美洲鰣雄性生殖細胞冷凍保存及移植

吳栩靈 洪孝友 李凱彬 朱新平 徐紅艷

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所， 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室， 廣州 510380；2. 上海海洋大學水產與生命學院， 上海 201306)

生殖細胞是生物體中攜帶物種遺傳信息并能傳遞到子代的一類細胞。其中， 原始生殖細胞(Primordial germ cells， PGCs)、精原干細胞(Spermatogonial stem cells， SSCs)等都具有一定的細胞全能性， 既能增殖， 也可進一步分化而產生配子。因此， 一直以來關于生殖細胞的培養、基因編輯及移植等技術的研究發展應用備受國內外學者的關注，而且生殖細胞相關的操作技術在鼠(Mus musculus)、雞(Gallus domesticus)及某些模式生物中得到了充足的發展與應用[1，2]。然而， 生殖細胞的培養及移植等技術研究在經濟魚類中的發展應用， 還需要大量的探索； 另一方面， 經濟魚類， 特別是一些大型名貴魚類的組織材料來源嚴重稀缺， 阻礙了這些物種生殖細胞相關研究工作的開展。由此可見， 高效的生殖細胞凍存技術， 是進一步開展水產動物生殖細胞工程育種研究的細胞資源保障和技術基礎， 同時也是建立物種資源庫最直接有效的方法。

目前， 在魚類、鳥類及哺乳動物中都有不少關于生殖細胞凍存的研究[3—5]。國外學者對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[6，7]、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[8]、細鱗鮭(Brachymystax lenok)[9]等魚類生殖細胞的凍存進行了相關研究。國內研究人員主要進行了魚類精子的冷凍保存研究， 如花鱸(Lateolabrax maculatus)[10]、黃姑魚(Nibea albiflora)[11]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[12]等魚類精子的冷凍保存； 也有學者對達氏鱘(Acipenser dabryanus)的精巢細胞[13]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)性腺細胞[14]進行了冷凍保存分析， 并取得了一定的研究進展。迄今為止， 關于細胞凍存的研究主要是對分離細胞或培養細胞進行的冷凍保存分析。而最近，Lee等[6]首次將虹鱒的整個精巢組織進行了冷凍保存， 發現凍存的A型精原干細胞(Type A spermatogonia， ASGs)在凍存728d后仍能具有細胞活力。而且有學者將西伯利亞鱘早期生殖細胞凍存復蘇后移植到西德鱘(Acipenser ruthenus)體內， 在移植后90d發現受體中的供體細胞成功增殖， 證明長時間凍存的生殖細胞仍具有分裂增殖活性， 可用于細胞移植研究[8]?？傊?， 生殖細胞凍存技術無論在物種資源保護， 還是在生物遺傳育種研究中均具有非凡的意義。特別是在野生資源的采集過程中， 獲得的樣品非常隨機， 性成熟或性未成熟個體都有可能，如果能研發一種操作簡單且能同時保存精原干細胞和精子的冷凍保存技術， 將對野生物種資源的保護更具實踐意義。

美洲鰣(American shad，Alosa sapidissima)， 隸屬于鯡形總目(Clupeomorpha)、鯡形目(Clupeiformes)、鯡科(Clupeidae)、鰣亞科(Alosinae)、西鯡屬(Alosa)。美洲鰣是溯河產卵洄游性魚類的典型代表， 原本分布于加拿大的圣勞倫斯海灣(Gulf of St. Lawrence)到的美國佛羅里達州的約翰河(St.Johns River)一帶的河流和海洋， 其后被各地廣泛引種[15，16]。在21世紀初期， 美洲鰣引種到中國， 隨后其人工繁殖得到迅速發展[17]。美洲鰣與中國鰣魚(Macrura reevesiiRichardson)同屬鰣亞科， 兩者除了外形相似， 在營養組成和口感風味上也接近， 因此美洲鰣成為中國鰣魚的良好替代養殖對象。自美洲鰣引入我國以來， 不少學者進行了相關研究，包括生物學特征[18]、早期發育[19]、人工繁殖[20]、養殖[21]及應激反應[22]等， 但研究工作僅限于組織學、形態學和生理學水平， 而分子細胞水平的生殖生理學研究還非常欠缺。更重要的是， 美洲鰣是溯河產卵洄游性魚類的典型代表之一， 其采取一年一次產卵繁殖或一年多次產卵繁殖等多種生殖繁育策略， 為解析生殖細胞在魚類洄游過程中的發育、分化及成熟等提供了獨特的研究模型。

因此， 本研究主要進行了美洲鰣雄性生殖細胞的冷凍保存研究。對美洲鰣精巢組織或分離細胞進行了長時間的冷凍保存， 然后快速解凍復蘇并統計各期生殖細胞的存活率； 同時， 將凍存復蘇后的美洲鰣生殖細胞進行了異種移植分析: 組織塊凍存復蘇后， 分離得到的細胞經熒光標記后移植到斑馬魚(Danio rerio)仔魚中， 以進一步檢驗凍存生殖細胞的活性。本研究結果為美洲鰣及其他洄游性魚類的生殖細胞培養和應用研究提供了前期基礎， 為將來進行魚類種質資源的保護研究奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的美洲鰣均采自深圳市東方?？萍加邢薰镜拿乐搛堭B殖場。于2016年7月取2齡美洲鰣雄魚4條， 體重580.0—628.0 g。從泄殖腔剪開美洲鰣腹部， 采集精巢組織， 用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution， PBS)稍微清洗， 然后放入含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum， FBS)的PBS中，將樣品帶回實驗室后進行后續處理。細胞移植的受體為轉基因斑馬魚Tg(nano3:yfp)(未發表數據)，其PGCs盡管用黃色熒光蛋白標記， 但仍可用綠色熒光波長觀察， 因此本研究用綠色熒光觀察拍照，PGCs標記信號呈綠色。斑馬魚在正常條件下飼養，產卵后收集胚胎孵化， 孵化出苗后第1天(1 dph，days post hatching)即用作細胞移植受體。實驗所用試劑有PI碘化丙啶(Life)， Hoechst33342(MP Biomedicals)， 細胞篩(BD-Falcon)， 胎牛血清和DMEM購自Gibco公司， 二甲基亞砜DMSO、PKH26試劑盒購自Sigma公司， 膠原酶I及胰酶均購自Worthington公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

分離細胞凍存將所取精巢組織剪碎后， 用1 mg/mL膠原酶I， 28℃水浴消化約30min， 加0.25%胰酶繼續消化約30min。加入1/10體積牛血清終止消化反應， 用細胞篩過濾并收集細胞， 然后用凍存液重懸細胞并凍存管分裝， 慢速降溫至–80℃保存1—2d， 然后將樣品轉移到液氮中進行長期保存。

組織塊凍存所取精巢組織剪碎至1 mm3左右， 離心去上清， 凍存液重懸組織， 凍存管分裝及凍存(方法同上)。

樣品復蘇樣品凍存250d后， 從液氮中取出并迅速轉移到37℃中水浴進行解凍復蘇。細胞或組織凍存樣品離心后用PBS清洗2遍， 用DMEM重懸備用。凍存復蘇的組織塊用胰酶/膠原酶消化解離成單個細胞， PBS清洗1遍， 用DMEM重懸細胞備用。

細胞存活率檢測將待檢測的細胞懸液與等體積的2×染液混合， 使其終濃度為: 5 μg/mL Hoechst33342， 2 μg/mL PI， 室溫下避光染色10min；PBS清洗兩次； 取100—200 μL樣品， 轉移到8孔腔室蓋玻片， 共聚焦顯微鏡下觀察并拍照， 按照染色結果統計細胞存活率， 每個樣品重復3次計數， 實驗重復至少3遍。

精子存活率檢測取適量待測細胞懸液并稀釋到合適濃度， 用蔡司倒置顯微鏡(Zeiss， Axio Observer Z1)觀察、拍攝精子活性并統計精子存活率。另外取少量細胞懸液， 用乙醇處理使精子死亡作為對照， 以消除拍攝精子活動時， 因任何外界因素引起樣品震動而導致的誤差。

細胞移植將組織塊凍存樣品所得細胞懸液用PKH26染色， 牛血清終止染色， PBS清洗兩遍備用。觀察分析受體斑馬魚的內源PGCs和植入供體細胞的發育及分布。移植后斑馬魚仔魚在正常條件下飼養， 在細胞移植后3h、3d和5d， 通過熒光顯微鏡觀察植入細胞在受體內的存活及整合情況。同時設未移植斑馬魚仔魚為空白對照組， 同樣條件飼養及觀察。用尼康熒光體視鏡(Nikon，SMZ1270)及奧林巴斯CCD(Olympus， DP73)進行觀察和拍照。

2 結果

2.1 兩種凍存方法下的細胞存活率

Hoechst33342與PI共染， 正常細胞核能夠染上Hoechst33342而呈藍色。同時， 由于PI不能進入細胞膜完整的正常細胞中， 所以活細胞表現對PI拒染，而壞死細胞核可被PI染色[23]。因此， 活細胞染色結果為藍色+淺紅色或無(Hoechst33342+/PI–)， 死細胞為藍色+亮紅色(Hoechst33342+/PI+)。在樣品染色后， 在熒光顯微鏡下觀察， 按照核體積的大小及形態， 將細胞粗略分為精原干細胞、精母細胞、精細胞及其他細胞三種規格(圖 1)。初步統計發現， 分離細胞凍存復蘇后的細胞懸液中， 精原干細胞、精母細胞、精細胞及其他細胞所占比例分別為11.57%、7.55%和80.88%； 而組織塊凍存復蘇后細胞中， 幾種細胞的含量為10.16%、9.65%和80.19%， 兩者的細胞構成比例無明顯區別。熒光觀察拍照后統計各種細胞的存活率(表 1)。在本實驗條件下， 分離細胞凍存方法所得的細胞中， 精原干細胞存活率為(34.94±4.36)%、精母細胞存活率為(39.41±4.94)%、精細胞及其他細胞的存活率為(41.00±8.93)%； 在組織塊凍存方法所得的細胞中， 精原干細胞存活率為(53.53±12.87)%、精母細胞存活率為(52.84±10.92)%、精細胞及其他細胞的存活率為(48.67±11.13)%。對所得結果進行T檢驗， 結果顯示兩種凍存方法處理的精原干細胞存活率存在極顯著性差異(P＜0.01)， 精母細胞存活率存在顯著性差異(P＜0.05)， 而精細胞及其他細胞存活率在2種方法中無顯著性差異(表 1)。綜上所述， 組織塊法凍存復蘇獲得的精原干細胞和精母細胞的存活率均高于分離細胞凍存法， 尤其是精原干細胞的存活率， 組織塊法的顯著高于分離細胞的； 而對于精子細胞及其他細胞的存活率， 2種凍存方法的效果相近。因此， 在本實驗條件下， 美洲鰣雄性生殖細胞在酶消化法分離細胞前， 將組織塊直接凍存的效果比細胞分離后凍存的好， 特別是組織塊法凍存復蘇的精原干細胞和精母細胞的存活率更高。

圖 1 美洲鰣雄性生殖細胞的核染色Fig. 1 The nuclear staining of male germ cells in American shad

2.2 兩種凍存方法下的精子存活率

鏡檢 2種凍存方法所得的細胞懸液中， 均有大量游動的精子。在顯微鏡下因光線而呈現不同顏色； 而酒精處理后精子均死亡無游動， 大量精子粘結成團， 沉降到同一平面而顏色基本相同。在解凍復蘇后， 分離細胞凍存法所得精子存活率為(87.12±2.56)%， 組織塊凍存法所得精子存活率為(93.83±0.62)% (表 1)。對2種方法所得結果進行T檢驗， 結果顯示2種凍存方法處理的精子存活率存在極顯著性差異(P＜0.01)。因此， 在本實驗條件下，美洲鰣精子在酶消化法分離細胞前， 將組織塊直接凍存的效果比細胞分離后凍存的好， 精子存活率更高。同時證明， 本實驗條件下的凍存液及降溫方法可用于美洲鰣精子凍存。

2.3 組織塊凍存處理后細胞移植情況

將組織塊凍存處理后的細胞復蘇后用PKH26染色， 可使細胞在熒光顯微鏡下呈紅色， 而黃色熒光標記的斑馬魚受體內源生殖細胞在綠色熒光下呈綠色信號， 可與供體細胞區分開來(圖 2)。移植3h后觀察， 供體細胞被注射到斑馬魚受體的生殖嵴附近， 共移植斑馬魚苗34條， 空白對照30條， 移植后觀察結果如表 2所示。移植后第3天觀察， 斑馬魚受體累計死亡數為19條(55.88%)， 存活的15條受體(44.12%)能在顯微鏡下觀察到供體細胞， 且定位在受體生殖嵴， 與受體內源生殖細胞分布在同一區域；有個別受體中的供體細胞遷移到腹部或尾部， 證明所移植的細胞有一定遷移能力。而空白對照組存活數為24條(80.00%)。移植后第5天觀察， 斑馬魚受體累計死亡數為21條(61.76%)， 存活13條(38.24%)，此時3條受體能觀察到供體細胞和受體內源生殖細胞定位于同一區域， 且有些供體細胞遷移到腹部或尾部； 4條受體能觀察到供體細胞分布在腹部和尾部， 而未分布在受體內源生殖細胞的區域； 6條受體中未能觀察到供體細胞， 與空白對照組的觀察結果一致。而空白對照組存活數為23條(76.67%)， 此時發現斑馬魚有自發紅色熒光， 但仍能與供體細胞的紅色熒光區分開來。移植實驗證明， 此實驗條件下將美洲鰣成熟精巢剪碎后進行組織塊直接凍存，解凍復蘇后所得雄性生殖細胞仍可以用于異種移植。

表 1 美洲鰣生殖細胞存活率Tab. 1 The germ cells viability of American shad

圖 2 美洲鰣雄性生殖細胞移植到斑馬魚仔魚Fig. 2 American shad male germ cells transplanted into zebrafish larvae

表 2 美洲鰣雄性生殖細胞移植情況Tab. 2 Transplantation of American shad male germ cells

3 討論

3.1 不同凍存方法對精巢細胞存活率的影響

生殖細胞在冷凍保存復蘇后的存活率受多種因素影響， 包括樣品處理、凍存液的選擇、凍存溫度、凍存時間、降溫及復蘇速率等。常見的細胞凍存方法都是將分離或培養的游離細胞進行凍存及復蘇， 再用于其他實驗研究。而在本研究中， 除了將分離細胞進行凍存， 還進行了精巢組織塊的直接冷凍保存， 以探索有效保存美洲鰣精巢細胞的方法。更重要的是， 本研究中采用的凍存方法能同時保存各期生殖細胞， 優于只能進行單一細胞保存的傳統方法， 即精子保存[24]或精原干細胞保存[25]。在此， 比較分析了2種方法的凍存效果， 結果表明組織塊凍存法， 凍存復蘇獲得的精原干細胞和精母細胞的存活率更高， 而精細胞及其他細胞存活率無顯著性差異。與此類似， 其他研究組報道的西伯利亞鱘性腺組織和性腺細胞2種凍存方法的比較研究， 表明組織凍存復蘇后分離獲得的細胞中， 包含的死細胞較少[8]。在斑馬魚PGCs凍存研究中， Higaki等[3]比較了不同預處理液和玻璃化凍存保護劑的冷凍效果， 最適冷凍條件下斑馬魚PGCs的存活率可達81%， 而且復蘇后的PGCs仍能進一步分化而產生功能性配子， 證明了凍存的生殖細胞可用于細胞移植研究。另外， 在細胞生物學研究中， 一般采用臺盼藍染色法進行細胞活性的檢測分析[7]。但有研究發現臺盼藍染色法不適合于某些細胞的活力測定， 如朱冬發等[26]在檢測三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)精子的活力時采用臺盼藍染色無法清晰辨別死、活精子； Stoll等[27]測定人肺微血管內皮細胞(Human pulmonal endothelial cell， HPMEC)在凍存后復蘇的細胞存活率， 認為臺盼藍染色會使結果偏高。而有研究表明Hoechst33342/PI雙染可簡單快捷地區分正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞， 且特異性高， 簡單易行[23]。因此， 本研究采用Hoechst33342與PI共染細胞核的方法來檢測生殖細胞存活率。美洲鰣細胞經Hoechst33342和PI染色后， 各期生殖細胞核均清晰可見， 大小分明， 且Hoechst33342使全部細胞染色而PI能明顯將死活細胞區分開來(圖1)， 證明細胞核Hoechst33342/PI雙染法適合于進行凍存復蘇的美洲鰣生殖細胞存活率的檢測。

3.2 不同凍存方法對精子存活率的影響

精子凍存也是常見的種質資源保存方法， 此前已有研究者進行了美洲鰣精子凍存的研究分析。例如， 王明華等[24]用魚用任氏液和甲醇配成凍存液，精液稀釋后采用三步法降溫并于液氮中凍存， 60d后復蘇發現精子存活率達80%， 同時凍存液的甲醇比例、冷凍前平衡時間及精液稀釋比均對保存效果有不同程度的影響。與傳統的精液凍存方法不同的是， 本研究通過直接凍存成魚精巢組織以進行精子的冷凍保存， 凍存步驟簡單易行， 重要的是本凍存方法所得精子存活率達93.83%， 且樣品凍存時間長達～250d， 凍存精子的存活率仍遠高于已有的報道結果[24]。此結果的獲得， 可能是因為樣品處理方法、凍存液成分和降溫程序等優化所致， 但具體原因仍需進一步研究分析來驗證。研究所用DMSO為常見的凍存保護劑， 在黃姑魚[11]、大黃魚[12]和黑鯛(Sparus macrocephalus)[28]的精子凍存實驗中， 均發現DMSO濃度為10%時凍存精子的質量最好， 其中黃姑魚精子激活率達85.25%， 黑鯛凍精激活率達92.91%， 特別是10% DMSO的條件下， 大黃魚凍精復蘇后其活力、DNA損傷和線粒體及細胞膜結構保持完整性的精子比例， 與鮮精相比無明顯差異。因此， 本研究中凍存液DMSO濃度為10%， 但進行美洲鰣生殖細胞凍存的最佳濃度還需另行驗證。

3.3 冷凍保存精巢細胞的應用潛能

凍存復蘇的細胞可進一步用于細胞培養、基因編輯及細胞移植等研究中， 因此， 有效的細胞凍存方法是物種資源保存研究中的重要技術。在魚類中， 已有研究報道， 將凍存復蘇的早期生殖細胞成功移植到異種不育受體中， 使受體產生供體細胞來源的功能性配子[8]。在研究中， 發現組織塊凍存法， 獲得的精原干細胞存活率更高， 更適合于進行生殖細胞的種間移植。細胞植入受體5d后仍能在斑馬魚受體內檢測到供體細胞， 證明凍存復蘇的細胞依舊具有增殖及發育活性， 而且具有一定的遷移整合到受體性原基的能力。與此類似， Lee等[6]將虹鱒精巢組織進行了凍存， 解凍后將A型精原干細胞移植到同種三倍體魚中也能獲得供體來源的配子。

綜上所述， 本文進行了美洲鰣精巢細胞的冷凍保存、復蘇、活性檢測等技術的研究， 發現組織塊凍存方法所得到的細胞存活率更高， 尤其是早期生殖細胞的成活率比較高， 更適合于進一步進行細胞移植研究。此外， 組織塊凍存法由于樣品前期處理簡便， 更適合于野外資源的采集與保護。但美洲鰣生殖細胞的最適凍存條件及移植效果等需要更進一步的長期觀察及研究才能確定。本研究結果為將來開展水產動物生殖細胞工程育種及物種種質資源保護等研究奠定了技術基礎。

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