先天性外中耳畸形(1)
——發育生物學研究進展

張天宇 李辰龍

先天性外中耳畸形(microtia and atresia，MA)也稱小耳畸形，是頜面部最主要的出生缺陷之一，全球發病率約為2.06/10 000，其中我國的發病率為1.4/10 000。本病常涉及耳廓、外耳道、中耳，偶可累及內耳，可單獨或聯合發生；臨床表現多樣，包括：耳廓畸形，如：耳廓發育不良、殘缺、皺縮、皮贅甚至無耳畸形，外耳道閉鎖或狹窄，中耳畸形(如：聽骨鏈畸形、面神經畸形)等；部分伴有頜骨發育畸形(半面短小)[1]。先天性外中耳畸形可以單獨發生，也可以作為某一綜合征的耳部癥狀出現，如：Treacher-Collins綜合征、Nager綜合征或眼-耳-脊柱發育不良等[2]。

Artunduaga等[3]分析了72對先天性外中耳畸形雙胞胎，其中同卵雙胞胎38對，10對均表現出耳廓畸形；雖然38對同卵雙胞胎共享基因型，但仍有28對雙胞胎并沒有表現為耳廓畸形，且表現為耳廓畸形的10對雙胞胎耳廓畸形程度不一。動物模型是研究先天性外中耳畸形發生機制的重要生物模式，各類基因敲除或突變動物模型大多表現為雙側耳廓畸形，且畸形程度相似[4～9]，這與患者流行病學調查結果并不相符，本病以單側發病為主，且雙側發病患者耳廓畸形程度并非完全相同[10]。

胚胎時期第一、二鰓弓、第一鰓裂及第一咽囊發育異?？蓪е卤静〉陌l生[11]。發育生物學是理解先天性畸形的基礎之一，了解外中耳結構的發育對理解先天性外中耳畸形的發生機制十分重要。

1 正常外中耳的發育

1.1耳廓的發育 外中耳是由內胚層第一咽囊、外胚層第一鰓弓(下頜弓)、第二鰓弓(舌骨弓)、第一鰓裂及中胚層間充質組織衍化而來。人類胚胎發育至第4周時出現鰓弓，為胚體頭部兩側的柱狀弓形隆起。顱神經嵴細胞(cranial neural crest cell，CNCC)是一種多能干細胞，是第一、二鰓弓區域間充質的主要細胞成分。CNCC的一個重要特征是其遷移性，不同部位CNCC各具特定的遷移路徑，來源于中腦區后份及菱腦r1、r2節段的CNCC參與形成第一鰓弓，r3、r4節段的CNCC 參與形成第二鰓弓[12]。

經典的耳廓發育模式是His小丘模式，胚胎第5～6周，耳廓結構開始發育，第一、二鰓弓背側端的間充質增生隆起，形成6個結節狀小丘，其中3個出現在第一鰓弓尾部，3個出現在第二鰓弓頭部。隨著第一、二鰓弓及其之間的鰓裂發育，6個小丘逐漸融合，分化形成耳廓特定結構；第一鰓弓的3個小丘分別發育為耳屏、耳輪根部和耳輪腳；第二鰓弓的3個小丘發育成對耳輪、對耳屏、耳輪下部及耳垂。第12周，小丘完成融合，形成外耳(圖1)。胚胎早期的耳廓發生于下頜骨尾部，接近頸根部，第20周時，隨著第一鰓弓的不斷發育，耳廓由頸后向正常耳區部位移行[13,14]。

第一鰓弓3個結節狀小丘鄰近的間充質及其表面覆蓋的外胚層過度增生，可形成額外的耳結節而后發育形成副耳，副耳與正常耳廓的發育并無直接聯系。隨著第一、二鰓弓發育形成上頜骨、下頜骨及面部組織，位于第一、二鰓弓融合部位的副耳逐漸遷移，定位于耳前與口角之間的區域[15]。

1.2外耳道的發育 胚胎第6周，第一、二鰓弓之間的第一鰓裂向內延伸形成外耳道。胚胎第9周，作為第一鰓弓的衍生物，鼓環開始發育，鼓環在發育過程中逐漸變寬，其控制并調節第一鰓裂的內陷以形成耳道及鼓膜。第一鰓裂的中間部與鼓環緊密相連，其背側末端的外胚層細胞增殖并向內生長，形成硬核被稱為外耳道栓，協助外耳道向內擴大[16,17]。第21周時，外耳道栓通過復層鱗狀上皮脫落逐漸形成外耳道的中空結構，這一過程是由角化引起的非凋亡性細胞程序性死亡[18]。至第28周時，外耳道最內側的外胚層和第一咽囊外側末端的內胚層相連形成鼓膜，第一鰓弓的部分中胚層間充質留在兩層之間，分化為鼓膜的纖維層，鼓膜是耳部唯一包含3個胚層的結構。外耳道上皮分布著兩種腺體，耵聹腺和皮脂腺，它們首先出現于胚胎第13周，在胚胎第6月時發育成熟；這些腺體可產生粘稠的分泌物、油脂并與角蛋白混合形成耵聹，參與維持外耳道的自凈功能[19]。

圖1 胚胎第5～6周耳廓發育及第一、二鰓弓各小丘發育成耳廓示意圖 1～6分別為6個結節狀小丘;a.耳廓發育示意圖;b.各小丘發育成耳廓對應結構示意圖

1.3中耳的發育 胚胎第3周出現第一咽囊，第6周時咽囊開始延長，第8周時形成早期中耳腔；早期中耳腔只有中耳的下一半，其余仍由結締組織充填。隨著第二鰓弓間充質將其收窄, 第一咽囊的近心部分延長變細形成咽鼓管，連接中耳腔和咽腔。

胚胎第6周，人耳聽骨開始發育，第一、二鰓弓的間充質內形成3個聽骨的軟骨原基；Meckel軟骨起源于第一鰓弓，第16周時形成鼓室支和下頜支，鼓室支最終分化為錘骨頭、砧骨體和砧骨短腳，如發育時其原基未分離，則可形成錘砧融合畸形，先天性外中耳畸形患者中此類中耳畸形最為常見[20]。而下頜支與下頜骨的發育相關，因此，先天性外中耳畸形常合并下頜骨畸形，如：半面短小。Reichert軟骨起源于第二鰓弓，分化為鐙骨板上結構、錘骨柄和砧骨長腳；鐙骨足板及環韌帶是由耳囊和內耳原基發育而來。隨著第一咽囊的不斷擴展, 包繞3個逐漸成熟的聽骨并形成中耳腔，所有外中耳結構在第30周發育完成[11]。

2 畸形外中耳的發育

先天性外中耳畸形是第一、二鰓弓綜合征的特征性表現之一，第一、二鰓弓綜合征是指源于胚胎期第一、二鰓弓、第一咽囊、第一鰓裂和顳骨原基的顱面結構發育不良而表現出的一組先天性畸形。第一、二鰓弓除發育成耳部外，還將發育成上頜骨、下頜骨、肌肉、顱神經，且心臟的脈管系統同樣是由第一、二鰓弓包裹發育而成，因此，外中耳畸形常伴有下頜骨畸形和心臟畸形[21]。內耳由菱腦r5、r6節段的外胚層組織獨立發育而成，因此，先天性外中耳畸形患者內耳大多正常。凡是能夠影響第一、二鰓弓及CNCC遷移及分化的因素都可能導致先天性外中耳畸形的發生。

2.1耳廓、中耳畸形 先天性外中耳畸形的分級常采用Marx分類方法，Marx分類共有3級：Ⅰ°畸形，可見正常耳部解剖標志但較正常耳??；Ⅱ°畸形，患耳可見部分解剖標志；Ⅲ°畸形最為常見，耳廓為類似于花生樣的未發育軟組織[22]。在臨床工作中，同一畸形程度的患者耳部表現仍具有一定差異。雖然本病的發生機制至今仍未明確，但多認為第一、二鰓弓的發育及CNCC遷移及分化過程中的影響因素與本病的發生密切相關。

目前已知的一個涉及耳廓發育的重要基因是同源盒轉錄因子Hoxa2，其在脊椎動物前后軸發育模式中起到重要作用。Hoxa2基因是第二鰓弓內唯一表達的Hox基因，Hoxa2缺失小鼠會使第二鰓弓轉化成第一鰓弓的組織。若第一鰓弓CNCC中的Hoxa2基因表達異常，可誘導出現重復耳廓，原因是當某一體節Hox基因缺失，可導致其支配區域的組織分化成為其前一體節的相應結構。Minoux等研究發現，Hoxa2基因突變小鼠除了表現為無耳畸形，還出現了外耳道、鼓環、錘骨及砧骨的重復，而這些結構均來源于第一鰓弓[14,23,24]。敲除小鼠的Hoxa1和Hoxb1基因后，第二鰓弓CNCC 數量明顯減少，表現為源于第二鰓弓的結構發育畸形及面神經發育異常[25]。

Treacher Collins綜合征中Tcof1基因突變，造成Treacle蛋白單倍劑量不足，減少了核蛋白體和神經上皮細胞的生殖，使得移行到第一、二鰓弓的CNCC亦相應不足，最終導致了包括耳畸形在內的顱面畸形[26]。Tbx1基因突變可導致小耳畸形，但其并非直接作用于CNCC，而是通過引導來源于不同部位的CNCC以發揮作用，這種間接作用也會影響到CNCC的正常遷移與分化[27]。Wnt基因家族與CNCC的形成和發育相關，Wnt5a基因可在耳廓間充質中表達，且Wnt5a敲除小鼠表現為外耳發育不良[28]。內皮素通路在調節CNCC的增殖和遷移方面至關重要，內皮素及其受體突變的小鼠會表現出不同類型的耳畸形。轉錄因子Gsc作為內皮素通路的下游靶點，其在第一鰓裂周圍的間充質中表達，與外耳、中耳的發育相關[25]。Msx2突變可引起偶數節段的菱腦原節CNCC凋亡增加，突變小鼠出現砧骨變形、鐙骨未分化及上下頜骨發育不良等顱面部畸形[29]。

雖然各類基因敲除或突變動物模型大多表現為雙側耳廓畸形，且畸形程度相似，但Frem2基因缺陷小鼠表現為單側耳廓畸形，且出生時常伴有患耳周圍組織血腫，雖然該基因并不在血管中表達，但Frem2的相關蛋白涉及細胞外基質的調控，一旦缺乏此類蛋白，不僅會對形態造成影響，而且還會增加組織脆性；可能的作用機制是誘發了過多間充質細胞死亡，使得CNCC過分遷移及過早分化，進而引起外中耳畸形的發生[30]。

2.2外耳道畸形 外耳道是在耳廓基本形成之后才開始發育的，所以可以表現為單獨的外耳道畸形而不伴有耳廓畸形。對于外耳道發育畸形的分類，國內外大多采用Schuknecht的分類方法，即根據外耳道畸形的程度大致分為4類，其中typeA和B為外耳道狹窄(有鼓膜)，type C和D為外耳道閉鎖(無鼓膜)[31]。如外耳道最內側的外胚層和第一咽囊外側末端的內胚層未相連，則不會形成鼓膜，錘骨柄結構也將缺如；Ishimoto總結了50例先天性外耳道閉鎖患者術中情況，發現所有耳道閉鎖患者錘骨柄均缺如[32]，與我們的臨床觀察結果高度吻合。從發育生物學角度看，我們認為外耳道畸形可分為兩類，即有鼓膜的外耳道狹窄和無鼓膜的外耳道閉鎖更為合適[33]，這一分類有助于指導臨床手術決策的選擇。

外耳道在發育過程中是朝向鼓室定向生長的，該區域可能存在引導外耳道生長的信號。在Gsc和Prx突變的小鼠中，由于沒有鼓環，外耳道并沒有向鼓室的方向生長。Hoxa2基因突變小鼠出現了外耳道、鼓環的重復，且這兩個外耳道分別向兩個鼓環的方向生長[16,34]。先天性外耳道狹窄患者的外耳道與正常人相比，不僅存在口徑上的區別，而且在形態、長度、位置、傾斜度及方向等方面均存在不同程度的差異，這種差異也使得先天性外耳道狹窄患者易形成外耳道膽脂瘤[35]。

外中耳的發育起源于內胚層第一咽囊, 外胚層第一、二鰓弓及其所包含的第一鰓裂, 以及其間的中胚層間充質。耳廓、鼓環和聽骨均來自第一、二鰓弓，第一咽囊形成咽鼓管和中耳, 第一鰓裂構成原始外耳道。鼓膜是耳部唯一包含3個胚層的結構。近年來，隨著二代測序等技術的推廣，基因組數據庫的不斷完善，各個國家和地區的學者針對本病的家系及綜合征開展了大量研究工作，超過18種小耳畸形相關綜合征的致病基因已經逐漸明確。但本病以散發為主，非綜合征型多見，其發病機制并未明確。深入了解外中耳的發育生物學基礎，未來可以從表型-基因型入手，明確本病的遺傳學病因和發病機制；還可以圍繞胚胎-胎兒個體發育分化的重要階段，研究發育的時程性調控機制，個體發育過程中的細胞遷移、凋亡等生命現象的機制。

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