不同貯藏溫度下鮐魚生物胺變化的研究

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(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,國家水產品加工技術研發中心, 農業部水產品加工重點實驗室,廣東廣州 510300; 2.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 3.廣東省漁業生態環境重點實驗室,廣東廣州 510300)

生物胺是一類具有生物活性的低分子量的含氮有機化合物的總稱,廣泛存在于各種食品中,一旦形成,很難被破壞[1]。張月美等[2]對草魚進行85 ℃熱處理,發現此溫度對生物胺的破壞并不明顯。而以魚類為代表的水產品及其制品被認為是生物胺含量最高的一類食品[3],水產品中的生物胺主要是氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下脫去羧基形成的。合成生物胺的微生物菌屬有很多,主要包括乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬、變形菌屬、假單胞菌屬、沙丁氏菌屬、鏈球菌屬、巴斯德氏菌屬等[4-5]。

適量的生物胺是生物活性細胞不可缺少的組分之一,能夠調節人體生理活動,而攝入過量時就會對人體健康產生危害,引起人體中毒,嚴重時還會危及生命。常見的生物胺中組胺對人類的危害最大,其次是酪胺。據報道,攝入組胺8～40 mg會有輕微中毒現象,超過40 mg則會產生中度中毒癥狀,超過100 mg就會引發人體嚴重中毒[6]。酪胺在人體內含量超過100 mg時,會引發偏頭痛[7]。攝入3 mg以上的苯乙胺會使人體產生偏頭疼等癥狀[8]。人體內累積一定量的色胺會增加血壓,而腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等會抑制組胺和酪胺代謝酶的活性,導致這兩者的累積。腐胺、亞精胺等還能通過一定反應生成一些致癌物質[9]。因此,一些國家制定了部分生物胺的限量標準。美國規定水產品中組胺含量不得超過50 mg/kg[10];歐盟規定鯖科魚類中的組胺含量不得超過100 mg/kg,酪胺含量不得超過100～800 mg/kg[11];我國規定高組胺魚類中組胺含量不得超過400 mg/kg,其它海產魚類中不得超過200 mg/kg[12]。

鮐魚是我國重要的經濟魚類,屬于青皮紅肉魚,血紅蛋白含量高,富含大量的組氨酸,極易發生組胺中毒[13],而且從捕撈至食用，受各種生理生化因素的影響,品質下降快,容易腐敗。而生物胺已經成為一個評價水產品鮮度和腐敗程度的重要指標。溫度和微生物是影響生物胺形成的兩種主要因素。魚內大部分的微生物存活于內臟中。因此本實驗主要探究溫度和去內臟對鮐魚生物胺形成的影響,評估鮐魚從捕撈至經口食用“全鏈條”中生物胺的變化特征及其對人體的健康風險,對保障消費者安全消費鮐魚具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

鮐魚大小均一,平均體長25.20 cm,體重180.39 g,廣州某水產品市場;腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯純度≥98%,美國Sigma公司;高氯酸、鹽酸、丙酮、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水分析純,廣州粵升化學試劑廠;乙睛色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;超純水實驗室自制。

LC-20AD高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器)日本島津SHINADZU公司;TDZ5-WS臺式低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;MILLI-Q超純水機美國Millipore公司;高通量組織研磨儀上海萬柏生物;0.22 μm針頭微孔濾膜過濾器一次性,上海安譜實驗科技股份有限公司

1.2　實驗方法

1.2.1樣品制備將鮐魚分成兩組,每組24條魚,其中一組不做前處理(整魚),另外一組進行去內臟處理(去內臟魚)。兩組魚分別在-18、0、4、10、15、20、25和30 ℃下貯藏,不同的溫度間隔不同的時間定時取鮐魚背部的肌肉組織[22]。測定其8種生物胺的含量,平行測3次。

1.2.2生物胺標準溶液的制備標準溶液的制備參照國標GB/T 20768-2006 《魚和蝦中有毒生物胺的測定 液相色譜-紫外檢測法》[14]。

1.2.3樣品前處理稱取4 g試樣,精確至0.01 g,置于50 mL離心管中,加入10 mL 0. 4 mol/L高氯酸溶液,組織研磨儀研磨5 min,于常溫下5000 r/min離心10 min,上清液移入25 mL棕色容量瓶中。沉淀物用10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液按上述方法重復提取一次,5000 r/min離心10 min,合并上清液于上述容量瓶中,用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度,待衍生。

1.2.4樣品衍生取1 mL樣品溶液于5 mL容量瓶中,依次加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液,300 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖,振蕩,再加入2 mL丹磺酰氯衍生劑(10 mg/mL,溶劑為丙酮),振蕩混勻,在40 ℃黑暗條件下保溫45 min,之后加入100 μL 25%氨水終止反應,靜置30 min,用乙睛定容至刻度,振蕩混勻,取適量溶液用0.22 μm濾膜過濾,用HPLC測定[14-15]。標準溶液的衍生與樣品衍生條件及方法相同。

1.2.5高效液相色譜色譜條件色譜柱為WondaCract ODS-2柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),紫外檢測波長為254 nm,進樣量10 μL,柱溫35 ℃,流動相A為0.01 mol/L的乙酸銨,流動相B為水+乙腈(10+90),流速為1.0 mL/min。梯度洗脫條件:0～5 min,55% B;25～35 min,55%～95% B;35～43 min,95%～55% B;43～45 min,55% B。

1.3　數據處理

2　結果與分析

2.1　生物胺標準品的色譜分析

首先需要采用1.2.5的色譜條件對每種生物胺進行定性檢測,確定8種生物胺的出峰時間,然后對不同濃度的生物胺混合標準品進行測定,結果見圖1所示,8種生物胺在40 min內能夠全部出峰,并且分離效果良好,其出峰順序為色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。

圖1　100 mg/L生物胺混合標準品色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of 100 mg/L mix standard of biogenic amines

2.2　標準曲線的回歸方程和精密度實驗

配制不同濃度的生物胺混合標準品進行線性實驗,在2～100 mg/L范圍內得到8種生物胺的線性回歸方程及其線性相關系數,結果見表1。

由表1可知,8種生物胺的回歸方程線性相關系數r均>0.9990,說明標準曲線具有良好的線性關系,符合檢測的要求。連續對質量濃度為50 mg/L的生物胺混合標準溶液進樣8次,得到8種生物胺的標準偏差范圍在0.76%～1.36%,均<2%,說明該儀器具有較好的精密度,滿足檢測要求。

表1　標準曲線的回歸方程及其精密度實驗結果Table 1　Regression equations of standard curves and precision experiments results

2.3　樣品回收實驗

將不同濃度的生物胺混合標準品溶液添加到4.0 g空白鮐魚肌肉樣品中,使8種生物胺在樣品中的質量濃度分別為5、50、500 mg/kg。按測定方法將空白鮐魚肌肉樣品及各加標水平樣品平行測定6份,計算3個加標水平的回收率和標準偏差,結果如表2示,8種生物胺標準品回收率在88.21%～105.32%,標準偏差RSD在1.89%～5.76%,均<10%。因此,該方法可以用來檢測鮐魚中的生物胺含量。

表2　回收率實驗結果Table 2　Results of recovery experiment

2.4　不同溫度貯藏下8種生物胺的變化

由圖2～9可知,隨著溫度的升高腐胺、尸胺、組胺和酪胺的積累量迅速增加,整魚在0～30 ℃貯藏1 d后,腐胺、尸胺、組胺和酪胺的積累量分別由1.77 mg/kg增長至500.41 mg/kg,3.05 mg/kg增長至 1321.41 mg/kg,5.98 mg/kg增長至3996.56 mg/kg,11.53 mg/kg增長至559.70 mg/kg。而色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺在不同溫度貯藏期間變化都很小而且無規律,因此鮐魚中主要的生物胺為腐胺、尸胺、組胺和酪胺。這可能與鮐魚中的氨基酸和微生物的種類和含量有關。據劉露等[16]報道,鮐魚背部肌肉中游離的谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸含量都較高。而鮐魚中組胺是由組氨酸脫羧形成,尸胺是由賴氨酸脫羧形成,腐胺是由谷氨酸、精氨酸轉變成鳥氨酸再脫羧形成,酪胺是由酪氨酸脫羧形成。據翁佩芳等[17]報道,鮐魚中產組胺菌群較多。因此,這可能導致鮐魚中腐胺、尸胺、組胺、酪胺含量變化明顯。

圖2　整魚(A)和去內臟魚(B)在-18 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.2　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in-18 ℃注：a:貯藏過程中腐胺、尸胺、組胺、酪胺的變化； b:貯藏過程中色胺、苯乙胺、亞精胺、精胺的變化；圖3～圖9同。

圖3　整魚(A)和去內臟魚(B)在0 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.3　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 0 ℃

圖4　整魚(A)和去內臟魚(B)在4 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.4　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 4 ℃

圖5　整魚(A)和去內臟魚(B)在10 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.5　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 10 ℃

圖6　整魚(A)和去內臟魚(B)在15 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.6　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 15 ℃

圖7　整魚(A)和去內臟魚(B)在20 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.7　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 20 ℃

圖8　整魚(A)和去內臟魚(B)在25 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.8　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 25 ℃

圖9　整魚(A)和去內臟魚(B)在30 ℃貯藏過程中8種生物胺含量的變化Fig.9　Changes of eight biogenic amines content in whole mackerel(A)and gutted mackerel(B)stored in 30 ℃

由圖2可知,-18 ℃貯藏的6個月中,4種主要的生物胺含量變化都很小。在整魚樣品中,尸胺含量增長最快,由2.44 mg/kg增長至23.47 mg/kg。其次為腐胺由1.88 mg/kg增長至15.98 mg/kg。再次為組胺,從1.93 mg/kg增長至13.45 mg/kg,未超過國家規定的高組胺魚類中組胺400 mg/kg的安全限量。增長最慢的為酪胺,最終積累量僅為9.73 mg/kg。去內臟樣品和整魚樣品中4種主要生物胺變化類似,腐胺、尸胺、組胺和酪胺的最終積累量分別為13.257、20.89、10.349、7.776 mg/kg,比整魚樣品略低,差異不顯著(p>0.05)。由以上分析可知,-18 ℃下,鮐魚中生物胺含量變化緩慢,這可能是由于在冷凍條件下,只有極少部分微生物活動,而且新陳代謝極其緩慢。

由圖3可知,0 ℃貯藏時,在整魚樣品中,不同種類生物胺隨貯藏時間的變化各有不同。在4種主要的生物胺中,尸胺的增長速率最快,從第6 d時開始明顯增加,最終的積累量為505.34 mg/kg。其次為組胺,在12 d的貯藏過程中,最后一天的時候超出國家規定的高組胺魚類中組胺400 mg/kg的安全限量,含量為407.52 mg/kg。腐胺和組胺的含量增長基本同步,最終的積累量為376.24 mg/kg。酪胺的含量增長也較明顯,由5.98 mg/kg增長至313.66 mg/kg。在去內臟魚中,4種主要的生物胺含量增長比整魚慢,差異顯著(p<0.05)。尸胺依然增長最快,由2.41 mg/kg增長至271.64 mg/kg,其余生物胺增長速率由快至慢依次為酪胺、組胺和腐胺,分別由5.69 mg/kg增長至207.27 mg/kg,2.28 mg/kg增長至190.99 mg/kg,2.88 mg/kg增長至158.31 mg/kg。組胺在整個貯藏過程中始終沒超過國家安全限量。由此可見低溫和去內臟能有效減緩生物胺的積累。

由圖4可知,4 ℃貯藏時,生物胺的變化情況和0 ℃貯藏時有所不同,生物胺的增長速率明顯升高。其中,組胺在貯藏期內含量增長最明顯,并且從第3 d開始迅速增長,在第5 d時超過國家規定的安全限量,最終組胺含量由3.79 mg/kg增長至821.32 mg/kg。其次,尸胺含量由2.67 mg/kg增長至400.47 mg/kg。酪胺和腐胺也有較明顯的變化,分別由10.62 mg/kg增長至293 mg/kg,2.33 mg/kg增長至160.36 mg/kg,而在去內臟魚中,4種主要的生物胺增長趨勢和整魚樣品基本類似,但增長速率變慢,腐胺、尸胺、組胺最終積累量減少程度分別為2.4%、0.23%、15.86%、34.83%,整個貯藏過程具有顯著性差異(p<0.05)。組胺在第6 d超過國家規定的安全限量,最終積累量為691.06 mg/kg。尸胺、腐胺和酪胺的最終積累量分別為399.56、156.51、190.93 mg/kg。

由圖5可知,10 ℃條件下貯藏7 d時,整魚和去內臟鮐魚中生物胺的變化趨勢和4 ℃條件下貯藏基本一致,組胺的含量超過國家規定的安全限量的時間分別為4 d和5 d。去內臟鮐魚中4種主要生物胺的增長速率依然比整魚慢,最終的積累量也比整魚少(p<0.05)。但是整魚和去內臟魚在貯藏的過程中組胺、尸胺、酪胺和腐胺的最終積累的含量卻都比4 ℃條件下高,這可能是由于隨著溫度的升高,微生物的種類和數量逐漸增加。據報道[18],產生生物胺的微生物主要可以分為嗜冷菌和嗜溫菌兩大類,因此,在0、4和10 ℃下活動的微生物可能大部分是嗜冷菌。

由圖6可知,15 ℃貯藏時,4種主要的生物胺含量增長明顯比10 ℃貯藏時快了許多。其中,組胺和尸胺的變化最劇烈。在整魚樣品中,組胺超過國家規定的安全限量的時間為48 h,最終積累量為2921.12 mg/kg,尸胺由2.16 mg/kg增長至744.99 mg/kg。在去內臟魚中,組胺超過國家規定的安全限量的時間依然為48 h,但最終積累量比整魚低,含量為2181.89 mg/kg,尸胺由2.21 mg/kg增長至670.95 mg/kg,依然比整魚低,并且差異顯著(p<0.05)。

由圖7可知,當溫度達到20 ℃時,整魚和去內臟鮐魚的生物胺含量的積累速度比4 ℃和10 ℃升高了1倍以上,貯藏了3 d的大部分生物胺含量超過了4 ℃和10 ℃下7 d的積累量。整魚和去內臟鮐魚中組胺超過國家規定的安全限量的時間分別為36 h和48 h。組胺的最終積累量分別為2879.01 mg/kg和2758.53 mg/kg。腐胺、尸胺和酪胺含量的增長也十分迅速,最終含量分別為354.29、1197.66、380.84 mg/kg以及324.38、820.89、282.28 mg/kg。由此看出,去內臟可以減緩生物胺的增長,而溫度對生物胺的變化影響非常大。據Rahman M S等[19]研究,冰藏期間,魚中的組胺含量增加緩慢,當貯藏溫度為8 ℃時,組胺產生速度明顯增快,而當溫度達到20 ℃時,1 d內組胺量就增加了10多倍,這與本研究的結果基本一致。

由圖8和9可知,當溫度達到25 ℃和30 ℃時,僅1 d的時間,整魚和去內臟鮐魚中4種主要的生物胺的含量就達到了極高的濃度,其中,25 ℃下,整魚和去內臟鮐魚中腐胺、尸胺和酪胺最終的積累量分別為288.142、672.784、268.844 mg/kg,212.345、525.217、201.345 mg/kg,組胺含量在15 h超過了國家規定的安全限量,1 d后最終積累量分別為3344.91、2413.07 mg/kg,去內臟鮐魚比整魚少(p<0.05)。30 ℃下,腐胺、尸胺和酪胺最終的積累量分別為500.41、1321.41、559.70 mg/kg,441.04、965.69、483.08 mg/kg,整魚和去內臟鮐魚中組胺含量在14 h超過了國家規定的安全限量,1 d后最終的積累量分別為3996.56、3111.049 mg/kg,去內臟鮐魚依然比整魚少(p<0.05)。由以上可知,整魚在25 ℃和30 ℃貯藏1 d后組胺含量是國家規定的安全限量的將近10倍。因此,在較高溫度下放置一段時間的紅肉魚再食用將對人體產生非常大的傷害。

2.5　不同溫度貯藏和去內臟對總生物胺變化的影響

由圖10～圖17可知,在這不同溫度條件下貯藏,整魚的總生物胺含量增長趨勢都是大于去內臟魚的(p<0.05)。據Silla Santos M H[20]報道,攝入總生物胺含量超過1000 mg/kg會嚴重危害人體健康,而在本實驗8個不同溫度貯藏下,-18 ℃貯藏時,整魚中最終生物胺的積累量僅僅為81.14 mg/kg,去內臟魚生物胺最終積累量僅僅為69.59 mg/kg,由此可見,冷凍條件下生物胺積累量十分緩慢,去內臟依然可以延緩生物胺生成。而對于其它7個溫度,整魚和去內臟魚最終的總生物胺含量都遠遠超過了1000 mg/kg,但在-18、0、4、10、15、20、25、30 ℃貯藏條件下去內臟魚的總生物胺含量比整魚最終積累量少(p<0.05),減少程度分別為14.22%、39.79%、13.83%、29.06%、22.60%、13.56%、26.13%、21.26%。其中,在0、4、10、15、20、25、30 ℃貯藏條件下,整魚中總生物胺含量超過1000 mg/kg的時間分別為12、5、4 d和48、48、20、14～16 h。去內臟魚中總生物胺含量超過1000 mg/kg的時間分別為12、7、5 d和48、48、20、14～16 h。通過以上分析可以看出,去內臟可以延緩鮐魚中生物胺的增長趨勢,減少生物胺的積累量,并且溫度是影響鮐魚中生物胺變化的主要因素之一,這與國內外許多學者的報道相符。

圖10　整魚和去內臟魚在-18 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.10　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in -18 ℃

圖11　整魚和去內臟魚在0 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.11　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 0 ℃

圖12　整魚和去內臟魚在4 ℃條件下總生物胺的變化Fig.12　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 4 ℃

圖13　整魚和去內臟魚在10 ℃條件下總生物胺的變化Fig.13　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 10 ℃

圖14　整魚和去內臟魚在15 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.14　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 15 ℃

圖15　整魚和去內臟魚在20 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.15　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 20 ℃

圖16　整魚和去內臟魚在25 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.16　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 25 ℃

圖17　整魚和去內臟魚在30 ℃條件下總生物胺含量的變化Fig.17　Changes of biogenic amines content in whole and gutted mackerel stored in 30 ℃

Jinadasa等[21]研究了金槍魚在0、4、7 ℃下貯藏時組胺等一些生物胺的變化,發現4 ℃以下貯藏時,組胺變化緩慢。蔣倩倩等[22]在研究冰藏鮐魚中組胺時發現,鮐魚整魚的組胺產生較快,去內臟減緩了鮐魚中組胺產生速度。胡家偉[23]在研究3種魚在-30、4、25 ℃貯藏條件下組胺的變化時發現,在貯藏過程中溫度越高越有利于組胺的產生。Chong等[24]研究鮐魚在室溫(25～29 ℃)和冰溫(0 ℃)下生物胺的變化情況,發現鮐魚在室溫下貯藏16 h后,組胺含量達到363.50 mg/kg,冰藏16 h后鮐魚中組胺含量僅有8.31 mg/kg。Hu等[25]比較了藍圓鲹在不同貯藏溫度下組胺含量的變化,發現室溫貯藏時組胺含量明顯高于低溫貯藏。Li等[26]發現鯽魚冰藏時總生物胺的積累量明顯低于4 ℃貯藏時總生物胺的積累量。此外,除了微生物和貯藏溫度,影響生物胺變化的還有許多其他因素[27-28],如添加劑,貯藏過程中的外部環境中的pH、含氧量等,還有水產品種類、鹽類含量等。

3　結論

鮐魚中主要的生物胺為組胺、腐胺、尸胺、酪胺。隨著溫度的升高,鮐魚中4種主要生物胺和總生物胺的增長速率和含量迅速增加。其中,組胺超過國家規定的400 mg/kg的安全限量的時間和總生物胺超過1000 mg/kg的時間也隨著溫度的升高而縮短。去內臟可以延緩鮐魚中4種主要生物胺的增長趨勢,減少總生物胺的積累量。因此,在鮐魚的運輸和貯藏過程中,如果能夠全程保持低溫冷凍,就基本可以保證消費者安全食用鮐魚,并且在貯藏之前進行一定的預處理,如去內臟,更可以有效延緩生物胺的生成。

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