不同質量卵裂胚來源囊胚凍融移植臨床結局的比較分析

彭姝明，劉海鵬，李蘇萍，楊帆，段麗

(郴州市第一人民醫院生殖醫學中心，郴州 423000)

輔助生殖技術(ART)至今已經經歷了40余年的發展。時至今日，囊胚培養和移植技術已經廣泛應用于臨床，是提升ART成功率的有力手段之一[1-3]。目前，單囊胚移植尤其是選擇性單囊胚移植已成為提高ART成功率并且降低多胎率的常規策略。在單囊胚移植的背景下，如何挑選具有最佳種植潛能的囊胚進行移植以獲得最好的臨床結局是廣大ART工作者面臨的難題。目前形態學評估仍然是挑選囊胚的主要手段。本研究回顧性分析了本中心近年來的單個凍融囊胚移植周期數據，通過對不同質量的受精后第3天(D3)卵裂胚來源的凍融囊胚移植的臨床結局進行比較分析，試圖為選擇性單囊胚移植的囊胚挑選策略提供新的參考。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：回顧性分析郴州市第一人民醫院生殖醫學中心在2018年1月至2020年9月期間進行的單囊胚凍融移植周期。納入標準：單個凍融囊胚移植周期，所有囊胚均來源于IVF正常受精的可利用D3卵裂胚；患者基礎FSH<12 U/L；患者體質量指數正常(18.5 kg/m2

共納入653個單囊胚凍融移植周期。根據囊胚培養來源的D3卵裂胚質量分為優質卵裂胚組(n=445)和非優質卵裂胚組(n=208)。

2.子宮內膜準備方案：(1)激素替代周期：適用于月經不規則的患者。遞增法口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳制藥，德國)，月經第2～4天開始口服4 mg/d，每4 d遞增 2 mg；12 d后B超監測子宮內膜厚度，并檢測血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，酌情調整補佳樂劑量，繼續促內膜生長或者添加孕激素行黃體轉換。當子宮內膜厚度≥7 mm、血清E2≥735 pmol/L、P<3.14 pmol/L時，開始黃體轉換：添加黃體酮針(浙江仙琚制藥)60 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日。開始黃體轉換日定為Day0，于Day5或Day6行囊胚移植。(2)自然周期：適用于月經規律的患者。從月經第11天開始行陰道B超監測排卵，排卵日定為Day0，于Day0開始黃體酮針40 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日，于Day5或Day6行囊胚移植。

3.凍融囊胚的解凍及培養：凍融囊胚移植當天上午進行囊胚的解凍。采用玻璃化復蘇試劑盒(Vitrification VT102，KITAZATO，日本)，將載桿在液氮中取掉套管后拿出，迅速置室溫下解凍液(TS)中1 min，然后分別將囊胚移入稀釋液(DS)中3 min、洗滌液1(WS1)中5 min、洗滌液2(WS2)中5 min，再將囊胚轉入囊胚培養液(G2，Vitrolife-G5系列序貫培養液，瑞典)中觀察評分并行激光輔助孵化，置于三氣培養箱內(37℃、6%CO2、5%O2)培養2 h后移植。

4.胚胎評價標準：(1)卵裂胚：正常受精后D3卵裂球≥4個、碎片<50%者為可利用卵裂胚；D3卵裂球為7～9個、碎片<20%者為優質卵裂胚；(2)囊胚：按Gardner囊胚評分系統評價，本中心規定D5或D6達3BC或3CB及以上級別者為可冷凍囊胚；D5或D6囊胚腔擴張程度4～6期、內細胞團或滋養層評分為A或者B級者為優質囊胚。

5.妊娠判斷標準：囊胚移植后第11天測定血清HCG水平，血清HCG水平>5 U/L為HCG陽性；囊胚移植后4周，超聲檢查見孕囊或見胎心搏動則判定為臨床妊娠。

6.觀察指標：復蘇優質囊胚率=優質囊胚數/復蘇存活囊胚數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=分娩胎兒的周期數/移植周期數×100%。

二、結果

1.囊胚培養及冷凍/復蘇情況：本研究共納入653個單囊胚凍融移植周期。根據囊胚培養來源的D3卵裂胚質量分為優質卵裂胚組(n=445)和非優質卵裂胚組(n=208)。優質卵裂胚組優質囊胚率顯著高于非優質卵裂胚組(P<0.05)；兩組間囊胚冷凍時期和囊胚復蘇率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同質量D3卵裂胚行囊胚培養及冷凍/復蘇情況比較(%)

2.優質囊胚移植周期患者一般情況及臨床結局：移植優質囊胚435個周期，其中來源于D3優質卵裂胚333個周期(優質卵裂胚組)，來自于非優質卵裂胚102個周期(非優質卵裂胚組)。兩組間患者年齡、體質量指數(BMI)、基礎FSH水平、移植日子宮內膜厚度、內膜準備方案比較均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間臨床妊娠率比較無顯著差異(P>0.05)，但優質卵裂胚組的活產率顯著高于非優質卵裂胚組(P<0.05)，而流產率則顯著低于非優質卵裂胚組(P<0.05)(表2)。

表2 不同質量D3卵裂胚來源的優質囊胚移植周期情況比較[(-±s)，%]

3.非優質囊胚移植周期患者一般情況及臨床結局：移植非優質囊胚218周期，其中來源于D3優質卵裂胚112周期(優質卵裂胚組)，來源于非優質卵裂胚組106周期(非優質卵裂胚組)。兩組間患者年齡、BMI、基礎FSH水平、移植日子宮內膜厚度、內膜準備方案比較均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)，優質卵裂胚組活產率顯著高于非優質卵裂胚組(P<0.05)，而流產率則顯著低于非優質卵裂胚組(P<0.05)(表3)。

表3 不同質量D3卵裂胚來源的非優質囊胚移植周期情況比較[(-±s)，%]

三、討論

雖然目前ART技術已日漸成熟，但其成功率并不十分理想。囊胚移植技術是提升ART成功率的有力手段之一，而選擇性單囊胚移植技術則是囊胚移植策略的首選。因此，囊胚的挑選成為影響ART結局的關鍵因素之一。盡管如今有諸多輔助選擇技術，如時差成像技術、胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(PGT-A)等應用于囊胚的選擇，但形態學評估仍然是最主要的篩選方法。經典的Gardner囊胚評分系統根據囊胚腔的大小、內細胞團的細胞數量及形態以及滋養層細胞的數量及形態等3個方面對囊胚進行評級來篩選出具有較高種植潛能的囊胚[4-5]。然而形態學評估也存在著一定的局限性，Barrenetxea等[6]在一項前瞻性對照研究中發現，即便是移植評分完全相同的囊胚，其臨床結局也存在較大的差異。這可能是由于單純的囊胚形態學評估體系不夠完善的緣故，也許結合其卵裂胚階段的綜合評估可能更好。

囊胚移植的臨床結局與其卵裂胚階段的胚胎評估究竟有無關聯？相關的研究是基于囊胚形態和其所來源的卵裂胚評分的綜合評估。Mizobe等[7]的研究顯示，卵裂胚時期的碎片比例對其所形成的囊胚移植的臨床結局并無顯著影響，推測可能與胚胎的自我修復功能有關系。Balaban等[8]認為即便卵裂胚時期評分不佳的胚胎，如果能夠形成高質量的囊胚依然可以獲得較好的妊娠結局；Almagor等[9]研究表明，D3不規則卵裂的卵裂胚只要能夠順利發育至囊胚階段就不會影響其種植潛能和臨床結局。然而，Borini等[10]的研究認為，卵裂胚階段的胚胎評估對于其種植潛能具有決定性的預測價值。還有研究發現囊胚移植的臨床結局可能與其來源的卵裂胚的評分密切相關[11-12]。以上文獻報道表明卵裂胚階段的胚胎評估與其囊胚的臨床結局相關性存在著爭議。

眾所周知，卵裂胚的形態學評分是評估卵裂胚生長潛能的重要依據。然而在日常的ART工作中我們在囊胚的選擇上往往只注重囊胚階段的評分而忽視了之前的卵裂胚階段的評分，可能導致在ART中會出現與預期不相符合的臨床結局。本研究將我中心單囊胚移植周期的患者先按照移植囊胚的質量進行區分，再按照移植囊胚來源的卵裂胚形態學評估結果將其分成了優質卵裂胚組和非優質卵裂胚組，分別比較分析兩組的臨床結局。我們的研究結果顯示，非優質卵裂胚來源的囊胚其優質囊胚比例顯著低于優質卵裂胚來源的囊胚組，這說明7～9細胞的優質卵裂胚獲取優質囊胚的可能性明顯高于非優質卵裂胚。這與Yu等[13]的研究結果相似。本研究中，盡管不同卵裂胚來源(優質卵裂胚 vs. 非優質卵裂胚)的凍融囊胚移植的臨床妊娠率并無顯著性差異(移植優質囊胚周期：70.57% vs. 66.67%；移植非優質囊胚周期：62.50% vs. 53.77%；P均>0.05)，但優質卵裂胚來源的凍融囊胚移植組的流產率顯著低于非優質卵裂胚來源的凍融囊胚移植組(移植優質囊胚周期：12.77% vs. 26.47%；移植非優質囊胚周期：15.71% vs. 31.58%；P均>0.05)，而活產率則顯著高于后者(移植優質囊胚周期：61.56% vs. 49.02%；移植非優質囊胚周期：52.68% vs. 36.79%；P均>0.05)。這說明移植優質卵裂胚來源的凍融囊胚可以獲得較好的臨床結局，這與史三寶等[14]的研究結果相似。同時我們也注意到，鑒于非優質卵裂胚來源的凍融囊胚移植的高流產率，即便是優質卵裂胚來源的非優質凍融囊胚移植的活產率也不低于非優質卵裂胚來源的優質凍融囊胚(52.68% vs. 49.02%)。這無疑為制訂單囊胚凍融移植策略提供了新的參考，即在有非優質卵裂胚來源的優質囊胚的情況下也可以考慮移植優質卵裂胚來源的非優質囊胚。

在本研究中，優質卵裂胚來源囊胚移植的活產率顯著高于非優質卵裂胚來源囊胚移植的活產率，提示D3卵裂胚的形態學評估與其所形成的囊胚移植臨床結局密切相關。黃柳靜等[15]的研究證實，對低評分的D3卵裂胚行囊胚培養后移植所獲的活產率只有26.7%。另有研究表明，較低的胚胎形態學評分意味著該胚胎非整倍體率、染色體異常發生率和表觀遺傳學異常幾率大大增加[16-18]。盡管經歷了囊胚形成這個自然優選的過程，但其種植潛能仍然不如優質卵裂胚來源的囊胚(如7～9細胞卵裂胚來源的囊胚)。這可能是非優質卵裂胚來源囊胚移植患者的流產率顯著高于優質卵裂胚來源囊胚移植患者，進而導致其活產率顯著低于后者的合理解釋。

本研究的不足之處在于是單中心的回顧性數據分析，缺乏前瞻性的大樣本數據研究結果來支持觀點。D3卵裂胚的形態學評估對其所來源的囊胚移植臨床結局究竟有怎樣的影響尚需進一步深入的研究。

綜上所述，本研究結果表明，單囊胚凍融移植的臨床結局與其所來源D3卵裂胚的形態學評分密切相關；優質D3卵裂胚來源的凍融囊胚相對于其他來源的凍融囊胚移植具有更低的流產率和更高的活產率。優先移植優質D3卵裂胚來源的凍融囊胚能獲得更好的臨床結局。