴定終點，按公式(1)計算:

磷酸化程度/(mg·g-1)=C×(V2-V1)×Mp/2m

(1)

式中：C為EDTA-Na2標準溶液的濃度，mol/L；V1為滴定空白所耗EDTA-Na2標準溶液的體積，mL；V2為滴定樣品所耗EDTA-Na2標準溶液的體積，mL；MP為磷的相對原子質量為30.97；m為樣品中南極磷蝦蛋白的質量，g。

1.3.5 脫脂南極磷蝦蛋白的磷酸化反應條件優化

1.3.5.1 單因素實驗

以脫脂南極磷蝦蛋白為原料，分別考察蛋白質質量濃度(10～50 g/L)、pH值(7～11)、三聚磷酸鈉添加量為1～8 g/100g蛋白、反應時間(1～3 h)、反應溫度(25～45 ℃)對南極磷蝦蛋白磷酸化水平的影響，實驗因子均設置5個梯度水平，且均做3次平行。

1.3.5.2 響應面實驗

選用最優的單因素實驗條件，以磷酸化水平為響應值，進行5因素3水平的響應面優化實驗。

1.3.6 數據統計與分析

利用Excel 2013、Origin 8.0分析整理單因素實驗結果，以“平均值±標準差”表示；OMNIC 8.0等軟件對傅里葉紅外光譜數據整理作圖；Design Expert 7.1.3進行響應面實驗設計、SPSS 18.0分析處理組間顯著性差異。

1.3.7 脫脂南極磷蝦蛋白磷酸化的紅外光譜[22]

樣品經KBr粉末混合壓片處理后靜置測定。掃描波數為400～4 000 cm-1，掃描數為64。

2 結果與討論

2.1 磷酸化改性的單因素實驗

2.1.1 蛋白質質量濃度對磷酸化水平的影響

配制質量濃度為10～50 g/L的脫脂南極磷蝦蛋白溶液，加入一定量的三聚磷酸鈉，在30 ℃下反應2.5 h，測定改性后蛋白磷酸化程度，反應的pH為8.5。蛋白質質量濃度對磷酸化程度的影響如圖1所示。

圖1 蛋白質濃度對磷酸化程度的影響Fig.1 The effect of concentration of protein on the degrees of phosphorylation

從圖1可以看出，磷酸化程度隨底物南極磷蝦蛋白含量的增加而增加，達到最大磷酸化程度后，隨底物濃度的增大而緩慢降低，這是因為蛋白質濃度低時，STP與蛋白質之間比例極低，STP未能全部與蛋白質氨基酸殘基發生反應，隨著蛋白質濃度的增加，蛋白質與STP逐漸達到最適比例，與三聚磷酸鈉反應的蛋白質達到飽和狀態，此時的南極磷蝦蛋白質的磷酸化程度最高，所以實驗選取蛋白質質量濃度為20 g/L為最優改性蛋白濃度。

2.1.2 反應時間對磷酸化程度的影響

配制質量濃度為20 g/L的脫脂南極磷蝦蛋白溶液，加入三聚磷酸鈉量為4%、反應時間分別設置為1、1.5、2、2.5、3 h、pH為8.5、反應溫度30 ℃，測定改性后蛋白磷酸化程度，其變化結果如圖2所示。

圖2 反應時間對磷酸化程度的影響Fig.2 The effect of time on the degrees of phosphorylation

從圖2可以看出，磷酸化程度隨反應時間的變化規律是先增加后慢速降低，即表示一定條件下，南極磷蝦蛋白質磷酸化改性可以在短時間內快速完成，在反應時間為1.5 h磷酸化程度達到最佳值，后南極磷蝦蛋白質磷酸化程度緩慢下降，表明可能反應已基本完全[23]，時間的延長也可能導致蛋白質的部分降解，使得南極磷蝦蛋白質的磷酸化程度降低。

2.1.3 STP添加量對磷酸化程度的影響

配制2%的脫脂南極磷蝦蛋白溶液，分別加入1、2、4、6、8 g/100g蛋白的三聚磷酸鈉，調節pH為8.5、30 ℃下反應1.5 h，測定改性后蛋白質磷酸化程度，其變化結果如圖3所示。

圖3 STP添加量對磷酸化程度的影響Fig.3 The effect of concentration of STP on the degrees of phosphorylation

圖3表明蛋白質的磷酸化程度隨三聚磷酸鈉的添加量增加呈現先增后減的趨勢，STP添加量為1～6 g/100g蛋白時，南極磷蝦蛋白質的磷酸化程度增加顯著，繼續增加STP的添加量到6～8 g/100g，蛋白質磷酸化程度明顯下降，說明一定范圍內增加STP的添加量有利其與蛋白質的充分反應，但過量的三聚磷酸鈉，引入的磷酸根基團數量增加，蛋白質分子間靜電斥力增大，參加磷酸化反應的有效蛋白質分子減少，磷酸化程度下降，所以后續實驗選擇6 g/100g蛋白的STP添加量，計算磷酸化程度為30.97 mg/g蛋白。

2.1.4 pH對磷酸化程度的影響

將脫脂南極磷蝦蛋白不同pH(7～11)條件下反應，其磷酸化程度變化結果如圖4所示。隨著pH的增加南極磷蝦蛋白質磷酸化程度先增加后減少，在pH值為9附近達到最大。根據磷酸化改性的原理，氨基與三聚磷酸鈉的反應在堿性條件下更易發生，蛋白質的磷酸化程度也相應較高[24]，但是隨著pH的繼續上升，南極磷蝦蛋白的磷酸化程度降低，可能是因為過強的堿性條件導致蛋白質變性，使得與氨基結合的蛋白質數量降低，降低了南極磷蝦蛋白的磷酸化水平[25]。

圖4 反應pH對磷酸化程度的影響Fig.4 The effect of pH on the degrees of phosphorylation

2.1.5 反應溫度對磷酸化程度的影響

將脫脂南極磷蝦蛋白在25～45 ℃溫度下反應，磷酸化程度隨溫度變化結果如圖5所示。磷酸化程度隨反應溫度升高至40 ℃時達到最大，后緩慢降低。溫度升高，分子活化能上升使得蛋白質磷酸化程度更加有效率[26]，但是過高的反應溫度反而使蛋白質變性機率增加，與STP反映的蛋白質數量下降，磷酸化程度下降。

圖5 反應溫度對磷酸化程度的影響Fig.5 The effect of temperature on the degrees of phosphorylation

2.2 響應面優化分析

以三聚磷酸鈉添加量、反應pH、蛋白質濃度等為自變量，磷酸化程度為因變量，采用Box-Benhnken試驗設計5因素3水平的響應面實驗(見表1)。

表1 響應面設計因子水平表

2.2.1 回歸方程的建立

表2即響應面試驗設計；采用Design-Expert 7.1.3軟件處理，響應面方差分析結果見表3。

表2 磷酸化蛋白響應面分析設計及結果

對表2的數據分析得到南極磷蝦蛋白磷酸化程度(響應值y)對5個單因素的二次多項回歸曲線，剔除不顯著項AC、AD、CD、CE、DE后對方程進行優化得方程：

y=41.29+3.48×A+1.26×B+1.45×C+1.65×D-0.48×E+2.33×A×B-2.33×A×E+1.94×B×C-3.49×B×D+1.93×B×E-10.71×A2-3.10×B2-9.81×C2-9.55×D2-4.65×E2

(1)

注：p<0.05表示差異顯著，以*表示；p<0.01表示差異非常顯著，以**表示；p<0.001表示差異極顯著，以***表示。

表3中F值表示的是單因素對南極磷蝦蛋白磷酸化程度的影響程度，F值越大，說明影響就越大[27]。由5個影響因素的F值大小可以推斷出5因素對影響排序為A>D>C>B>E，其中因素A(蛋白質濃度)對南極磷蝦蛋白磷酸化程度高度顯著，B(三聚磷酸鈉添加量)、C(反應時間)、D(反應pH值)、BD對南極磷蝦蛋白磷酸化程度影響極顯著(p<0.01)，AB、AE、BC、BD、BE對南極磷蝦蛋白磷酸化程度影響較顯著(p<0.05)，E(反應溫度)、AC、AD、CD、CE、DE的p>0.05，表明其對南極磷蝦蛋白磷酸化程度沒有顯著影響，A2、B2、C2、D2、E2對南極磷蝦蛋白磷酸化程度的影響高度顯著。

采用Design-Expert 7.1.3 軟件根據多元回歸擬合分析處理5個因素對南極磷蝦蛋白磷酸化水平影響的結果見圖6。由圖6看出，蛋白質濃度和三聚磷酸鈉添加量(AB)、蛋白質濃度和反應溫度(AE)、三聚磷酸鈉添加量和反應時間(BC)、三聚磷酸鈉添加量和反應pH值(BD)、三聚磷酸鈉添加量和反應溫度(BE)對南極磷蝦蛋白的磷酸化水平影響顯著[29]。

圖6 各兩因素交互作用對南極磷蝦蛋白磷酸化程度影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots and contour plots indicating the interactive between two factors on the phosphorylation of Antarctic krill protein

2.2.2 模型的優化和驗證

通過單因素和響應面優化實驗得到最佳的南極磷蝦蛋白磷酸化改性的條件為蛋白質濃度22 g/L、三聚磷酸鈉添加量6.55 g/100g蛋白、反應時間1.55 h、反應pH值9.04、反應溫度39.90 ℃，在該條件下磷酸化水平約為41.91 mg/g。取最優的單因素條件進行三次磷酸化改性驗證實驗，在該條件下磷酸化水平約達40.78 mg/g，與預測值誤差為2.7%，說明該模型可以較好地預測磷酸化改性條件與磷酸化水平之間的相關關系。

2.3 磷酸化南極磷蝦蛋白的紅外光譜分析

通過南極磷蝦蛋白磷酸化后的紅外光譜圖分析，磷酸化南極磷蝦蛋白在1 500～1 700 cm-1存在以波數1 533 cm-1、1 646 cm-1為峰值的紅外吸收峰；在1 000～1 300 cm-1存在以波數1 076 cm-1和1 237 cm-1為峰值的紅外吸收峰。

圖7 南極磷蝦磷酸化蛋白的紅外光譜圖Fig.7 The infrared spectra of phosphorylated protein in Antarctic krill

據文獻報道，1 000～1 300 cm-1的峰值由羥基氨基酸殘基的C—O伸縮振動和C—O—H彎曲振動產生，—OH磷酸化增強了振動時的偶極矩和振動強度，說明1 076 cm-1和1 237 cm-1處的吸收峰為C—O—P 產生的伸縮振動，即蛋白質氨基上的氫被磷酸根基團取代的過程。這與王彥超研究的南極磷蝦蛋白磷酸化后在1 000～1 300 cm-1存在以波數1 083 cm-1和1 241 cm-1為峰值的紅外吸收峰結果基本相同，表明南極磷蝦蛋白磷酸化改性是切實可行的。磷酸化水平的高低可以通過峰值強弱得知[30-32]。

3 結論

本實驗建立了以蛋白質磷酸化程度為響應值，以蛋白質濃度、STP添加量、反應pH值等因素為因子的數學模型，優化確定的南極磷蝦蛋白質磷酸化條件為蛋白質質量濃度22 g/L、三聚磷酸鈉添加量6.55 g/100g蛋白、反應時間1.55 h、反應pH值9.04、反應溫度39.90 ℃，在該條件下磷酸化水平為41.91 mg/g。結合實際實驗調整進行3次驗證實驗，測得南極磷蝦蛋白磷酸化改性水平為40.78 mg/g，這與預測值誤差為2.7%，且傅里葉紅外光譜實驗也證明利用三聚磷酸鈉對南極磷蝦蛋白進行磷酸化改性是實際可行的，真實值與預測值之間的差距來源于實驗過程可能存在的干擾因素，其他可能因素對蛋白質磷酸化改性水平的影響還需更深層次的探討。

[1] 趙卉雙,陳麗嬌,梁鵬,等.不同改性方法對蛋白質功能性質的影響研究[J].食品工業,2015,36(12):223-225.

[2] 楊鈴.蛋白質磷酸化改性研究進展[J].糧食加工,2007,32(3):66-68.

[3] 李珊珊,王加啟,魏宏陽,等.乳蛋白磷酸化分析方法研究進展[J].東北農業大學學報,2010,41(1):149-152.

[4] BRAND J,SILBERBAUER A,KULOZIK U.Comparison of different mechanical methods for the modification of the egg white protein ovomucin, part a: physical effects [J].Food and Bioprocess Technology,2016,9(3):501-510.

[5] 鄭優,賈亮,段蓉,等.響應面法優化可食性雞蛋清蛋白膜的磷酸化改性工藝[J].食品工業科技,2016,37(6):242-249.

[6] 金華麗,鄭靜靜.磷酸化預處理對花生蛋白酶解特性的影響[J].河南工業大學學報,2015,36(1):8-11.

[7] 姚玉靜,楊曉泉,張新會.大豆分離蛋白的磷酸化改性研究[J].食品與發酵工業,2010,27(10):5-8.

[8] RATNARAJAH L,BOWIE A R.Nutrient cycling: are antarctic krill a previously overlooked source in the marine iron cycle?[J].Current Biology Cb,2016,26(19),2 667-2 673.

[9] CAVANAGHR D,HILL S L,KNOWLAND C A,et al.Stakeholder perspectives on ecosystem-based management of the antarctic krill fishery[J].Marine Policy, 2016, 68:205-211.

[10] HEWITT R P,WATKINS J,NAGANOBU M,et al. Biomass of Antarctic krill in the cotia sea in january/february 2000 and its use in revisingan estimate of precautionary yield[J].DeepSea Research Part II:Topical Studies in Oceanography,2004, 51(12/13):1 215-1 236.

[11] ATKINSON A, SCHMIDT K, FIELDING S,et al.Variable food absorption by antarctic krill: relationships between diet,egestion rate and the composition and sinking rates of their fecal pellets[J].Deep Sea Research Part II Topical Studies in Oceanography,2012, 59-60(1):147-158.

[12] 李芳,劉俊榮,梁姍姍,等.南極磷蝦蛋白質的分離特性及其組分分析[J].大連海洋大學學報,2013,28(2):191-194.

[13] YOSHITOMI B J.Utilization of antarctic krill for food and feed[J].Developments in Food Science,2004,42(4):45-54.

[14] BISCONTIN A, FRIGATO E, SALES G, et al.The opsin repertoire of the antarctic krill euphausia superba[J].Marine Genomics,2016, 29:61-68.

[15] 高飛,韓春然,石彥國,等.南極磷蝦蛋白質提取條件優化[J].天然產物研究與開發,2016(2):307-312.

[16] WANG Ling-zhao,XUE Chang-hu,WANG Yu-ming,et al.Extraction of proteins with low fluoride level from Antarctic Krill(Euphausiasuperba) and their composition analysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(11):6 108-6 112.

[17] WANG Yan-chao,WANG Shan-shan,WANG Jing-feng,et al.Preparation and anti-osteoporotic activitiesinvivoof phosphorylated peptides from Antarctic krill (Euphausiasuperba)[J].Peptides,2015,68:23-245.

[18] LI Can-peng,CHEN De-yi,PENG Jian-lin,et al.Improvement of functional properties of whey soy protein phosphorylated by dry-heating in the presence of pyrophosphate[J].LWT-Food Science and Technology,2010,43(6):919-925.

[19] 王彥超.南極磷蝦活性蛋白肽和甲殼質的性質研究[D].上海：中國海洋大學,2013.

[20] ZHANG Kun-sheng,LI Yang-yang,RENYun-xia.Research on the phosphorylation of soy protein isolate with sodium tripoly phosphate[J].Journal of Food Engineering,2007,79(4):1 233-1 237.

[21] 孟陸麗,程謙偉,李軍生,等.絲素蛋白的磷酸化改性研究[J].食品科技,2009,34(7):221-224.

[22] KRIMM S,BANDEKAR J.Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins[J].Advances in Protein Chemistry and Structural Biology,1986,38(c):181-364.

[23] BELWAL T,DHYANI P,BHATT I D,et al.Optimization extraction conditions for improving phenolic content and antioxidant activity in berberisasiatica fruits using response surface methodology (rsm)[J].Food Chemistry,2016,207:115.

[24] 江明珠,韓舒睿,聞燕.雞血紅蛋白磷酸化工藝的研究[J].食品科技,2012,37(11):128-131.

[25] 申世強.磷酸化和琥珀?；蠖狗蛛x蛋白的制備與功能性質研究[D].廣州：暨南大學,2010.

[26] 彭倩.豬血中血紅蛋白的分離、磷酸化及其功能性的研究[D].天津：天津商業大學,2010.

[27] 王升力,黃雪琴,郭詩,等.響應面法優化蝦殼中蝦青素提取工藝的研究[J].陜西農業科學,2016,62(2):1-5.

[28] 孫雪,潘道東,曾小群,等.滸苔多糖的磷酸化修飾工藝[J].食品科學,2011,32(24):73-77.

[29] CHANIOTI S,TZIA C.Optimization of ultrasound-assisted extraction of oil from olive pomace using response surface technology:oil recovery,unsaponifiable matter, total phenol content and antioxidant activity [J]. LWT-Food Science and Technology,2017, 79: 178-189.

[30] WANG Xi-bo,CHI Yu-jie.Microwave-assisted phosphorylation of soybean protein isolates and their physicochemical properties[J].Czech Journal of Food Sciences,2012,30(2):99-107.

[31] 李瑜,王蘭,尹春明,等.小麥面筋蛋白的磷酸化改性研究[J].鄭州工程學院學報,2002,23(2):49-64.

[32] YANG Li-jun,GUO Jing,YU Yue,et al.Hydrogen bonds of sodium alginate/Antarctic krill protein compositematerial[J].Carbohydrate Polymers,2016,142:275-281.