雙氧水處理對紅棗果渣酶解效果的影響及其結構分析

裴亞利，張寶善*，韋露莎，王敏，朱莉莉，周琦，付軍偉

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710062) 2(陜西省果蔬深加工工程技術研究中心，陜西 西安，710119)

中國是世界上最大的紅棗生產國和出口國[1]，2015年紅棗產量已達900萬t，占世界總產量的95%以上[1-2]，傳統的紅棗加工業主要以干制產品為主。近年來，隨著對紅棗資源的研究與開發，市場出現了多種多樣的紅棗果汁、果酒和發酵類飲品[3-4]，在這些產品加工中，會產生大量果渣、果泥等廢棄物。以紅棗提取果汁為例，果渣約占原料的50%以上[5-6]，這些副產物部分加工為低價飼料或直接丟棄，技術手段落后，產品附加值低，造成資源嚴重浪費和環境污染[6-7]。因紅棗果渣中較高含量的纖維類物質[8]，有學者研究用其制備膳食纖維[9]，但極少投入在實際生產實踐中。近年來越來越多的學者研究開發利用生物質資源，紅棗果渣和木本生物質結構相似，可通過預處理技術提高生物酶水解效率[10-12]，制備發酵糖單體，進而發酵生產有機酸等高附加值產品。因此，選擇適宜的紅棗果渣預處理技術，提高紅棗果渣酶解后還原糖含量對于紅棗果渣的再利用至關重要。

據國內外研究報道，木質纖維素結構中的木質素是阻礙纖維素酶與底物接觸的最大因素[13-14]，極大地影響酶解效果。研究表明，在酶解過程中使用堿性雙氧水可破壞木質素結構，增加底物與生物酶的結合，顯著提升酶解糖得率[12-15]。但是，有關用堿性雙氧水處理紅棗果渣的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以紅棗汁加工過程中的廢棄物紅棗果渣為材料，進行堿性雙氧水預處理，研究其對果渣酶解影響規律，結合電鏡觀察、紅外光譜掃描及X-射線雙晶衍射分析，優化預處理工藝參數，揭示雙氧水預處理對果渣微觀結構的作用機制，以期為紅棗資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

紅棗果渣：棗汁生產中廢棄的棗渣(還原糖含量低于1%)，50 ℃烘干后，過40目篩，4 ℃保存備用。

化學試劑：30%雙氧水(H2O2)、檸檬酸、檸檬酸鈉、KBr、NaOH等分析純試劑，購于西安晶博生物科技有限公司；纖維素酶、木聚糖酶，購于諾維信生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Quanta 200環境掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI有限公司；Tensor27傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克有限公司；粉末X-射線衍射儀，德國布魯克有限公司；UNICO2000型可見光分光光度計，上海儀器有限公司；Anke TGL-16G 飛鴿離心機，上海安亭科學儀器廠；水浴鍋，上海?，攲嶒炘O備有限公司；PL203分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合酶水解試驗

紅棗果渣酶解條件：搖床轉速150 r/min，溫度50 ℃，時間48 h，纖維素酶用量10 FPU/g(果渣質量)，木聚糖酶用量150 IU/g(果渣質量)。反應結束后煮沸5 min，使酶失活。

1.3.2 單因素試驗和響應面試驗設計

使用6 mol/L NaOH調節雙氧水pH至11.5。紅棗果渣與調好pH的堿性雙氧水溶液按固液比(1∶20)混合再在靜置條件下進行預處理。在預試驗的基礎上，選取影響雙氧水預處理單因素試驗的因素為：溫度、時間和雙氧水用量，考察單因素變化對紅棗果渣中木質素去除率和酶解后還原糖含量的影響規律。單因素試驗設計如下：

(1)溫度：預處理時間為180 min，雙氧水用量為4%，溫度分別設定為20、30、40、50、60、70 ℃。

(2)時間：預處理溫度為50 ℃，雙氧水用量為4%，處理時間分別設定為60、120、180、240、300 min。

(3)雙氧水用量(體積分數)：預處理溫度為50 ℃， 時間為180 min，H2O2用量分別設定為1%、2%、3%、4%、5%、6%。

依據上述單因素試驗，選取適宜的溫度(A)、時間(B)和雙氧水用量(C)范圍，以還原糖含量為觀察指標，根據Box-Behnken中心組合設計原理，設計3因素3水平的響應面分析試驗，確定最佳預處理工藝，因素水平編碼表如表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Experimental factors and coding levels in response surface design

1.4 測定方法

1.4.1 木質素含量測定

參考文獻[16]的方法測定木質素含量。

1.4.2 還原糖含量測定

參考文獻[17]。準確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、 1.4、1.6和1.8 mL葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)于25 mL刻度試管中，補蒸餾水至2 mL，加入1.5 mL 3 ,5-二硝基水楊酸試劑(DNS：3,5-Dinitrosalicylic acid)，混合均勻，沸水浴5 min，冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5 mL蒸餾水，充分搖勻，540 nm測吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標制作標準曲線，并得回歸方程：y=0.685 8x-0.079 6，R2=0.997。 取果渣酶解液10 mL，5 000 r/min離心10 min，DNS比色法測定樣品還原糖含量。

1.4.3 掃描電子顯微鏡分析

參照文獻[4]，采用掃描電子顯微鏡分析紅棗果渣預處理前后的形態學變化，利用離子濺射的方法在紅棗果渣樣品表面鍍1層鉑金，在20 kV的加速電壓下運行。

1.4.4 紅外光譜分析

參考文獻[18]。取1 mg紅棗果渣粉末，加入質量大約為樣品 100 倍的 KBr 粉末(100 mg)，在紅外燈照射下研磨粉碎，加入壓模器制成具有一定厚度的透明薄片；薄片置于紅外光譜儀中掃描，波長范圍4 000～500 cm-1，掃描次數 16 次，掃描分辨率2 cm-1。

1.4.5 粉末X射線分析

取少量樣品磨細加入樣品槽，壓實樣品表面使其附著在槽內不脫落；測試條件：加載電壓 30 kV，步寬0.02°，掃描速率 4°/min，掃描角度 5°～60°。采用Jade軟件對圖譜進行分縫、擬合并計算雙氧水處理前后紅棗果渣的結晶度。

1.5 統計分析

單因素試驗采用SPSS 20.0軟件進行結果分析，使用Origin8.5繪制相關圖形；響應面試驗數據采用Design-expert.v10.01.1軟件處理，測定指標均做3次重復，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 預處理單因素試驗結果分析

2.1.1 預處理溫度對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響

預處理溫度對紅棗果渣中木質素去除率和酶解后還原糖含量的影響見圖1。

圖1 預處理溫度對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.1 The influence of pretreatment temperature on the lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis

由圖1可以看出，預處理溫度由20 ℃增加到50 ℃ 時，木質素的去除率顯著增加(P<0.05)，提高了27.59%；而溫度從50 ℃升到70 ℃過程中木質素去除率趨于穩定無顯著增加(P>0.05)。隨著溫度的升高，50 ℃時樣品的木質素去除率達58.82%。20 ℃時樣品酶解后還原糖含量為14.59%，溫度由20 ℃上升到50 ℃的過程中其含量顯著增加(P<0.05)，在50 ℃時可達18.18%；而50～70 ℃時無顯著性變化(P>0.05)。隨樣品中木質素去除率增加，其酶解還原糖含量隨之增加，這可能是由于木質素的降解增大了生物酶與底物的接觸面積和幾率，這與尤毅娜等[15]的研究相一致；而木質素去除率受溫度影響較大，這是由于在一定的水解條件下，溫度升高會加快雙氧水的分解速率，產生過氧離子的速率加快，進而增強木質素的降解作用，使其去除率增加[19-20]。因此，預處理溫度變化范圍可確定為40～60 ℃，進行后續響應面優化試驗。

2.1.2 預處理時間對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響

預處理時間對紅棗果渣木質素去除率和酶解還原糖含量的影響，見圖2。

圖2 預處理時間對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.2 The influence of pretreatment time of lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis

由圖2可知，紅棗果渣木質素去除率隨著時間的延長先增大后降低，隨著時間的增加(60～180 min)木質素去除率顯著增加(P<0.05)，在180 min時可得最佳去除率，達到66.82%；在180～300 min，木質素去除率降低(P<0.05)。這可能是由于開始堿性較強，促使雙氧水分解成過氧離子和超氧自由基，氧化木質素，隨著溶液堿性的減弱，從而導致木質素降解率降低[20-21]。預處理后樣品酶解還原糖含量隨時間呈先顯著增加后降低的趨勢(P<0.05)，其中時間為180 min時酶解還原糖含量達到最高20.05%。因此，時間對預處理效果顯著影響的范圍可確定為 120～240 min。

2.1.3 雙氧水用量對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響

雙氧水用量分別設定1%、2%、3%、4%、5%、6%，紅棗果渣木質素的去除率變化如圖3。

圖3 雙氧水用量對木質素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.3 The influence of H2O2 on the lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis

由圖3可知，紅棗果渣在溫度50 ℃，保溫180 min 時，木質素的去除率隨著雙氧水用量的增加呈先增加后保持穩定的趨勢。雙氧水用量在1%～4%時，隨著雙氧水用量增加，木質素的氧化作用加強，去除率顯著增加(P<0.05)，增加了18.16%；而用量在4%～6%時，木質素的去除率無顯著變化(P>0.05)。雙氧水用量由1%上升至4%，樣品酶解后還原糖含量由14.92%升高至18.75%，隨后在4%～6%時還原糖含量無顯著增加(P>0.05)。為此，雙氧水用量的水平值范圍可確定為3%～5%。

2.2 響應面法優化紅棗果渣預處理工藝

為了優化預處理工藝，在單因素試驗結果的基礎上，選取適宜的預處理溫度、時間和雙氧水用量范圍[22]。響應面試驗設計與結果見表2。利用還原糖含量數據進行多元回歸擬合，建立的二次回歸模型為：Y=20.63+1.32A+1.16B+0.39C+1.89AB-0.067AC-0.72BC-1.75A2-2.97B2-2.75C2。由表3的回歸模型方差分析可知，該模型達到極顯著水平(P<0.01)，失擬項P=0.101 5>0.05，具有不顯著性，說明該方程擬合度較高。相關系數R2=0.989 5，可較好地反映雙氧水預處理溫度、時間及用量與酶解還原糖含量之間的關系。對各項F值檢驗可知，各因素中一次項溫度、時間、雙氧水用量，二次項溫度、時間、雙氧水用量均為顯著影響因素，而溫度和時間、時間和雙氧水用量的交互作用對試驗結果也有顯著影響。由表中P值可知，各因素對紅棗果渣酶解后還原糖含量的影響程度從強到弱依次為：溫度>時間>雙氧水用量。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

注：*代表P<0.05，表示有顯著影響；**代表P<0.01，表示有極顯著影響。

根據Box-Behnken試驗設計和響應面分析得出，預處理溫度55.83 ℃、時間202.8 min，雙氧水用量4.01%時，紅棗果渣酶解后還原糖含量預測為21.24%。在實際操作中稍作調整，最終確定的最佳工藝為：預處理溫度56 ℃、時間200 min，雙氧水用量4%，在此條件下進行3組重復試驗得到還原糖含量為21.16%，此結果與理論預測接近。故該模型可以用于本工藝的實際推測。相比于未處理紅棗果渣14.28%的還原糖含量，雙氧水預處理效果顯著，酶解后還原糖含量顯著增加。

2.3 結構分析

2.3.1 超微結構分析

掃描電鏡圖像分別在1 000倍、1 500倍和2 000倍條件下拍攝，結果如圖4所示。

A-未處理樣品；B-處理后樣品；1-放大倍數1 000；2-放大倍數1 500；3-放大倍數2 000圖4 紅棗果渣的掃描電鏡圖像Fig.4 SEM images of Ziziphus jujube residues

與未處理組(A組)相比，雙氧水處理(B組)對紅棗果渣表面結構影響顯著。未經處理的紅棗果渣表面結構完整，而經雙氧水處理后的果渣呈現不規則的疏松多孔結構，纖維外表面積明顯增大[15]。1 000倍電鏡照片下觀察到處理后的紅棗果渣纖維顆粒度降低，稍大的纖維顆粒蓬松度增加；1 500倍和2 000倍電鏡下還可以觀察到雙氧水預處理后的紅棗果渣顆粒表面有明顯的裂痕，斷層現象纖維表面呈寬松而粗糙狀[23-24]。說明通過雙氧水預處理，紅棗果渣顆粒表面結構發生明顯變化，原致密結構變得多孔蓬松，生物酶接觸纖維素的表面積顯著增大，同時有研究表明提高原料的空隙性能顯著提高酶解效率[13]。

2.3.2 傅里葉紅外分析

采用波長范圍在4 000～500 cm-1的紅外光譜掃描紅棗果渣，分析雙氧水處理前后其成分變化。如圖5所示，處理前后紅棗果渣的紅外光譜呈現出纖維類多糖特征吸收峰，其中纖維素、半纖維素和木質素等主要化學物質的條帶發生明顯變化。

圖5 處理前后紅棗果渣的傅里葉紅外分析Fig.5 FTIR analysis of before and after treatment Ziziphus jujube residues注：A-未處理，B-處理后，下圖同。

未處理的紅棗果渣(圖5-A)在3 414.03 cm-1處有很強的O—H伸縮振動，在2 924.47、2 855.93 cm-1處有強烈的C—H伸縮振動。雙氧水處理后的紅棗果渣(圖5-B)中可以觀察到相同的伸縮特征，O—H和C—H的伸縮振動分別在3 443.40 cm-1和2 924.47/2 865.72 cm-1處，說明處理前后樣品中都含有氫鍵和飽和烴[15]。而2 924.47 cm-1處的透過率可以反映樣品結晶度[25]，紅棗果渣經過雙氧水處理后在該處透過率增大，這說明處理后的紅棗果渣纖維結晶度有所降低。從圖中可以看出雙氧水處理前后的紅棗果渣分別在1 729.93 cm-1處有一個小吸收峰，這是木聚糖C=O伸縮振動引起的，是半纖維素的特征吸收峰[26]。在木質素存在的雙鍵振動區[27]，未處理紅棗果渣于1 632.02、1 524.32和1 445.99 cm-1處有明顯的吸收峰，而雙氧水處理后的樣品僅在1 543.90 cm-1處有微弱的吸收峰且該區域透過率明顯增加，所以可以確定處理后樣品中木質素含量有所降低。

2.3.3 X-射線衍射表征

處理前后的樣品進行X-射線衍射掃描檢測，得到明顯的002峰位置變化及衍射強度變化。紅棗果渣原樣與預處理后的射線衍射峰相比變化不大，從圖6可以看出，101、002和040峰衍射角分別為15.78°，21.69°和34.88°，這是典型的纖維素I的特征[28]。未處理的紅棗果渣對應的曲線A峰形尖銳程度較大，根據Jade分峰、擬合計算得到結晶度為20.82%；而雙氧水處理后的紅棗果渣曲線B的結晶度為13.63%， 降低了7.19%。最佳預處理條件下，紅棗果渣結晶度的降低可以有效地提高酶解效率，是由于預處理過程中纖維素結晶區溶脹程度增加，空隙變大，結晶度降低[20]，這與掃描電鏡和傅里葉紅外光譜掃描結果分析相一致。

圖6 處理前后紅棗果渣結晶指數分析Fig.6 Crystallization index analysis of before and after treatment Ziziphus jujube residues

3 討論

3.1 雙氧水處理對紅棗果渣酶解效果的影響

紅棗果渣致密復雜的空間結構，在利用時合理有效的預處理方法[29]，可提高酶解后可發酵糖得率。ZHOU等[30]利用稀酸化學試劑預處理原料，但由于試劑腐蝕性高、污染性大很難用于實踐。本研究結果表明，雙氧水處理過程中的反應溫度、時間及雙氧水用量對紅棗果渣中木質素去除率影響顯著，這與尤毅娜等[15]利用雙氧水處理蘋果渣結果相吻合。在最優預處理條件下，紅棗果渣酶解后還原糖含量相比未處理組顯著提高。鄭英等[20]研究雙氧水處理木薯渣，酶解液中還原糖溶出率可達85.02%。雙氧水技術預處理紅棗果渣，過程操作簡單，反應迅速且對裝置設備要求低[12]，具有一定工業應用價值。

3.2 雙氧水處理對紅棗果渣結構的影響

試驗探索了雙氧水處理前后紅棗果渣的結構變化以及酶解效果提高的原因。掃描電鏡可直接清晰呈現樣品表面的微觀結構，在較高的放大倍數下進行組織形貌的觀察[31]。本試驗直觀了解到雙氧水可破壞果渣微觀結構，增大生物酶與底物的接觸面積。依據物質的紅外光譜圖，可對其分子結構及組分進行定性定量的分析[32]。雙氧水預處理紅棗果渣后，特征官能團和化學鍵的吸收峰位置發生明顯改變，木質素的官能團吸收區極大減弱，有效地解釋了酶解后還原糖含量提高的原因。分析X-射線衍射圖譜，可以獲得物質內部的結晶狀態[33]。本研究結果表明，經雙氧水處理后果渣結晶度減小，纖維素結晶區被破壞，而非結晶區的木質素含量降低，生物酶的可及性提高。

4 結論

采用單因素和響應面試驗對堿性雙氧水預處理紅棗果渣的工藝進行優化，得到最優預處理條件為處理溫度56 ℃，時間200 min，雙氧水用量4%。此預處理條件下酶解紅棗果渣得還原糖含量顯著增加，達到21.16%。掃描電子顯微鏡圖像、紅外光譜及X-射線衍射圖譜結果表明，堿性雙氧水預處理顯著改變紅棗果渣物理結構及化學組分，使其表面呈粗糙疏松狀，木質素含量降低，結晶度減小。因此，將堿性雙氧水預處理技術應用于紅棗果渣酶解過程中，為今后提高果渣酶解糖得率，提高紅棗資源的利用價值等研究提供了理論依據。