凋亡相關蛋白SMAC的表達與非小細胞肺癌患者臨床特征及預后的關系△

陳康，艾孜子·阿不來提，王小雷

新疆維吾爾自治區人民醫院胸外科，烏魯木齊830000

肺癌在全球具有較高的發病率，其病死率在中國居惡性腫瘤首位，非小細胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型。肺癌的發生、發展、預后與多種因素有關，但受限于患者的個體差異，即便是同一病理類型，接受相同化療方案的患者，其生存期也不盡相同。因此，尋找一種與非小細胞肺癌的發生、發展、預后密切相關的生物因子進行有效治療是十分必要的[1]。隨著人們對非小細胞肺癌發生、發展、預后等認知的加深，有學者提出細胞凋亡缺陷或受阻是腫瘤發生和發展中的一個重要因素[2]。第二個線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（second mitochondrial activator of caspase，SMAC）是近年來發現的線粒體膜間隙蛋白，該蛋白被證實具有調節細胞凋亡的功效，且在正常細胞中不會引起凋亡[3]。當細胞受到凋亡刺激時，SMAC會從線粒體中釋放到細胞質中，與凋亡抑制蛋白（inhibi-tor of apoptosis protein，IAP）結合后，通過去除IAP對半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的抑制作用，從而促進細胞凋亡[4]。本研究通過免疫組化法檢測非小細胞肺癌組織和癌周肺組織中SMAC的表達情況，旨在探討SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌臨床特征和預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月至2014年2月于新疆維吾爾自治區人民醫院手術的67例非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織標本。納入標準：①均經病理學診斷確診為非小細胞肺癌；②無其他器官和系統器質性病變；③無自身免疫性疾病或嚴重基礎性疾??；④術前未接受放療、化療及靶向治療等；⑤術后均采用統一的治療方案；⑥年齡50～70歲；⑦配合生存期等資料的收集工作。排除標準：①術前接受放療、化療或靶向治療；②合并自身免疫性疾病或嚴重的基礎疾??；③年齡＞70歲或＜50歲；④不能配合接受調查隨訪。67例非小細胞肺癌患者中，男性44例，女性23例；年齡50～70歲，中位年齡63歲；腫瘤直徑≥3 cm 43例，腫瘤直徑＜3 cm 24例；鱗癌30例，腺癌37例；TNM分期：I期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期25例，Ⅳ期22例。另外，選取本組67例非小細胞肺癌患者的癌周肺組織作為研究參照。全部標本均于10%的福爾馬林溶液固定和石蠟包埋處理。以電話查詢和復診記錄對患者進行為期3年的調查隨訪，以手術日期為隨訪起始時間，每隔6個月對患者進行1次電話隨訪，2017年2月為隨訪終止時間，本研究經醫院倫理委員會批準同意，所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

KD-2850低溫恒冷切片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，電熱恒溫箱購自杭州艾普儀器設備有限公司，電磁爐購自東莞菱戈蘭電子科技有限公司，精密電子天平購自瑞士梅特勒-托利多集團；SMAC鼠抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Biotechnology公司，通用型免疫組織化學試劑盒及顯色劑均購自基因科技（上海）有限公司，無水乙醇購自上海東羿化工有限公司，蘇木素購自天津市賽瑞達生物工程有限公司，鹽酸購自濟寧汶上縣長浩商貿有限公司，二甲苯購自青島錦鵬化工有限公司，氯化鈉購自廊坊鵬彩精細化工有限公司，磷酸氫二鈉、枸櫞酸鈉均購自南京化學試劑股份有限公司，中性樹脂購自北京益利精細化學品有限公司。

1.3 實驗方法

組織標本解凍，制成石蠟切片，厚度4 μm，進行SMAC的免疫組織化學法（Elivision）染色；60℃加熱切片4 h，之后經二甲苯脫蠟和自來水沖洗2～3 min；抗原修復：500 ml乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復液（pH=9.0）中將切片持續加熱20 min，室溫條件下自然冷卻；取出切片，分別用蒸餾水和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2～3次；3%過氧化氫去離子水中浸泡10 min，再次PBS漂洗5 min；紗布擦干標本切片，滴加SMAC鼠抗人單克隆抗體（1∶400），孵育60 min，PBS沖洗；滴加PV-9000免疫組化試劑盒中的增強劑，于28℃條件下孵育60 min，PBS沖洗；滴加PV-9000免疫組化試劑盒中二抗，孵育60 min，PBS沖洗；加入DAB顯色液，待顯微鏡下觀察著色后，用去離子水沖洗，終止染色；蘇木素染色，流水反藍15 min；乙醇脫水后，二甲苯中浸泡，自然風干；中性樹脂封片，400×高倍鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學法染色結果判定[5-6]

SMAC蛋白免疫組織化學法染色為黃色或棕黃色顆粒，表達于細胞質中。染色強度和陽性細胞所占比例由兩名病理科醫師進行綜合評定，分別在顯微鏡下選取5個高倍視野，記錄染色強度和陽性細胞所占比例。染色強度：無著色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞所占比例：無陽性細胞記為0分，陽性細胞所占比例＜1%記為1分，陽性細胞所占比例為1%～10%記為2分，陽性細胞所占比例為11%～33%記為3分，陽性細胞所占比例為34%～67%記為4分，陽性細胞所占比例為68%～100%記為5分。最終評分為陽性細胞所占比例得分與染色強度得分的總和：0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～6分為中等陽性（++），7～10分為強陽性（+++）；其中（-～++）為低表達，（+++）為高表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數據進行分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMAC表達水平的比較

肺癌組織中SMAC陽性表達50例，陽性表達率為74.6%（50/67），其中SMAC高表達18例，SMAC低表達49例；癌周肺組織中SMAC陽性表達39例，陽性表達率為58.2%（39/67）。肺癌組織中SMAC的陽性表達率高于癌周肺組織，差異有統計學意義（χ2=4.048，P=0.044）。（表1）

表1 SMAC蛋白在不同組織中的表達情況

2.2 SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、吸煙史、組織分化程度、腫瘤直徑、組織類型和腫瘤位置的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC蛋白表達情況的比較（ n=67）

2.3 生存情況的比較

對患者進行為期3年的隨訪，中位隨訪時間為18個月，隨訪結果顯示：SMAC低表達患者的中位生存期為15.6個月（95%CI：13.68～16.92），3年生存率為36.7%；SMAC高表達患者的中位生存期為13.9個月（95%CI：10.65～14.31），3年生存率為33.3%。Log-rank檢驗結果顯示，SMAC低表達與SMAC高表達患者的3年生存率比較，差異無統計學意義（χ2=0.066，P=0.797）。（圖1）

圖1 SMAC低表達（ n=49）與SMAC高表達（ n=18）患者的生存曲線

3 討論

肺癌具有極高的發病率和病死率，中國每年因肺癌死亡的人數較多且在逐年增高，目前肺癌已經成為全球范圍內亟待攻克的重點和難點問題[7]。臨床治療肺癌主要包括手術治療、化療、放療、靶向治療等方法，其中手術治療的效果最佳，但超過50%的患者在確診時已經失去了手術切除的機會?；熓茄娱L晚期肺癌患者生存時間的主要手段，但化療效果容易受腫瘤異質性和化療耐藥性的影響，使得化療效果的個體差異較大，為了避免聯合化療或大劑量化療給患者正常組織細胞造成的不必要損傷，臨床上亟需尋找新的抗腫瘤靶點，開發腫瘤特異性化療藥物。細胞凋亡調控是近年來抗腫瘤藥物研發的重點領域，細胞凋亡是指由基因控制的細胞自主性程序死亡。細胞凋亡具有維持機體發育分化和內環境穩定的重要作用。一旦細胞凋亡系統受到抑制便會引起細胞凋亡減少及細胞過度增殖，從而引起腫瘤的發生、發展[8]。SMAC是近年來發現的一種促凋亡蛋白，有研究認為SMAC蛋白是腫瘤基因治療的潛在靶點，并通過實驗證實SMAC蛋白具有增強腫瘤細胞對凋亡刺激敏感度的作用[9]。Fulda等[10]通過動物實驗發現，SMAC可明顯增加腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導的腫瘤細胞凋亡，且對正常的組織細胞不具有細胞毒作用。蔡增琰[11]研究認為，SMAC蛋白的表達水平與膠質瘤的惡性程度呈負相關，并推測SMAC蛋白的表達可能影響膠質瘤的發生、發展。趙寶峰等[12]研究發現，SMAC蛋白高表達可以提高γ射線對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制率，促進γ射線誘導的HeLa細胞的凋亡進程。因此，明確SMAC蛋白在腫瘤細胞中的特異性表達，可能有助于推進未來腫瘤基因診斷和治療的研究進程。

SMAC是目前發現的存在于哺乳動物細胞內的可以直接抑制IAP的一種蛋白，其在人類睪丸中的表達水平最高，在肺部、腦部、胸腺中的表達水平較低[13]。SMAC基因由7個外顯子組成，位于12號染色體長臂，轉錄后形成的SMAC蛋白共有184個氨基酸[14]。SMAC蛋白根據自身形態可以分為單體和二聚體，其中單體SMAC蛋白不具有促凋亡作用，二聚體SMAC又稱野生型SMAC，位于線粒體膜間隙內，具有調節損傷細胞凋亡的功效。研究認為，SMAC的促凋亡機制與caspase分子有關，caspase在激活機體內細胞凋亡通路中起著核心作用，二聚體SMAC蛋白在細胞凋亡的早期可通過消除IAP家族成員對caspase 3、caspase 7、caspase 9的抑制，激活Procaspase和caspase的酶活性，引起caspase 3、caspase 7和caspase 9相繼被激活并發生caspase的級聯放大效應，從而起到促凋亡作用[15-16]。

本研究采用免疫組織化學法檢測非小細胞肺癌患者肺癌組織和癌周肺組織標本中的SMAC表達情況，并分析其表達水平與非小細胞肺癌患者臨床特征和預后的關系。結果發現，肺癌組織中SMAC的陽性表達率高于癌周肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SMAC蛋白在肺癌組織中的表達水平高于癌周肺組織，SMAC陽性可用于非小細胞肺癌的輔助診斷；本研究結果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者（P＜0.05），但不同年齡、性別、吸煙史、組織分化程度、腫瘤直徑、組織類型和腫瘤位置非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。上述結果提示SMAC可能對非小細胞肺癌的發展起到促進作用。本研究結果看似有悖于常規的促凋亡理論，因為理論上SMAC高表達被認為是能促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤進展的，然而腫瘤惡性程度不斷發展的過程中，其壞死組織也在不斷增加，因此可以推測在非小細胞肺癌惡性程度逐漸增高的過程中，細胞凋亡活性可能會隨著細胞增殖活性的增強而增強。本研究對SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌患者預后關系的分析結果顯示，SMAC蛋白低表達患者的3年生存率與SMAC蛋白高表達患者比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示SMAC不能作為非小細胞肺癌患者預后的獨立影響因素。葉聞遠等[17]同樣在報道中指出，SMAC與非小細胞肺癌患者的預后無關。但因本研究中采用免疫組織化學法檢測SMAC蛋白的表達水平，易受多種因素干擾，可能影響結果的準確性。同時，本研究樣本量較少，后續研究中應擴大樣本量，平衡各因素，完善研究方案。

綜上所述，SMAC在肺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期和無淋巴結轉移的患者，因此進一步研究其在肺癌患者體內的表達規律變化可在一定程度上反映肺癌的發展情況，同時可作為肺癌的輔助診斷手段；但SMAC在肺癌發生、發展中發揮的生理作用及其機制有待進一步研究，以期開辟腫瘤治療的新途徑。