血清microRNA-224-3p在結直腸癌中的表達及臨床研究*

朱 瑩，王亞南

(1.蘇州市立醫院檢驗科，江蘇蘇州 215000；2.蘇州市第九人民醫院病理科，江蘇蘇州 215000；3.南京醫科大學附屬蘇州醫院檢驗科，江蘇蘇州 215002)

結直腸癌在世界范圍內的發病率一直處于增高狀態，過去幾年的研究數據顯示，結直腸癌的發病率在我國也一直居高不下[1]，是威脅全世界人民身體健康和生命安全的惡性腫瘤之一。我國人民生活水平的提高、飲食結構的改變、環境的惡化等原因使得結直腸癌的發病率逐年上升。由于研究者不停地對分子生物學進行深入研究，新近發現了許多microRNA(miRNA)與多種腫瘤性疾病的發生、發展、病情惡化有密切的關系。miRNA是一類小的、非編碼的、內源性RNA片段(18～24個氨基酸的長度)，通過調節基因表達參與多種細胞內過程，在進化程度上高度保守，廣泛存在于動植物中。miRNA可直接靶向mRNA，1個miRNA可調控多個mRNA，相對的，1個mRNA也可被多個miRNA調控。miRNA的作用機制為成熟的單鏈miRNA可通過堿基互補配對的方式與靶基因的mRNA的3′UTR端結合，若二者可以完全互補時，miRNA可將mRNA互補區特異性降解從而改變基因的表達，若二者不可以完全互補時，miRNA可通過與靶基因的mRNA3′UTR堿基互補配對，來阻止mRNA轉錄后翻譯過程[2]，進而影響基因調控的表達，這二者的機制也可以相互融合，當完全互補時，直接切割掉mRNA，影響其表達。自1993年LEE等[3]在分析秀麗隱線蟲的遺傳學信息時發現第一個miRNA，并將其命名為Lin-4開始，截至2013年6月，已先后發現30 424個成熟的miRNAs(數據來源于miRBASE20版，截止時間為2013年6月)。而在人類基因組中已發現約1 000個miRNAs[4]。查閱文獻可知，miRNAs與結直腸癌的發生、發展密切相關[5]，在文獻中初步得知，miR-224-3p的表達量與結直腸癌的發生、發展有關[6]，本實驗就miR-224-3p的表達通過熒光定量PCR(SYBR Green法)來檢測，并研究其表達量與結直腸癌的臨床病理關系。

1 材料與方法

1.1材料 選擇蘇州市立醫院本部結直腸癌患者的住院血清標本共50例，其中男性標本29例，女性標本21例，臨床病理資料見表1。健康人血清標本44例(健康對照組)，來源為蘇州市立醫院本部體檢健康者的標本。本研究通過蘇州市立醫院醫學倫理委員會的批準，患者簽定知情同意書。采血容器是一次性真空采血管，保證使用統一的采血方法采集樣本，在結直腸癌患者手術前空腹抽取5 mL靜脈血，體檢健康者也空腹抽取5 mL靜脈血，將抽取的血清10 000 r/min離心處理10 min，移取上清液至另一新的離心管中，在-80 ℃下存儲。組織標本離體后在10 min 內放在液氮罐內快速冷凍后置-80 ℃凍存。

1.2診斷、納入和排除標準 診斷標準：所有患者依據腫瘤病理診斷規范(結直腸癌)[7]，經2名主治以上的病理科醫生診斷為結直腸癌。納入標準：(1)均按照WHO病理分期對其進行病理學檢查后確定為結腸癌的患者，其臨床病理分期采用TNM分期；(2)患者之前均未進行手術及放射性治療；(3)本研究通過醫院醫學倫理委員會的批準，患者簽定知情同意書；(4)臨床病理參數及隨訪資料完整的患者。排除標準：(1)術后病理提示良性腫瘤的患者；(2)結直腸有潰瘍或結直腸炎患者；(3)有其他惡性腫瘤病史的患者；(4)臨床病理資料缺失以及失訪者。

1.3儀器與試劑 本實驗所采用的主要試劑為Trizol試劑、總RNA提取試劑、RNase Free ddH2O、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量PCR(SYBR Green)檢測試劑盒，均購自天根公司，下游引物是由miR-cute miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒配套的，miR-224-3p上游引物的目錄號為CD201-0306，miR-16上游引物的目錄號為CD-0235，均購自天根公司。本實驗所采用的儀器PCR System7500擴增儀購自美國ABI公司，Eppendorf高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，超低溫冰箱及生物安全柜均購自上海瑞仰公司。

表1 結直腸癌患者的臨床病理資料

1.4標本總RNA的提取 取30 mg組織樣本加入1 mL Trizol(天根公司),進行勻漿處理,按說明書中的操作步驟提取RNA。血清250.0 μL加入Trizol 750.0 μL并放在震蕩儀上混勻，再按照說明書的操作步驟提取RNA。選用總RNA吸光度(A260/280nm)比值在1.8～2.2的標本。

1.5miRNA 3′末端加Poly(A)處理和逆轉錄反應 根據天根公司提供的 miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書對miRNA 3′末端進行Poly(A)加尾處理。反應的總體系共20.0 μL，各組分成分分別為Total RAN 2.0 μL、E.coli Poly(A) Polymerase(5 U/μL)0.4 μL、10×Polymerase buffer 2.0 μL、5×rATP Solution 4.0 μL、RNase-Free ddH2O 11.6 μL。輕輕混勻后，進行短暫離心，在37 ℃反應60 min。再根據天根公司提供的說明書對加尾處理后的miRNA進行逆轉錄反應。反應總體積為20.0 μL，各組組成成分分別為Poly(A)反應液2.0 μL、10×RT Primer 2.0 μL、10×RT Buffer 2.0 μL、Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)1.0 μL、RNasin(40 U/μL)1.0 μL、Quant RTase 0.5 μL、RNase-Free ddH2O 11.5 μL，輕搖使之混合后，進行短時間的離心，在37 ℃的條件下反應60 min，隨后將合成的cDNA反應液保存于-20 ℃的條件下。

1.6熒光定量PCR 按照miRcute miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒的說明書進行miRcute miRNA熒光定量PCR檢測試劑的配制，反應總體系一共20.0 μL，各組分分別為2×miRcute miRNA Premix(含SYBR，含ROX)10.0 μL、Forward Primer 0.4 μL(10 μmol/L)、Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL、miRNA第一鏈cDNA 2.0 μL、50×ROX Reference Dye 2.0 μL、ddH2O 5.2 μL，在PCR System7500擴增儀上進行循環擴增，擴增的循環參數為94 ℃預變性2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共43個循環。擴增結束后，將每個反應管中標本的熒光信道達到閾值時所對應的循環數(Ct值)記錄下列，用miR-16作為內參物[8]。通過歸一化處理目標基因，以確保樣品量與目標基因量的一致性。其結果采用2-ΔΔCt法[9]進行計算分析。用25 g/L瓊脂糖凝膠對10.0 μL擴增產物進行電泳，觀察電泳效果并拍攝結果。

2 結 果

2.1溶解曲線 miR-16和miR-224-3p的溶解曲線均為尖銳的單峰，出現峰值的溫度分為78.05 ℃和77.91 ℃。此結果說明該引物具有特異性，數據可用。

2.2電泳圖 組織和血清中的miR-16和miR-224-3p經PCR擴增儀擴增后的產物在2.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，結果均見到清晰的電泳條帶，表示擴增有結果。miR-16作為內參分子，其相對分子質量大小為79 bp，miR-224-3p的相對分子質量大小為80 bp，大小符合，見圖1、2。

2.3miR-16的PCR擴增結果 健康對照組血清miR-16的Ct值為30.32±0.66，結直腸癌組miR-16的Ct值為29.83±0.59，符合正態分布，miR-16在兩組中穩定表達，可作為定量檢測miRNA的內參基因。

注：1表示miR-224-3p陰性對照，2～7表示miR-224-3p，8表示miR-16陰性對照，9～14 表示miR-16

圖1組織中miR-16和miR-224-3p的電泳圖

注：1表示miR-224-3p 陰性對照，2～7表示miR-224-3p，8～13 表示miR-16，14 表示miR-16陰性對照

圖2血清中miR-16和miR-224-3p電泳圖

2.4血清miR-224-3p的相對表達量 健康對照組中血清miR-224-3p的Ct值為37.19±0.97，結直腸癌組中血清miR-224-3p的Ct值為32.97±0.68，血清miR-224-3p在結直腸癌組中的相對表達量確實增長。對其結果采用2-ΔΔCt法進行計算分析，用[M(P25～P75)]來表達血清miR-224-3p的相對表達水平，進行非參數Wilcoxcon秩和檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)，血清miR-224-3p在結直腸癌組和健康對照組中的表達有差異。見表2、圖3。

表2 血清miR-224-3p在健康對照組和結直腸癌組中相對表達量的比較[M(P25～P75)]

圖3 血清miR-224-3p在健康對照組和結直腸癌中

2.5血清miR-224-3p的相對表達水平與結直腸癌患者各臨床病理學的關系 血清miR-224-3p的相對表達水平在結直腸癌患者的性別、年齡、腫塊大小、淋巴結是否轉移、TNM分期、癌癥的分化程度中，差異無統計學意義(P>0.05)，即血清miR-224-3p的相對表達水平與結直腸癌患者的性別、年齡、腫塊大小、淋巴結是否轉移、TNM分期、癌癥的分化程度沒有關系。而在不同預后情況以及與癌胚抗原表達水平中，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-224-3p的相對表達水平與各臨床病理學的關系[M(P25～P75)]

3 討 論

癌胚抗原檢測、糞便隱血試驗在臨床上廣泛用于消化道腫瘤的診斷，但其存在靈敏度低、易受其他非特異性疾病影響等缺點，其檢測靈敏度和特異度均低。而結直腸鏡檢測雖然是結直腸癌檢測的金標準，但患者承受的痛苦大，普遍接受度低，難以廣泛開展，血清檢測miRNA是一種新型的非侵入篩查試驗，對于檢測結直腸癌具有顯著意義[10]。有大量研究表明，抑癌基因的抑制和癌基因的激活對結直腸癌的發生、發展有密切關系，而血清miR-224-3p在結直腸癌患者中所扮演的角色是充當癌基因的作用，能促進結直腸癌的發生、發展[11]。查閱文獻可知，高表達的miR-224通過抑制PHLPP1和PHLPP2來促進細胞的增殖和腫瘤的生長[12]。miR-224可以與PHLPP1和PHLPP2基因的mRNA的3′UTR結合，從而抑制PHLPP1和PHLPP2基因的表達，由于高表達的PHLPP1和PHLPP2對miR-224介導的磷酸化的AKT和FOXO3a通路可產生抑制，同時阻止miR-224對細胞周期調控因子P21、P27以及細胞周期蛋白D1的調控[13-14]，因此,miR-224抑制了PHLPP1和PHLPP2基因的表達，調控細胞周期，使細胞發生癌變。Maspin基因在腫瘤轉移中起抑制作用，但miR-224可以抑制Maspin基因來促進腫瘤細胞的轉移[13]。miR-224也可以通過促進KRAS基因[14]、抑制SMAD4基因[15]來促進腫瘤細胞的生長。因此,miR-224可促進腫瘤細胞的生長、發育、繁殖和轉移。

本實驗采用熒光定量PCR檢測蘇州市立醫院本部結直腸癌患者的住院血清標本共50例，健康者血清共44例，研究發現血清miR-224-3p的相對表達水平在健康對照組和結直腸癌組差異有統計學意義(P<0.05)，在結直腸癌血清中的表達水平約為健康對照組的2倍，提示miR-224-3p在結直腸癌患者的血清中呈高表達，這與LI等[16]報道相符。miR-224-3p在結直腸癌患者的表達水平高于健康對照組，提示今后可通過檢測血清miR-224-3p的表達水平對結直腸癌患者進行輔助診斷。

對結直腸癌患者的具體病理參數進行進一步分析發現，miR-224-3p在結直腸癌患者中的表達水平與性別、年齡、腫塊大小、淋巴結是否轉移、TNM分期和分化程度均無關，與患者癌胚抗原水平有關。本實驗中發現，在不同的癌胚抗原水平組中，血清miR-224-3p的表達水平有差異(P<0.05)，患者癌胚抗原水平高，其血清miR-224-3p的表達水平也高，所以，可將miR-224-3p和癌胚抗原聯合檢測，彌補癌胚抗原檢測時的缺陷，以提高診斷的準確性。miR-224-3p有望成為評估結直腸癌的重要指標。

本實驗研究還發現，血清miR-224-3p在不同預后組中的表達有顯著性差異(P<0.05)，miR-224-3p在預后好的相對表達水平是預后差的2倍多，但是查閱文獻均得知miR-224-3p相當于癌基因的作用[6]，其表達上調[17]，與本實驗在不同預后組中表達水平相反，推測原因可能是預后差的結直腸癌患者血清中有干擾miR-224-3p活性的物質。因此，在下一步課題研究中，筆者將進一步擴大樣本量，探討miR-224-3p在結直腸癌患者預后判斷中的作用。在本研究中并未涉及miR-224-3p的調控機制，在之后的實驗中有待更深入的研究。

4 結 論

本研究發現，血清miR-224-3p在結直腸癌患者的血清中呈高表達，可用于結直腸癌患者的輔助診斷，減少患者篩查結直腸癌的痛苦，與癌胚抗原聯合檢測，可彌補癌胚抗原篩查結直腸癌時的靈敏度低和特異度低的缺陷，以提高診斷結直腸癌的準確性。同時，血清miR-224-3p可用于結直腸癌患者的預后判斷。