水飛薊賓調控STAT 3信號通路對肝癌細胞增殖和侵襲的影響

王金彩，王淑雨，劉小紅，路平，李小瑞

新鄉醫學院第一附屬醫院1藥學部，3腫瘤科，河南新鄉453100

2鄭州大學醫學科學院藥理系，鄭州450001

肝癌的病死率位居全部惡性腫瘤的第2位[1]，嚴重危害人類的生命健康。目前，肝癌的主要治療手段包括手術治療和放化療，雖然取得一定效果，但仍然不滿足要求，尋找安全有效的治療方法是研究的熱點。水飛薊賓于水飛薊果實中提取，屬于黃酮木質類化合物，可保護肝細胞，且對肝組織炎癥和其他損傷具有治療作用[2]。研究表明，水飛薊賓具有抗癌作用，對卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、舌鱗癌均有抑制作用[3-6]。本研究探討水飛薊賓對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響，以期為肝癌的治療提供新思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人肝癌細胞HepG2購自中國科學院細胞庫。試劑：青霉素、鏈霉素均購自上海紫一試劑廠，水飛薊賓、胰蛋白酶、RPMI1640培養基均購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體均購自美國Stanta公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、細胞蛋白提取試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。儀器：HBS-1096A酶聯免疫檢測儀購自南京德鐵實驗設備有限公司，TS100倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養取出保存于液氮罐中的肝癌細胞HepG2，37℃融化60 s，以5 ml的細胞培養液（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基）重懸細胞，離心半徑為8 cm，1000 r/min離心10 min，吸除上清液，加入5 ml的細胞培養液懸浮細胞，接種至細胞培養瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。細胞融合度達到90%左右時，吸除細胞培養液，以0.25%的胰蛋白酶37℃消化2 min，轉移至離心管中，離心半徑為8 cm，1000 r/min離心10 min，加入適量的細胞培養液，根據實驗要求將細胞按照不同比例接種至細胞培養瓶中繼續培養。

1.2.2 噻唑藍檢測細胞的增殖能力 取對數生長期的肝癌細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為6×104/ml，以每孔100 μl的細胞懸浮液接種至96孔細胞培養板，培養過夜后，分別將細胞培養液更換為含有0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓細胞培養液，設置空白組，空白組中不加細胞，每個濃度梯度設置6個復孔。將上述細胞于CO2培養箱中培養48 h，加入5 mg/ml的噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液，20 μl/孔，37 ℃反應 4 h，吸除上清液后，加入150 μl的二甲基亞砜溶液孵育10 min。觀察結晶物完全溶解后，酶聯免疫檢測儀檢測490 nm處每孔的吸光度值（A值），以0 μmol/L的水飛薊賓作用組為對照，計算細胞存活率。細胞存活率=（水飛薊賓作用組A值－空白組A值）（/0 μmol/L水飛薊賓作用組A值－空白組A值）×100%。

1.2.3 Transwell小室檢測細胞的侵襲能力于Transwell小室中每孔加入50 μl的基質膠，37℃濕化2 h。取培養至對數生長期的肝癌細胞，分別用含0、200 μmol/L的水飛薊賓細胞培養液（不含10%胎牛血清）重懸細胞，使每毫升細胞懸浮液中含有1×105個細胞。在Transwell小室的上室加入400 μl的細胞懸浮液，下室加入600 μmol/L的含有10%胎牛血清的細胞培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，用棉簽擦掉沒有穿膜的細胞，無水乙醇固定20 min后，蘇木素染色。顯微鏡下隨機選取5個視野觀察侵襲細胞數目。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達水平肝癌細胞經0、200 μmol/L的水飛薊賓作用48 h后，按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。取蛋白樣品加入等體積的2×Loading buffer混合后，100℃煮沸5 min至蛋白變性，加入至聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠，5%濃縮膠）上樣孔中，每孔加入50 μl的變性蛋白樣品進行電泳，初始電壓80 V，觀察溴酚藍進入分離膠后，將電壓調整為120 V至溴酚藍進入分離膠底端，電泳結束。4℃、90 V將蛋白轉膜，轉膜時間為90 min，用5%脫脂奶粉37℃封閉90 min。加入一抗（500倍稀釋，4℃孵育過夜）、二抗（2000倍稀釋，37℃孵育60 min），滴加顯色液，以GAPDH為內參，分析STAT3、p-STAT3、MMP-9蛋白的表達水平。

1.2.5 STAT 3信號通路激活劑SD19對肝癌細胞存活率、侵襲細胞數目和STAT 3、p-STAT 3、MMP- 9蛋白表達的影響根據處理方法不同，將肝癌細胞分為未處理組、藥物作用組和激活劑組，其中未處理組不加入任何藥物，藥物作用組細胞培養液中加入200 μmol/L的水飛薊賓，激活劑組在藥物作用組的基礎上再加入8 μmol/L的STAT3信號通路激活劑SD19。將3組細胞培養48 h后，MTT檢測細胞存活率，Transwell小室檢測侵襲細胞數目，Western blot檢測細胞中 STAT3、p-STAT3、MMP-9蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞存活率的比較

分別采用0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓處理后的肝癌細胞，細胞存活率隨水飛薊賓濃度升高而逐漸下降，半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（198.64 ± 25.61）μmol/L。（圖1）

圖1 不同濃度水飛薊賓作用于肝癌細胞后的細胞存活率

2.2 侵襲細胞數目比較

200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細胞后侵襲細胞數目為（96.35±13.24），明顯少于0 μmol/L的水飛薊賓作用后的（192.58±13.64），差異有統計學意義（t=16.94，P＜0.01）。

2.3 STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達水平的比較

Western blot結果顯示，與 0 μmol/L 的水飛薊賓作用的肝癌細胞相比，200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細胞后，p-STAT3和MMP-9蛋白表達水平均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；而0 μmol/L與200 μmol/L的水飛薊賓作用的肝癌細胞STAT3蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖2、表1）

2.4 3組細胞存活率、侵襲細胞數目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達水平的比較

圖2 Western blot檢測肝癌細胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達情況

表1 不同濃度水飛薊賓處理后肝癌細胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達情況的比較（± s）

表1 不同濃度水飛薊賓處理后肝癌細胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達情況的比較（± s）

水飛薊賓濃度0 μ m o l/L 2 0 0 μ m o l/L t值P值3.2 5±0.2 4 0.6 8±0.0 6 1 7.9 9 0.0 0 0.9 6±0.1 1 0.3 6±0.0 4 8.8 8 0.0 0 1.3 6±0.2 3 1.4 5±0.1 7 0.5 4 0.6 1 M M P-9 p-S T A T 3 S T A T 3

3組細胞存活率、侵襲細胞數目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。藥物作用組和激活劑組的細胞存活率、侵襲細胞數目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達水平均明顯低于未處理組，且激活劑組的細胞存活率、侵襲細胞數目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達水平均明顯高于藥物作用組，差異均有統計學意義（P＜0.01），但3組肝癌細胞中STAT3蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖3、表2）

圖3 Western blot檢測 3組細胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達情況

表2 3組細胞存活率、侵襲細胞數目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達水平的比較（± s）

表2 3組細胞存活率、侵襲細胞數目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達水平的比較（± s）

注：a與未處理組比較，P＜0.01；b與藥物作用組比較，P＜0.01

指標細胞存活率（%）侵襲細胞數目S T A T 3 p-S T A T 3 M M P-9 1 0 0.0 5±1 1.2 8 1 9 8.5 4±2 0.6 6 1.1 2±0.1 3 0.8 6±0.0 9 1.1 4±0.0 8 5 6.8 4±6.9 2 a 7 9.6 9±8.2 1 a 1.1 0±0.1 4 0.2 9±0.0 3 a 0.1 5±0.0 3 a 8 0.6 7±4.9 7 ab 1 2 8.6 7±1 6.8 3 ab 1.1 3±0.1 2 0.4 5±0.0 4 ab 0.6 7±0.0 9 ab未處理組藥物作用組激活劑組

3 討論

水飛薊賓是一種黃酮類的化合物，由1分子的松柏醇和1分子的紫杉葉素構成[7]。水飛薊賓具有抗自由基、降血壓、抑制氧合酶、抑制肝纖維化、降血脂和增加心肌細胞抵抗力等多種作用[8-9]。研究表明，水飛薊賓可抑制人黑色素瘤細胞A375-S2[10]、肝癌細胞[11]、乳腺癌細胞SKBR3[12]、前列腺癌細胞PC-33[13]、卵巢癌細胞A2780[14]等多種細胞的增殖。本研究分別以0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細胞48 h后，MTT法檢測細胞的增殖能力，結果發現，隨水飛薊賓作用濃度的升高，細胞存活率呈下降趨勢。表明水飛薊賓可抑制肝癌細胞的增殖能力，且呈濃度依賴性，與之前的報道一致[10-14]，均說明其具有抗腫瘤作用。

腫瘤細胞的侵襲是腫瘤發生遠處轉移的前提條件。目前，研究發現，基質金屬蛋白酶家族與腫瘤侵襲能力相關，因需要金屬離子如鈣、鋅等的輔助才能夠發揮作用而得名，具有降解細胞外基質的作用[15]。MMP-9由9個內含子和13個外顯子組成，可維持細胞外基質平衡，其多種作用底物能夠作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅺ膠原蛋白[16]。研究表明，MMP-9在腫瘤組織中的表達異常升高，可促進腫瘤細胞侵襲[17]。本研究中以0 μmol/L、200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細胞，Transwell小室檢測侵襲細胞數目，結果發現，200 μmol/L水飛薊賓作用后的侵襲細胞數目和MMP-9表達水平均明顯降低，表明水飛薊賓可能通過抑制MMP-9的表達抑制肝癌細胞的侵襲。

STAT3是一個關鍵的信號傳導蛋白，磷酸化后可形成二聚體進入細胞核內調控靶基因的轉錄[18]。STAT3信號轉導通路與腫瘤發生有關，能夠通過調控腫瘤細胞的生長、侵襲過程，影響腫瘤的發生和發展。腫瘤組織中，STAT3信號轉導通路異常激活可促進腫瘤細胞生長，而腫瘤組織中的p-STAT3蛋白表達升高，可抑制STAT3信號轉導通路激活，從而抑制腫瘤細胞的生長[19]。研究表明，肝癌組織中p-STAT3水平升高，其惡性程度隨STAT3表達水平的降低而降低，抑制STAT3表達后，肝癌小鼠模型的腫瘤細胞生長受到抑制[20-22]。本研究首先檢測了200 μmol/L的水飛薊賓作用后的肝癌細胞中STAT3信號通路的活化水平，結果發現，200 μmol/L的水飛薊賓作用后，肝癌細胞中p-STAT3的表達水平降低。進一步用8 μmol/L的SD19和200 μmol/L的水飛薊賓共同作用于肝癌細胞，結果發現，8 μmol/L的SD19和200 μmol/L的水飛薊賓共同作用的激活劑組的細胞存活率、侵襲細胞數目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達水平均明顯高于單純水飛薊賓藥物作用組（P＜0.01）。表明STAT3信號通路激活劑能夠部分逆轉水飛薊賓對肝癌細胞的抑生長和抑侵襲作用。本研究尚存在一定的不足之處，本研究僅于體外進行了細胞實驗，后續將進一步進行體內的臨床研究。

綜上所述，水飛薊賓能夠抑制肝癌細胞增殖、侵襲，作用機制可能與抑制STAT3信號通路有關。