時差成像系統挑選優質胚胎對IVF-ET妊娠結局的改善作用

梁泳娜 梁見弟 陳燕鋒 劉志剛

廣東省東莞市人民醫院生殖醫學科，廣東東莞 523018

世界衛生組織調查顯示，全世界發達國家約8%～15%的夫婦受不孕癥困擾，一些發展中國家的不孕癥發生率甚至可達35%以上，且不孕癥發生率呈逐年上升趨勢[1]。體外授精-胚胎移植（IVFET）是常用的輔助生殖技術，通過促排卵和體外受精可獲得多個胚胎，優質胚胎的選擇不僅對妊娠率的提高有著很大幫助，也能改善妊娠結局。時差成像系統（time-lapse imaging，TLI）作為非侵入胚胎評估系統，評估過程不影響胚胎的發育，并能獲得連續的胚胎動力學參數，從而準確評估其發育潛能[2]。目前國內在胚胎形態動力學尚未建立一個較為科學的評估體系用于挑選最具妊娠潛力的胚胎，本研究將TLI技術應用于IVF-ET中，觀察其臨床應用價值。對于TLI采用的WOW（well-of-the-well）集簇培養方式是否對胚胎發育潛能有影響，結局是否優于傳統培養方法，國內鮮少有報道。本研究比較兩種培養方法的胚胎發育情況，為TLI技術的安全性尋求依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析在東莞市人民醫院生殖中心2015年8月～2017年5月接受IVF-ET治療的不孕癥患者98例。隨機分組，實驗組（A組）為47例常規IVF治療患者，所有胚胎經TLI選擇并移植。同期51例常規IVF治療患者采用傳統培養方法，并在Day3經形態學標準挑選胚胎進行移植為對照組（B組）。兩組患者資料與受精情況類似，具有可比性（表1）。同期另選取共478枚胚胎，同一患者胚胎隨機分為兩組，一組采用TLI集簇培養（C組），另一組采用微滴單胚胎常規方法培養（D組）。納入標準：女方年齡＜40歲；常規IVF周期；周期數＜2；獲取卵子數6～16枚；常規長方案促排卵；卵泡刺激素（FSH）≤12IU/L。排除子宮內膜疾病或其他生殖器官疾病者；男性因素所致不孕者；先天性疾病者和全胚冷凍者。

1.2 方法

1.2.1 時差成像系統 本研究使用Primo Vision（Vitrolife）時差成像系統，圖像采集頻率為7min/次，每小時進行一次7個等焦距平面掃描，連續培養6d。培養采用9孔WOW培養皿，各孔均有位置標記。

1.2.2 胚胎培養 全部患者采用本中心常規促排方案，注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）后36h行卵泡穿刺術，將獲得卵冠丘復合物（OCCC）放于G-IVF plus（Vitrolife）等待受精，受精時間為注射hCG 39h。受精6h后去除顆粒細胞，A組和C組胚胎移入WOW9孔培養皿，培養液滴為70μL經（37℃ 6% CO2，5% O2）平衡過夜的 G-1 plus。根據胚胎發育的動力學參數與卵裂模式選擇D3胚胎移植，剩余胚胎繼續置于平衡過夜的G-2 plus培養至D6結束。B組和D組胚胎移入含25μL G-1 plus微滴中進行單胚胎常規培養。

1.2.3 胚胎發育時間參數與妊娠判定 時間參數：將IVF受精時間記為”0”點，原核消失時間（tPNF），發育至2細胞時間為t2，發育至3細胞時間為t3，以此類推為t4、t5。2細胞發育至3細胞持續時間為cc2，3細胞發育至4細胞同步時間為s2。各時間點的命名方法參照Ciray[3]標準。依據伊斯坦布爾共識，卵裂期胚胎評估參考Peter[4]標準，囊胚期胚胎評估參考Gardner[5]標準。優質胚胎：細胞數7 ～ 9個，碎片＜10%，大小均一；Day3可利用胚胎：細胞數≥6個，碎片＜25%，大小均一。優質囊胚：內細胞團和滋養層細胞不含C。妊娠判定：D3移植2枚胚胎，2周后檢測血hCG，6周進行B超檢查，可見孕囊或胎心搏動即為臨床妊娠。

1.3 觀察指標

分析比較實驗組（A組）與對照組（B組）的D3優質胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產率的差異。采用Analyzer圖像分析軟件比較實驗組（A組）種植胚胎與未種植胚胎的tPNF，t2，t3，t4，t5，cc2，s2。比較C組與D組的來源于2PN的胚胎的卵裂率、D3優質胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率的差異。

1.4 統計學分析

采用SPSS20.0軟件處理本研究所有數據，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 兩組患者一般資料比較（± s）

表1 兩組患者一般資料比較（± s）

注：P均＞0.05

組別 女方年齡（歲） BMI（kg/m2） 基礎FSH（IU/L） 平均獲卵數 平均移植胚胎數A組 31.2±4.3 22.42±2.38 7.2±1.8 11.7±6.7 1.95±0.46 B組 31.1±4.8 22.68±3.02 7.3±1.9 12.3±7.6 1.92±0.45

表2 兩組患者妊娠結局比較[%（n/n）]

表3 時間參數與胚胎發育潛能的關系分析（± s）

表3 時間參數與胚胎發育潛能的關系分析（± s）

組別 n tPNF t2 t3 t4 t5 cc2 s2種植胚胎 33 23.25±2.9 24.02±0.21 33.68±2.58 35.24±2.69 47.32±5.47 9.58±2.01 0.81±0.14未種植胚胎 45 25.38±2.27 26.41±2.08 34.21±2.41 36.84±4.14 48.89±5.36 12.36±3.17 3.52±4.08 t 3.652 6.564 0.931 1.938 0.347 4.423 3.807 P 0.013 0.006 0.354 0.056 0.729 0.021 0.009

表4 胚胎TLI集簇培養與常規培養結果比較[%（n/n）]

2 結果

2.1 兩組患者妊娠結局比較

A組與B組的臨床妊娠率、胚胎種植率、優質胚胎率、早期流產率差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 時間參數與胚胎發育潛能的關系

A組種植胚胎與未種植胚胎相比，tPNF、t2、cc2、s2=t4-t3，差異有統計學意義（P ＜ 0.05），t3、t4、t5差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.3 不同培養方式對胚胎發育潛能的影響

C組與D組的來源于2PN胚胎的卵裂率、D3優質胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率差異均無統計學意義（P＞0.05），見表4。

3 討論

有研究[6]顯示，胚胎在某一時間點的形態及發育狀態與其發育潛能密切相關。臨床大多采用形態評分系統對胚胎潛能進行評估，但是胚胎在移植前的發育是動態的，伴隨胚胎的卵裂，其形態會不斷變化。若未進行動態觀察，則難以獲取精確的卵裂參數。通過胚胎多次移出培養箱雖然能獲取更多發育信息，但頻繁改變胚胎培養環境，不利于胚胎發育。TLI作為非侵入胚胎評估系統，克服了傳統胚胎評分中存在的缺陷，可通過觀察胚胎受精至移植時的連續動態分裂圖像，以及更多的胚胎質量篩選指標，從而提高臨床妊娠率[7]。

現已證明，TLI主要以前3次卵裂時間及卵裂同步性來判斷胚胎的質量[8]。本研究顯示，種植胚胎與未種植胚胎的tPNF、t2、cc2、s2差異有統計學意義（P＜0.05），與相關文獻報道結果相符[9]。說明時間動力學參數可作為胚胎篩選的主要指標。也有學者認為[10]，單憑時間參數進行胚胎挑選會降低準確性。同時應結合胚胎發育前期的卵裂模式和不良事件（碎片、不均卵裂、多核、混合型、非二倍性卵裂、發育停滯、卵裂球融合等）去挑選胚胎，可有效排除靜態評估中判斷為正常卵裂的異常卵裂胚胎[11]。2個胚胎在形態學相似情況下，通過TLI可觀察到不同的發育過程，為臨床選擇優質胚胎提供參考依據，有助于改善臨床妊娠率[12]。在本研究中，A組臨床妊娠率、胚胎種植率、優質胚胎率較B組有一定的提高，可能與應用TLI排除了一些前期不良胚胎發育事件有關，但是兩組差異無統計學意義，說明常規胚胎評分同樣具有一定的科學性和有效性，也可能與本研究例數較少有關，需要更多研究進一步探討TLI對IVF-ET妊娠結局的影響。有研究表明[13]，通過卵裂模式對胚胎進行篩選，可以降低早期流產率，也與本實驗結果相符：實驗組的早期流產率明顯降低（3.33%vs15.38%）。

盡管TLI與傳統培養相比有著很多優勢，然而TLI的安全性也受到廣泛關注。作為一種新的醫療技術，此系統與傳統觀察方法不同的是攝像觀察的次數與光源。長期高頻率每隔7分鐘一次的拍攝曝光，550nm波長的短波可見光（200～700nm）可能對胚胎發育有害。也有學者認為[14]，總光源暴露的量遠遠低于倒置顯微鏡的光線輻射：primo vision曝光時間為100ms，以每隔7min拍攝一次計算，每枚胚胎在連續3d的培養中可獲得617張圖像，總的曝光時間為61.7s，僅相當于傳統曝光時間的1/3。傳統的觀察方法在3d的觀察中，胚胎暴露在倒置顯微鏡光源的時間總計平均為2～3min。時差系統光源為低強度LED，光強度是傳統顯微鏡光源的1/20，550nm波長避開了抑制胚胎發育光譜范圍，而傳統倒置顯微鏡光源有15%的光譜在550nm以下。在本實驗中，實驗組（A組）與對照組（B組）的優質胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產率差異均無統計學意義（P＞0.05）；另外，為了減少不同周期中患者個體差異，設計同一周期隨機分成兩組（C組和D組），比較TLI的安全性。只選來源于2PN胚胎，其卵裂率、優質胚胎率、Day3可利用胚胎率、 囊胚形成率、優質囊胚率差異均無統計學意義，但C組數據均略高于D組，可能與TLI集簇培養有關。時差成像系統采用WOW集簇培養法，既實現了對每個胚胎的追蹤，獨立監測，又可以讓9個胚胎共享更大體積的培養液。有研究[15]證實，體外培養的胚胎具旁分泌和自分泌效應，這些生長因子相互作用帶來更好的互利培養環境。因而集簇培養能令每個胚胎獲得更佳的發育質量，更利于囊胚形成。本實驗結果與相關研究報道結果相符[16]，提示TLI系統是安全可靠的，可以放心使用。

綜上所述，TLI時差成像系統能夠動態觀察胚胎發育情況，通過時間參數與卵裂模式可判斷胚胎發育潛能，為臨床挑選優質胚胎提供參考，有利于改善臨床妊娠結局。